Name: 膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学ぶネイティブ細胞膜ナノ粒子システムを用いた膜タンパク質のオリゴマー状態解析法。電子顕微鏡と組み合わせることで、生細胞膜に近い環境で正確な構造データを取得し、高分解能構造決定に応用可能です。

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この研究は、VCUスタートアップファンド(Y.G.へ)と国立衛生研究所の国立総合医学研究所が賞番号R01GM132329(Y.G.に)によって支援されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。モンセラート・サムソとケビン・マクロバーツがビデオ録画を惜しんでサポートしてくれたことに感謝します。

1. タンパク質発現
<ol><li>BL21(DE3)PLysS細胞を含むプラスミドを含む素晴らしいブロス(TB)培地を15mLで37°Cで一晩で37°Cで250rpmで振盪させた。</li>
	<li>600 nm (OD600)での一晩培養の光学濃度を確認し、2.0 を超えるようにしてください。</li>
	<li>プラスミドに特異的な抗生物質を含む結核培地の1Lに5mLの細胞培養を希釈し、OD600=0.8まで振盪して37°Cでインキュベートし、最終的な濃度が1mMのIPTGで誘導する。</li>
	<li>20°Cで20時間振る回して誘導を行います。</li>
	<li>4°Cおよび4,000 x gで15分間の遠心分離を使用して細胞を下にペレット.</li>
</ol>2. 細胞のリシスと膜の分離
<ol><li>バッファーA内の細胞ペレットを再懸濁(表1、DDM バッファAまたはNCMNsバッファAに従う精製スキームに応じて)を用いて、細胞ペレットの20gごとに80 mLを使用する。</li>
	<li>ガラスDounceホモジナイザーを4°Cで使用するか、室温であれば、再懸濁セルペレットを均質化し、すぐに氷の上に置いてください。</li>
	<li>サンプルを氷の上の金属ビーカーに移し、4°Cおよび1,500棒で高圧ホモジナイザーにセットして細胞を溶解させる。<ol>
<li>ホモジナイザーに細胞をロードし、ホモジナイザーを通過させて3〜4サイクル、またはリセートが明確になるまで通過させるプロセスを繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4°Cで30分間15,000xgでリセートを遠心分離する。</li>
	<li>上清を収集し、4 °Cで1時間215,000 x g で超遠心チューブと遠心分離機に負荷を入れ.</li>
	<li>上清を捨てて、超遠心チューブから膜ペレットを収集します。過剰な膜ペレットを-80°Cで保存します。</li>
</ol>3. 天然細胞膜ナノ粒子の調製
<ol><li>10 mL NCMNsバッファA中の膜ペレット1gを再懸濁する(表1)。</li>
	<li>再懸濁した細胞膜試料をガラスDounceホモジナイザーを20°Cで均質化する。</li>
	<li>懸濁膜試料を50 mLポリプロピレンチューブに移し、膜活性ポリマーストック溶液および追加のNCMNsバッファAを加えて、最終濃度2.5%(w/v)膜活性ポリマー(NCMNP1-1またはNCMNP5-2)にサンプルを持ち込みます。 注:膜活性ポリマーのストック溶液は、二重蒸留水で作られ、様々な濃度で保つことができますが、通常は10%(w/v)です。</li>
	<li>試料を20°Cで2時間振る。</li>
	<li>サンプルを超遠心分離機にロードし、20°Cで1時間150,000 x g で回転させます。</li>
	<li>サンプルが超遠分化されている間にNCMNsバッファAの25 mLと5 mL Ni-NTAカラムを平衡化し始める。</li>
	<li>超遠心分離が完了した後に上清を収集し、シリンジポンプを使用して0.5 mL /minの流量で室温でNi-NTAカラムの5mLにロードします。</li>
	<li>高速タンパク質液体クロマトグラフィー (FPLC) ラインを十分な NCMNs バッファ B (表 1)で洗浄し、システムを完全にフラッシュしてから、カラムを FPLC マシンに接続します。</li>
	<li>30 mLのNCMNsバッファBで1mL/minの流量でカラムを洗浄し、流れを通して集めます。</li>
	<li>30 mLのNCMNsバッファC(表1)で流量1 mL/minでカラムを洗い、流れを通して集めます。</li>
	<li>20 mL の NCMNs バッファ D (表 1)を流量 0.5 mL/min で溶出し、分画コレクタと画分をそれぞれ 1.0 mL に設定してサンプルを収集します。</li>
	<li>タンパク質サンプルを4°Cに保存してください。</li>
	<li>FPLC溶出グラフで観測されたピークに対応するサンプルを確認するために、SDS-PAGEゲル電気泳動アッセイを実行します。</li>
</ol>4. SDS-ページゲル電気泳動
<ol><li>ガラスを鋳造装置にクランプして鋳造室を準備します。</li>
	<li>表1に示したレシピに従って12%分離ゲルを調製する。 注:TEMEDが追加されると、ゲルはすぐに重合するので、ゲルを注ぐ準備ができたらこれを追加するだけです。</li>
	<li>ゲルを注ぎ、櫛の底から2cm下に2cm残して、スタッキングジェルを出します。</li>
	<li>ゲルの上部に100%イソプロパノールを重ねて気泡を取り除き、分離ゲルが重合するのを待ちます。</li>
	<li>イソプロパノールを取り除き、蒸留水でイソプロパノールの痕跡を洗い流します。</li>
	<li>表 1に示したレシピに従って、スタックゲルを準備します。 注:TEMEDが追加されると、ゲルはすぐに重合するので、ゲルを注ぐ準備ができたらこれを追加するだけです。</li>
	<li>分離ゲルの上に積み重ねゲルを注ぎます。</li>
	<li>ウェルを形成するために部屋に櫛を追加し、積層ゲルが完全に重合するのを待ちます。</li>
	<li>ゲル上で実行する必要がある各画分サンプルのマイクロ遠心分離チューブに1 M DTTの1 μLを入れる。</li>
	<li>各チューブに4x負荷バッファの7 μLを追加します。</li>
	<li>ゲル上で実行する必要のある分数から各マイクロ遠心チューブに20 μLのサンプルを加えます。</li>
	<li>サンプルを含むチューブを渦出します。</li>
	<li>3 sの卓上マイクロ遠心分離機を使用してサンプルチューブをスピンダウンし、すべてのサンプルがチューブの底に戻っていることを確認してください。</li>
	<li>ゲル電気泳動セルを調製するために、12%ポリアクリルアミドゲルカセットを所定の位置に固定し、細胞の内側および外側のチャンバーをトリス-酢酸EDTA(TAE)バッファで満たします(表1)。</li>
	<li>指示に必要な適切な体積で、ゲルの最初のレーンに分子量マーカーをロードします。</li>
	<li>DTTと負荷バッファを混合した各チューブからサンプルの28 μLをロードします。</li>
	<li>電気泳動セルの蓋を箱の上に置き、蓋を電源に差し込みます。</li>
	<li>電源を入れ、100 Vに設定し、20分間稼働します。</li>
	<li>20分後、電源電流を140Vに上げ、さらに30〜40分間、またはローディングバッファ色のバンドがゲルカセットの底に達するまでそれを実行し続けます。</li>
	<li>電気泳動染色を完了した後、ゲルを脱染色して、ゲル内に含まれるタンパク質バンドを可視化する。</li>
</ol>5. DDMを用いたタンパク質精製
注:この精製プロセスを実施する目的は、膜活性ポリマーを利用した実験の制御として機能することです。
<ol><li>6〜10gの膜ペレットを再懸濁し、ステップ2.6から、5mL/gの膜ペレットを用いてDDMバッファA(表1)に入れる。</li>
	<li>再懸濁試料をガラスDounceホモジナイザーを4°Cで均質化するか、室温であれば、すぐに氷の上に置いてください。</li>
	<li>サンプルをポリプロピレンチューブ50 mLに移し、DDMとDDMバッファAを追加して、サンプルを2%DDMの最終濃度にします。</li>
	<li>サンプルを4°Cで2時間振ります。</li>
	<li>4 °Cおよび150,000 x gで1時間超遠心チューブと遠心分離機にサンプルをロードします。</li>
	<li>試料が超遠心状態にある間、25mLのDDMバッファAで洗浄してNi-NTAカラムの5mLを調製し始める(表1)。</li>
	<li>超遠心分離が完了したら、上清を集め、シリンジポンプを使用して0.5 mL/minの流量で4°Cの5 mL Ni-NTAカラムに積み込みます。</li>
	<li>十分な DDM バッファ B + 0.05% DDM (表 1) で FPLC ラインを洗浄し、システムを完全にフラッシュしてから、FPLC マシンにカラムを取り付けます。</li>
	<li>30 mLのDDMバッファB + 0.05%DDMで、流量1 mL/minで洗浄し、流れを通して集めます。</li>
	<li>30 mLのDDMバッファC + 0.05%DDM(表1)の流量を1 mL/minで洗浄し、流れを通して集めます。</li>
	<li>20 mL の DDM バッファー D + 0.05% DDM (表 1) の流量 0.5 mL/min でタンパク質を溶出し、分画コレクタと各画分を使用して流れを 1.0 mL に設定して流れを収集します。</li>
	<li>500 μLに達するまで4,000 x g および4°Cで遠心濃縮器と遠心を使用して、プールおよび濃縮のための溶出ピークを含む分数を選択します。</li>
	<li>500 μL ループを使用して、サンプルを FPLC マシンにロードし、4 °C の 25 mL サイズの除外カラムに積み込みます。 30 mL の DDM バッファ E + 0.05% DDM (表 1) を流速 0.5 mL/min で使用し、分数サイズが 1 分あたり 0.5 mL に設定された分数として収集します。</li>
	<li>画分を取り、FPLC溶出グラフからUV-Vis曲線を確認するために280 nmの吸光度を使用してタンパク質濃度を測定する。</li>
	<li>FPLC溶出グラフで観測されたピークに対応する各サンプル画分から20μLを収集し、吸光度試験で正確であることが確認されました。</li>
	<li>必要なアリコートで液体窒素またはドライアイスを使用してこれらのサンプル画分の残りを凍結し、-80°Cでタンパク質サンプルを保存します。</li>
	<li>前述のとおり、SDS-PAGEゲル電気泳動アッセイを実行して、FPLC溶出グラフで観測されたピークに対応するサンプルを確認します。</li>
</ol>6. 陰性染色グリッドの準備
<ol><li>サンプル調製に使用するグリッドを、フィルターペーパーで包んだガラススライドに、カーボン側を上に向けて配置します。</li>
	<li>電子顕微鏡グリッドを備えたガラススライドを2つの電極間のグロー放電器のチャンバーに入れ、ガラス蓋を交換して、中央に収まり、密閉されていることを確認します。</li>
	<li>グロー放電機を実行し、プラズマによって生成された紫色の光が見えるようにします。</li>
	<li>機械の走行が終わったら、チャンバーが大気圧に達するまで待ってガラス蓋を取り外し、サンプルが積み込まれるベンチにグリッド付きのスライドを戻します。</li>
	<li>適切なバッファーでサンプルを希釈するか、遠心濃縮器を使用して濃縮することにより、精製されたタンパク質サンプルの濃度を約 0.1 mg/mL に調整します。</li>
	<li>3.5 μLのタンパク質サンプルを10 nm厚いカーボングリッドに積み込み、1分待ちます。</li>
	<li>フィルターペーパーでEMグリッドの表面から液体を取り除きます。</li>
	<li>グリッドで3μLの水滴を拾い、各滴を拾う間にフィルターペーパーでグリッドから水を取り除くことによって、グリッド表面3倍を洗浄します。</li>
	<li>3 μLの新鮮な、ろ過された2%の酢酸ウランの液滴を拾ってグリッド表面2xを洗浄し、各滴を拾う間にフィルターペーパーでグリッド上の洗浄液を取り除きます。</li>
	<li>3 μLの新鮮な、濾過された2%酢酸ウランの1分間のグリッドを染色します。</li>
	<li>EMグリッドの表面にある酢酸ウラン溶液を濾紙で取り除き、空気乾燥してグリッドを少なくとも1分間乾燥させます。</li>
	<li>後で使用するためにグリッド ボックスにグリッドを格納します。</li>
</ol>7. EMイメージング
<ol><li>準備したグリッドを安全なワークベンチのグリッドホルダーに積み込みます。</li>
	<li>顕微鏡をポリスチレンボックスに入れ、液体窒素の3/4を満たして顕微鏡を準備します。</li>
	<li>顕微鏡窓のゴムカバーが覆っていることを確認し、プラットフォームに収まるまで銅線をデュワーに入れて顕微鏡にロードします。</li>
	<li>残りの残りの部分を液体窒素で満たし、それをカバーするためにデュワーの上にキャップを置きます。</li>
	<li>ハイテンションをオンにし、顕微鏡を調整し、顕微鏡がウォームアップし、使用するための安全な真空レベルを確立するのを待ちます。</li>
	<li>顕微鏡が準備ができたら、カラムバルブを開き、顕微鏡ウィンドウのゴムカバーを取り外してビームが存在することを確認します。</li>
	<li>ビームの強度を調整して、広がってビームの汚名を確認します。乱視が存在する場合、ビームはクロスオーバーから離れて移動し、ビームは両側で同じ楕円形でなければならないので、楕円形になります。</li>
	<li>顕微鏡双眼鏡を、観察者の目に合わせて正しい高さと距離に調整します。</li>
	<li>3 つのモードすべてを循環して、ビームの位置を 検索、 フォーカス、 および露出 モードで確認します。</li>
	<li>カラムバルブを閉じて、グリッドホルダーを電子顕微鏡にロードします。</li>
	<li>顕微鏡のウォブラー特徴を使用し、中央にサンプルの左右の動きがなくなるまでZ軸を使用してステージの動きを調整することにより、マイクロスコープをユーセントリックな高さに調整します。</li>
	<li>顕微鏡上の低用量 検索 モードを使用して、サンプルに焦点を当てるために存在するサンプル分子との妥当な対比の望ましい領域をグリッドを検索します。</li>
	<li>サンプルが見えるまで高いステップサイズを使用して 、フォーカス モードでサンプルに焦点を当て、次にステップを減らすことで正しいフォーカスレベルを見つけます。</li>
	<li>ゼロとビームをブランクし、ゴムパッドが顕微鏡の窓を覆っていることを確認してください。</li>
	<li>露出モードを使用して、62,000x倍率で1s露光のために目的のグリッド領域の画像を取り、取得した画像を確認します。</li>
	<li>グリッドのイメージングが完了したら、列バルブを閉じ、グリッドホルダを列から取り外します。</li>
	<li>目的のすべてのグリッドのイメージングが終了すると、フィラメント電源をオフにして、顕微鏡から液体窒素デュワーを除去することによって、顕微鏡をシャットダウンします。</li>
	<li>顕微鏡の銅コイルから結露をキャッチするために、デュワーが座ったスタンドに水分を吸収するために何かを置きます。</li>
	<li>クライオサイクルモードを有効にして、ターボポンプがオフになっていることを確認します。</li>
</ol>

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<li>Hall, S. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+acid-compatible+co-polymer+for+the+solubilization+of+membranes+and+proteins+into+lipid+bilayer-containing+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles.</a> Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).</li>
<li>Oluwole, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+of+Membrane+Proteins+into+Functional+Lipid-Bilayer+Nanodiscs+Using+a+Diisobutylene%2FMaleic+Acid+Copolymer%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+England%22%5BJournal%5D)">Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).</li>
</ol>

Y.Gは、膜活性ポリマーNCMNP5-2およびNCMN系の発明者としてリストされている。

タンパク質とタンパク質の相互作用は、膜タンパク質の構造と機能の完全性にとって重要です。タンパク質とタンパク質の相互作用を調べるアプローチが数多く開発されています。可溶性タンパク質と比較すると、膜タンパク質およびそのPPIは、膜タンパク質の固有の本質的な特性のために研究することがより困難です。この難しさは、主に構造安定性と機能性のためのネイティブ脂質二重層環境に埋め込まれる膜タンパク質の要件から来ています.タンパク質の高解像度構造を決定するためには細胞膜から抽出する必要があるため、これは問題になります。FRETは細胞膜上のタンパク質とタンパク質相互作用を調べる一般的な技術であったが、解像度は低く、しばしば偽陽性17、18、19、20を産生する。ここでは、天然細胞膜上の野生型AcrBトリマーとAcrB-P223Gモノマーを構造的に分析し、FRETを用いた以前の分析結果と比較することで、N...

タンパク質相互作用(PPI)は、タンパク質の構造と機能の維持からシステム全体の調節に至る生物学全体で重要な役割を果たします。PPI はさまざまな形式で提供され、どのような種類の相互作用を形成するかに基づいて分類できます。そのような分類の1つは、同一のサブユニットまたはサブユニットとして作用する異なるタンパク質間の相互作用であるかどうかに基づくホモオリゴメリックまたはヘテロオリゴメリックである。別の分類は、相互作用が安定した複合体または過渡的な複雑な状態の形成につながる場合の相互作用の強さに基づいています。タンパク質間のPPIに関する構造情報は、タンパク質が機能するメカニズムを理解する上で非常に重要です。タンパク質の80%以上が、その機能的役割を果たすために複雑な形成に依存していると推定されている。生物学におけるその重要性を適切に機能させるためにPPIに依存することが観察されたタンパク質の割合を考えると、容易に明らかであるが、タンパク質がPPIを形成しているときに実験的に観察できる技術の限界のために、これらの相互作用に関与するタンパク質を適切に調査できることは依然として困難である。
ノイズ、偽陽性、および偽陰性の高い量が現在利用可能なPPI決定技術の多くから導き出されるため、多くの実験的に決定されたPPIの結果の間には、高い意見の相違があります。これは特に酵母ツーハイブリッド(Y2H)系では、タンデムアフィニティー精製質量分析(TAP-MS)、蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)、PPI測定2、3、4、5、6、7に最も一般的に使用される方法の3つを表す。それに比べて、核磁気共鳴(NMR)、X線結晶学、電子顕微鏡(EM)などのタンパク質構造生物学技術を用いて、タンパク質とタンパク質の相互作用に関する高解像構造情報を原子レベルまで得ることができ、目的のタンパク質に対して発生する相互作用の直接的な視覚的確認を可能にする。現在利用可能な非構造ベースPPI決定研究技術(例えば、Y2H、TAP-MS、およびFRET)の全てがこの能力を欠き、さらにタンパク質間の弱い相互作用および一過性相互作用を同定するのが困難に苦しむ5。これらの欠点は、適切な第四級構造およびヘテロマー錯体集合体の形成に影響を与える脂質環境の追加変数によってもたらされる複雑性の増大に起因する膜タンパク質を研究する際にさらに強化される。
膜タンパク質はプロテオームの大部分を占めており、すべての生物の中で適切な細胞機能において多くの重要な役割を果たすことが知られています。膜タンパク質はヒトゲノムの27%を占め、現在の薬物標的の60%程度を占めると推定されているにもかかわらず、全ての公表タンパク質構造の約2.2%を占める膜タンパク質の解剖モデルの数に大きな異常がある。構造情報の入手可能性の不一致の主な原因は、膜タンパク質自体の本質的な特性にあります。溶解性が悪く、天然の構造や機能を維持するための脂質環境との相互作用に依存し、脂質膜自体の様々な物理化学的特性を研究する際に、膜タンパク質は大きな問題を引き続き表しています。これらの固有特性の中で、正確な構造情報を得るために最も重要なのは、天然の脂質環境との相互作用を持つことで、天然の構造と機能を維持する必要があります。脂質環境は膜蛋白質の構造や機能の一部としてこのような不可欠な部分であり、膜蛋白質の構造と機能11の基本単位としてメムテイン(膜とタンパク質との組み合わせ)の概念が提案されている。脂質とタンパク質の相互作用の重要性にもかかわらず、現在利用可能な構造ベースのPPI決定技術は、多くの場合、研究されているタンパク質が溶解しているか、洗剤で可溶化されている必要があります。過酷な洗剤への暴露は、タンパク質を変性させたり、脂質異常による偽陽性および陰性を引き起こし、凝集、タンパク質の変性、非共有結合相互作用の解離、人工オリゴマー状態の形成を誘発する可能性があります。膜蛋白質のネイティブオリゴマー状態を正確に決定するために自然な脂質環境を維持する必要性のために、我々は、以前に報告されたスチレンマレイン酸脂質粒子(SMALP)13法に基づいてネイティブ細胞膜ナノ粒子システム(NCMNs)12を開発した。 
SMALPは、膜活性ポリマーとしてスチレンマレイン酸共重合体を使用して、膜タンパク質を抽出し、可溶化します。ポリ(スチレン-コマレイン酸)(SMA)は、その疎水性スチレン部分と正反対の親水性マレイン酸部分に起因するユニークな両親媒性ポリマーです。pH依存機構14に吸着し、不安定化し、細胞膜を破壊することによってナノ粒子を形成する。SMAのこの機能活性は、膜タンパク質抽出および可溶化のための洗浄剤フリーシステムとして利用することを可能にするものである。NCMNシステムは、いくつかの側面でSMALPシステムとは異なります。NCMNシステムの最もユニークな特徴は、安定性とネイティブ機能のために異なる条件を必要とする多くの異なる膜タンパク質の単離に適したユニークな特性を有する多数のポリマーを有する膜活性ポリマーライブラリーを有することである。NCMNシステムは、ナノ粒子の調製に関しては、SMALP法と比較して異なるプロトコルを有する。そのような例の1つは、NCMNsが高分解能構造の決定のために単一ステップニッケル親和性カラム精製を使用することです。これらの異なるプロトコルの効果は、3.2および3.0 Å cryo-EM AcrB構造を生成したNCMNsプロトコルを比較する際に、SMALP法を用いた同様の研究を行い、8.8Å解像度12,15でクライオEMAcrB構造を生じさせた。NCMNシステムのこれらのユニークな特徴は、以前に確立されたSMALP法で行われた改善であり、PPIの研究のための理想的な候補になります。
多剤流出トランスポーターAcrBは、大腸菌12において機能的なホモトリマーとして存在する。変異原性分析は、AcrBトリマーの安定性を担うループ上に位置する単一のP223G点突然変異が、三量体状態を不安定化させ、天然の青いゲル電気泳動16で検出できる洗剤DDMで調製するとAcrBモノマーを生じさせることを示唆した。しかし、AcrB-P223G変異体のFRET分析は、天然細胞膜脂質二重層環境において、変異型AcrB-P223Gの大部分が依然として三量体として存在し、野生型AcrBおよびAcrB-P223Gの両方の発現レベルが類似していることを示唆した。しかしFRET分析結果にもかかわらず、変異型トランスポーターの活性アッセイは、野生型16と比較すると活性が劇的に低下することを示した。FRET技術はタンパク質とタンパク質相互作用の分析に広く使用されてきたが、研究は、しばしば偽陽性17、18、19、20を与えることができることを示している。
最近、AcrBトリマーの高解像度クライオEM構造は、NCMNs12の使用を通じてAcrBと関連する天然細胞膜脂質二重層との相互作用を示す決定された。原則として、NCMNsは、天然細胞膜に見られるタンパク質とタンパク質の相互作用の分析に容易に利用することができます。本システムの試験では、天然細胞膜ナノ粒子と陰性染色電子顕微鏡を用いてAcrB-P223Gのオリゴマー状態を直接観察する実験を行った。野生型AcrBナノ粒子と比較するために、NCMNライブラリー12に見られるAcrBおよび代替ポリマーの高解像度クライオEM構造決定に用いられている同じ膜活性ポリマー(NCMNライブラリでNCMNP1-1としてインデックス化された研究室製のSMA2000)を用いた。先に報告された結果に基づいて、AcrB-P223G変異体の大部分が三量体天然細胞膜ナノ粒子21の形で存在することが期待された。しかし、野生型AcrBで観察されたものなど、サンプルにはAcrB三分子は見つからなかった。これは、AcrB-P223Gの大部分が、以前に示唆されたように、ネイティブ細胞膜に三量子を形成しないことを示唆している。
ここでは、NCMを用いた野生型 大腸菌 AcrBとの比較における変異型 大腸 菌AcrB-P223Gの詳細な分析を報告する。AcrBのこのケーススタディは、NCMNがタンパク質とタンパク質相互作用分析に適したシステムであることを示唆しています。

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% アクリルアミド/BIS SOL (37.5:1)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid Glacial</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38S-212</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>Goldbio</td><td>C-105-5</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 タンパク質染色粉末</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol) (>純度 99%) プロテアーゼフリー</td><td>Goldbio</td><td>DTT10</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Affymetrix</td><td>17525 1 KG</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Goldbio</td><td>I2481C100</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Goldbio</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AA3622636</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)</td><td>Merck</td><td>8.03779.0100</td><td></td></tr><tr><td>NCMNS-P5-2</td><td>まだ市販されていません</td> 責任<td>著者</td><td></td>に取得リクエストを提出し</tr>ます <tr><td>プレシジョンプラスプロテイン デュアルカラースタンダード</td><td>バイオラッド</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)</td><td>バイオラッド</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>SMA2000</td><td>クレイバレー</td> 取得<td>リクエストを責任著者</td><td></td>に提出します</tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Goldbio</td><td>TCEP25</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth Media</td><td>Affymetrix</td><td>75856 1 KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0719</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td>Ambinter</td><td>Amb22348393</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI</td><td>ベックマン・コールター</td><td>B14538</td><td></td></tr><tr><td>アバンティ JXN-30</td><td>ベックマン・コールター</td><td>B34193</td><td></td></tr><tr><td>カーボン電子顕微鏡グリッド (10 nm)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>CF300-Cu-TH</td><td></td></tr><tr><td>コントルク組織ホモジナイザー</td><td>エーベルバッハ</td><td>E7265</td><td></td></tr><tr><td>コーニング LSE ミニ微量遠心機</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>07-203-954</td><td></td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C3</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フラクションコレクター F9-R</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29003875</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 分光光度計</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>オプティマ L-90K 超遠心分離</td>機 <td>ベックマン・コールター</td><td>PN LL-IM-12AB</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easiGlow グロー放電洗浄システム</td><td>テッド・ペラ</td><td>91000S-230</td><td></td></tr><tr><td>ポッター・エルヴェジェム セーフ・グラインド・ティッシュ・グラインダー</td><td>ウィートン</td><td>・358013</td><td></td></tr><tr><td>パワーパック ベーシック電源</td><td>バイオ・ラッド</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>Razel R99-E 可変速シリンジポンプ</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai F20 200kV</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>General Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td><td>ThermoFisherサイエンティフィック</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>4 ml アミコン ウルトラ-4 30 kDa</td><td>ミリポア シグ</td><td>マ UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>AKTA pure 25 L1 FPLC</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>29018225</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS 細胞</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>C606003</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 50 ml コニカル遠心チューブ</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP 5mlカラム</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>17524802</td><td></td></tr><tr><td>pET-24aEMD</td><td>バイオサイエンス</td><td>69749-3</td><td></td></tr></tbody></table>

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

細胞膜系におけるタンパク質間相互作用は、細胞間相互作用からシグナル伝達まで、幅広い生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。環境信号のセンシングから生物学的応答まで代謝調節から発達制御へ。タンパク質相互作用の正確な構造情報は、膜タンパク質複合体の分子機構を理解し、これらのタンパク質を調節する非常に特異的な分子の設計に不可欠です。インビボおよびインビトロアプローチの多くは、タンパク質とタンパク質相互作用の検出と分析のために開発されています。その中でも構造生物学のアプローチは、原子レベルでタンパク質とタンパク質相互作用の直接的な構造情報を提供できる点でユニークです。しかし、現在の膜タンパク質構造生物学は、依然として洗剤ベースの方法に限られています。洗剤ベースの方法の主な欠点は、彼らのネイティブ脂質二重層環境が洗剤分子によって除去されると、しばしば膜タンパク質複合体を解別または変性させることです。膜蛋白質構造生物学のネイティブ細胞膜ナノ粒子系を開発しています。ここでは、AcrBのオリゴマー状態のケーススタディを用いて細胞膜上でのタンパク質相互作用の解析におけるこのシステムの使用を実証する。

ここで提示した手順を用いて、 大腸菌 AcrB野生型および 大腸菌 変異体AcrB-P223Gのサンプルを精製した。次いで、試料を、カーボンネガティブ染色電子顕微鏡グリッドに吸着し、ウラニル酢酸を使用して、サイドブロッティング法22で染色した。負の染色画像は透過型電子顕微鏡を用いて収集した。DDMで精製されたAcrB野生型試料の陰性染色像は、明確に定義された三量体四晶構造を示すタンパク質を有する単分散粒子の均質な溶液を明らかにする(図1A)。これらの三量体構造は、精製時の観察サイズ排除クロマトグラムに対応する(補足図1)。これに対して、AcrB-P223G変異体の陰性染色像を見ると、DDMで精製しても、凝集に向かう傾向を持つ多分散ナノ粒子の不均一な溶液を観察することができるが、観察可能なネイティブ三量体はない(図1B)。これらの結果は、サイズ排除クロマトグラフィーを実施する際に観察された溶出プロファイル...

ここで提示される電子顕微鏡法と組み合わせてネイティブ細胞膜ナノ粒子系を利用する膜蛋白質のオリゴマー状態の決定のためのプロトコルです。

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

このプロトコルは、電子顕微鏡法と組み合わせて天然の細胞膜ナノ粒子システムを利用することにより、研究者が膜タンパク質の天然オリゴマー状態をより正確に決定するのに役立ちます。この手法の利点は、天然の細胞膜様環境における膜タンパク質の正確な構造データを提供できることであり、将来の高分解能構造決定に活用できる点です。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドク研究員であるKyle Kroeckです。天然細胞膜ナノ粒子を調製するには、目的の膜ペレットの1グラムを10ミリリットルのNCMNバッファーAに再懸濁します。ガラス製ホモジナイザーを使用して、再懸濁した細胞膜サンプルを摂氏20度で均質化し、懸濁したサンプルを50ミリリットルのポリプロピレンチューブに移します。メンブレン活性ポリマーストック溶液と追加のNCMNバッファーAをサンプルに加え、最終濃度が2.5%のメンブレン活性ポリマーになるまで、溶液を摂氏20度で2時間振とうします。インキュベーションの最後に、サンプルを超遠心分離します。遠心分離中に、遠心分離の最後に 5 ミリリットルのニッケル NTA カラムを 25 ミリリットルの NCMN A.At バッファーと平衡化し、上清をカラムに移し、毎分 0.5 ミリリットルの流量に設定されたシリンジポンプを使用して、上清を摂氏 20 度でカラムにロードします。高速タンパク質液体クロマトグラフィーマシンラインを十分な量の NCMN バッファー B で洗浄し、システムを完全に洗い流し、カラムをクロマトグラフィーマシンに接続します。30 ミリリットルの NCMN バッファー B でカラムを 1 m/分 1 ミリリットルの流量で洗浄し、フロースルーを回収します。カラムを 30 ミリリットルの NCMN バッファー C で 1 ミリリットル/分の流量で洗浄し、フロースルーを回収します。20 mLのNCMN Buffer Dで0.5 mL/分の流量でタンパク質を溶出し、フラクションコレクターで1 mLのサンプルを採取した後、SDS-PAGEでタンパク質サンプルを摂氏4度で保存し、高速タンパク質液体クロマトグラフィー溶出グラフで観察されたピークに対応するサンプルを確認します。ネガティブステイングリッドを調製するには、カーボン面を上にしてスライドガラスを濾紙で包み、サンプル調製に使用するグリッドをスライド上に置きます。電子顕微鏡グリッド付きのスライドガラスを、2つの電極の間のグローディスチャージャーのチャンバーに配置し、ガラス蓋を交換して、蓋が中央に配置され、しっかりと密閉されていることを確認します。グロー放電機を運転し、プラズマによって生成された紫色の光が見えることを確認します。機械の運転が終了したら、チャンバーが大気圧に達するまで待ってから、ガラス蓋を取り外し、スライドをベンチに置きます。精製したタンパク質サンプルの濃度を1ミリリットルあたり約0.1ミリグラムに調整し、厚さ10ナノメートルのカーボングリッドに3.5マイクロリットルのタンパク質サンプルをロードします。1分後、濾紙を使用して電子顕微鏡グリッド表面から液体を取り除き、グリッド表面を1回の洗浄につき3マイクロリットルの水滴1滴で3回洗浄します。最後の水洗浄後、グリッド表面を3マイクロリットルの新鮮なろ過された2%酢酸ウラン液滴でさらに2回洗浄します。最後の酢酸ウラン洗浄後、ろ過した新鮮な2%酢酸ウランの3マイクロリットルの液滴でグリッドを1分間染色します。インキュベーションの最後に、新しい濾紙を使用して液滴を取り除き、グリッドを少なくとも1分間風乾してから、グリッドをグリッドボックスに保管して後で使用できます。ここでは、示されているように透過型電子顕微鏡を用いて得られたネガティブ染色画像を観察することができます。界面活性剤で精製した野生型アクラフラビン耐性チャネルタンパク質Bサンプルのネガティブ染色画像は、単分散粒子の均質な溶液を示し、タンパク質は明確に定義された三量体四次構造を示しています。これらの三量体構造は、精製後に観察されたサイズ排除クロマトグラムに対応しています。これに対し、同じく界面活性剤で精製したP223G変異体のネガティブ染色像では、凝集傾向はあるが観察可能な天然三量体は観察できない多分散ナノ粒子の不均一溶液が観察できます。これらの結果は、サイズ排除クロマトグラフィーによっても裏付けられています。野生型タンパク質および変異タンパク質についても、膜活性ポリマー NCMNP11による精製後の同様の結果が観察されました。NCMNP52ポリマーの使用により、はるかに大きなサイズの天然細胞膜ナノ粒子の生成が容易になり、単一の天然細胞膜粒子で複数のアクラフラビン耐性チャネルタンパク質B三量体をイメージングできます。しかし、変異体サンプルでは、大きな天然細胞膜二重層パッチを見ても、三量体粒子は観察されません。精製されたタンパク質サンプルのSDS-PAGE分析により、タンパク質の予測分子量で95%を超える純度のすべてのサンプルにアクラフラビン耐性Bが存在することが確認されます。このプロトコールを他のタンパク質に改変する場合、適切な膜画分の量と、可溶化プロセスの長さ、時間、温度を実験的に決定することが重要です。サンプルの画像から、明確に定義された構造単位を持つ単分散粒子の均質な溶液が明らかになった場合、そのサンプルはクライオ電子顕微鏡による高分解能構造決定に使用できます。

native-cell-membrane-nanoparticles-system-for-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで</em

生化学的ア ​​プローチは、膜タンパク質のin vivoでのタンパク質-タンパク質相互作用（PPI）を識別するために記載されている。この方法は、タンパク質架橋、アフィニティー精製および質量分析を組み合わせて、ほぼすべての細胞型または生物に適用可能である。このアプローチでは、一過性のPPIのさえ識別が可能となる。...

膜脊柱：膜タンパク質のタンパク質 - タンパク質相互作用を識別するために、生化学的ツールインビボ

提示されたプロトコルは、細孔スパンの溶媒を含まない脂質二重層を使用した単一トランスポーターレベルでの膜タンパク質媒介輸送の分析を説明しています。これは、大量生産されたナノポアアレイチップの作成と、高度に並列化されたデータ取得および分析を組み合わせることで達成され、膜タンパク質エフェクタースクリーニングの将来の確立が可能になります。...

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

この論文は、脂質近位環境におけるin vitroでの内在性膜タンパク質とさまざまなパートナー因子との相互作用と集合を評価する方法を説明しています。...

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成しますインビトロ

私たちは、流体脂質二重層によって取り囲まれるナノメートルタンパク質のパッチでガラスを官能化するプロトコルを提示します。これらの基板は、高度な光学顕微鏡と互換性があり、細胞接着および遊走の研究のためのプラットフォームとして機能することが期待されます。...

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

多くのタンパク質は、膜表面に付着するとその機能を果たします。ナノディスク膜上の外因性タンパク質の結合は、透過型電子顕微鏡によって間接的に画像化することができます。我々は、ネガティブ染色のリンスホタングステン酸ナトリウムによって誘発されるナノディスクの特徴的なスタッキング(rouleau)が、外部タンパク質の結合によって防止されることを示す。...

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

これは、組み合わせシーケンスの細胞貫通の目新しさとビオチン-アビジン プルダウン ・ システムに基づく細胞内タンパク質間相互作用を研究するためのプロトコルです。主な利点は、ターゲット シーケンスはセル lysates...

細胞内タンパク質間相互作用を研究するビオチン化セル透過ペプチド

ここでは、質量分析用サンプルの調製のための膜上消化技術のプロトコルを提示する。この技術は、タンパク質とタンパク質の相互作用の便利な分析を容易にします。...

膜上消化技術を用いてのタンパク質・タンパク質相互作用の評価

このプロトコルは、小麦無細胞系およびリポソームを用いた二重層透析法による高品質のプロテオリポソームの効率的な無細胞生産法を記載する。この方法は、膜タンパク質の機能解析、創薬標的のスクリーニング、および抗体開発に適した手段を提供します。...

膜タンパク質を標的とした機能解析と抗体開発のためのプロテオリポソームの無細胞生産

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ナノディスク内の膜タンパク質を安定化する技術

学ぶネイティブ細胞膜ナノ粒子システムを用いた膜タンパク質のオリゴマー状態解析法。電子顕微鏡と組み合わせることで、生細胞膜に近い環境で正確な構造データを取得し、高分解能構造決定に応用可能です。

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

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