膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム
2020年7月16日
ここで提示される電子顕微鏡法と組み合わせてネイティブ細胞膜ナノ粒子系を利用する膜蛋白質のオリゴマー状態の決定のためのプロトコルです。
このプロトコルは、電子顕微鏡法と組み合わせて天然の細胞膜ナノ粒子システムを利用することにより、研究者が膜タンパク質の天然オリゴマー状態をより正確に決定するのに役立ちます。この手法の利点は、天然の細胞膜様環境における膜タンパク質の正確な構造データを提供できることであり、将来の高分解能構造決定に活用できる点です。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドク研究員であるKyle Kroeckです。
天然細胞膜ナノ粒子を調製するには、目的の膜ペレットの1グラムを10ミリリットルのNCMNバッファーAに再懸濁します。ガラス製ホモジナイザーを使用して、再懸濁した細胞膜サンプルを摂氏20度で均質化し、懸濁したサンプルを50ミリリットルのポリプロピレンチューブに移します。メンブレン活性ポリマーストック溶液と追加のNCMNバッファーAをサンプルに加え、最終濃度が2.5%のメンブレン活性ポリマーになるまで、溶液を摂氏20度で2時間振とうします。インキュベーションの最後に、サンプルを超遠心分離します。
遠心分離中に、遠心分離の最後に 5 ミリリットルのニッケル NTA カラムを 25 ミリリットルの NCMN A.At バッファーと平衡化し、上清をカラムに移し、毎分 0.5 ミリリットルの流量に設定されたシリンジポンプを使用して、上清を摂氏 20 度でカラムにロードします。高速タンパク質液体クロマトグラフィーマシンラインを十分な量の NCMN バッファー B で洗浄し、システムを完全に洗い流し、カラムをクロマトグラフィーマシンに接続します。30 ミリリットルの NCMN バッファー B でカラムを 1 m/分 1 ミリリットルの流量で洗浄し、フロースルーを回収します。
カラムを 30 ミリリットルの NCMN バッファー C で 1 ミリリットル/分の流量で洗浄し、フロースルーを回収します。20 mLのNCMN Buffer Dで0.5 mL/分の流量でタンパク質を溶出し、フラクションコレクターで1 mLのサンプルを採取した後、SDS-PAGEでタンパク質サンプルを摂氏4度で保存し、高速タンパク質液体クロマトグラフィー溶出グラフで観察されたピークに対応するサンプルを確認します。ネガティブステイングリッドを調製するには、カーボン面を上にしてスライドガラスを濾紙で包み、サンプル調製に使用するグリッドをスライド上に置きます。
電子顕微鏡グリッド付きのスライドガラスを、2つの電極の間のグローディスチャージャーのチャンバーに配置し、ガラス蓋を交換して、蓋が中央に配置され、しっかりと密閉されていることを確認します。グロー放電機を運転し、プラズマによって生成された紫色の光が見えることを確認します。機械の運転が終了したら、チャンバーが大気圧に達するまで待ってから、ガラス蓋を取り外し、スライドをベンチに置きます。
精製したタンパク質サンプルの濃度を1ミリリットルあたり約0.1ミリグラムに調整し、厚さ10ナノメートルのカーボングリッドに3.5マイクロリットルのタンパク質サンプルをロードします。1分後、濾紙を使用して電子顕微鏡グリッド表面から液体を取り除き、グリッド表面を1回の洗浄につき3マイクロリットルの水滴1滴で3回洗浄します。最後の水洗浄後、グリッド表面を3マイクロリットルの新鮮なろ過された2%酢酸ウラン液滴でさらに2回洗浄します。
最後の酢酸ウラン洗浄後、ろ過した新鮮な2%酢酸ウランの3マイクロリットルの液滴でグリッドを1分間染色します。インキュベーションの最後に、新しい濾紙を使用して液滴を取り除き、グリッドを少なくとも1分間風乾してから、グリッドをグリッドボックスに保管して後で使用できます。ここでは、示されているように透過型電子顕微鏡を用いて得られたネガティブ染色画像を観察することができます。
界面活性剤で精製した野生型アクラフラビン耐性チャネルタンパク質Bサンプルのネガティブ染色画像は、単分散粒子の均質な溶液を示し、タンパク質は明確に定義された三量体四次構造を示しています。これらの三量体構造は、精製後に観察されたサイズ排除クロマトグラムに対応しています。これに対し、同じく界面活性剤で精製したP223G変異体のネガティブ染色像では、凝集傾向はあるが観察可能な天然三量体は観察できない多分散ナノ粒子の不均一溶液が観察できます。
これらの結果は、サイズ排除クロマトグラフィーによっても裏付けられています。野生型タンパク質および変異タンパク質についても、膜活性ポリマー NCMNP11による精製後の同様の結果が観察されました。NCMNP52ポリマーの使用により、はるかに大きなサイズの天然細胞膜ナノ粒子の生成が容易になり、単一の天然細胞膜粒子で複数のアクラフラビン耐性チャネルタンパク質B三量体をイメージングできます。
しかし、変異体サンプルでは、大きな天然細胞膜二重層パッチを見ても、三量体粒子は観察されません。精製されたタンパク質サンプルのSDS-PAGE分析により、タンパク質の予測分子量で95%を超える純度のすべてのサンプルにアクラフラビン耐性Bが存在することが確認されます。このプロトコールを他のタンパク質に改変する場合、適切な膜画分の量と、可溶化プロセスの長さ、時間、温度を実験的に決定することが重要です。
サンプルの画像から、明確に定義された構造単位を持つ単分散粒子の均質な溶液が明らかになった場合、そのサンプルはクライオ電子顕微鏡による高分解能構造決定に使用できます。
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概要
このプロトコルは、電子顕微鏡と併用してネイティブの細胞膜ナノ粒子システムを利用することで、膜タンパク質のネイティブオリゴマー状態をより正確に決定するのに役立ちます。この技術は、ネイティブの細胞膜様環境における膜タンパク質の正確な構造データを提供します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生化学
- 構造生物学
背景
- 膜タンパク質のオリゴマー状態を理解することは、その機能を解明する上で重要です。
- 従来の方法では、これらのタンパク質のネイティブ環境を正確に反映しない可能性があります。
- 電子顕微鏡は高解像度の画像化能力を提供します。
- ネイティブの細胞膜ナノ粒子は、膜タンパク質の研究にもっと現実的な文脈を提供します。
研究目的
- 膜タンパク質のオリゴマー状態を決定するための信頼性の高いプロトコルを確立すること。
- 構造分析にネイティブの細胞膜ナノ粒子を利用すること。
- 膜タンパク質から得られる構造データの精度を向上させること。
使用した方法
- 膜ペレットからのネイティブの細胞膜ナノ粒子の調製。
- ガラスドーンジホモジナイザーを用いた細胞膜サンプルの均質化。
- ナノ粒子を分離するための超遠心分離。
- 膜タンパク質構造の可視化のための電子顕微鏡。
主要な結果
- ネイティブの細胞膜ナノ粒子の成功的な調製。
- 膜タンパク質のオリゴマー状態の正確な決定。
- 電子顕微鏡によって得られた高解像度の画像。
- 将来の高解像度構造決定の可能性。
結論
- このプロトコルは、膜タンパク質を研究するための堅牢な方法を提供します。
- ネイティブ環境の利用により、構造データの精度が向上します。
- 将来の応用には、様々な膜タンパク質の詳細な構造分析が含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate determination of membrane protein oligomeric states is critical for target validation in drug discovery, as misinterpretation can lead to failed mechanistic hypotheses. The native cell membrane nanoparticle system preserves native lipid bilayer context, reducing artefactual dissociation or denaturation seen in detergent-based methods. This enables more reliable structural data for de-risking early-stage targets and informing lead identification strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by resolving native oligomeric states of membrane protein targets like AcrB.
- Operational Value: Provides structural clarity in a native-like environment, reducing false negatives in target validation assays.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by confirming functional quaternary structures prior to downstream investment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates stable, monodisperse nanoparticles suitable for reproducible biophysical assays.
- Operational Value: Enables standardization of membrane protein preparations across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates preparation of large bilayer patches for imaging multiple protein complexes per particle.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage structural insights with preclinical validation by maintaining native membrane context.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from native oligomeric states rather than detergent-induced artifacts.
- Biomarker Alignment: Supports target engagement studies where oligomeric state correlates with functional output.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing structural inputs that inform hit-to-lead progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing native quaternary arrangements of membrane protein complexes.
- Screening: Delivers assay-ready, homogeneous protein nanoparticles for consistent compound screening.
- Analytics: Enables quantitative assessment of oligomeric state via electron microscopy and size exclusion chromatography.
- Translational Research: Ensures structural findings are translatable to native physiology, improving predictive confidence.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for membrane protein structural analysis across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target mechanism by preserving native protein-lipid interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and reduces variability in structural data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in early targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in membrane protein isolation and nanoparticle formation.
- Depends on access to ultracentrifugation, FPLC, and electron microscopy instrumentation.
- Necessitates standardization of buffer conditions and polymer concentrations across teams.
- Involves optimization of solubilization time, temperature, and membrane fraction for each target.
- Limited by the need for empirical determination of solubilization parameters per membrane source.
