Name: 化学的に定義された条件下でのヒト人工多能性幹細胞からの成熟した腎臓ポドサイトの誘導分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学ぶ：化学的に定義された培地を用いてiPS細胞から90%以上の効率で成熟した腎臓ポドサイトを26日間で誘導分化する方法。遺伝子操作不要で腎毒性試験や疾患モデリングに応用可能です。

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この研究は、デューク大学のプラット工学部、デューク医科大学腎臓学科、デューク大学医学部の椅子研究賞、バロウズウェルカム基金PDEPキャリア移行 アドホック 賞によって支援されました.M。M.Bは、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムの支援を受けています。DU11幹細胞ラインを寛大に提供してくれたBursac Labと、デューク大学のヴァルゲーゼラボが組織培養施設を一時的に共有してくれたことに感謝します。この出版物は、60歳の誕生日 を祝って、マサチューセッツ工科大学のノバルティス化学教授ローラ・L・キースリング教授に捧げられています。

1. 試薬の調製
<ol><li>HiPS細胞培養基底培地で解凍した5x hiPS細胞培養培地(CCM)サプリメントを希釈し、hiPS CCMの1x溶液を得た。 注:冷凍5x hiPS CCMサプリメントは、理想的には一晩4°Cで、ゆっくりと解凍プロセスを必要とします。1x hiPS CCMのアリコートは-20°Cで6ヶ月まで保存することができます。</li>
	<li>hiPS細胞培養用基膜(BM)マトリックス1コーティングプレートの調製:4°Cで氷上でBMマトリックス1を一晩解凍する。解凍したら、メーカーが提案した適切な希釈因子を持つアリコートを準備します。 注:通常、アリコートは、50 mL円錐管内の冷たいDMEM/F12の25 mLで、BMマトリックス1を完全に溶解し、残留結晶の形成を避けるために完全に混合して、その後の希釈のために準備されます。</li>
	<li>BMマトリックス1溶液の1mLを6ウェルプレートのウェルに移し、37°Cで1〜2時間、または4°Cで最低24時間インキュベートし、パラフィンフィルムで包みます。BMマトリックス1-被覆されたプレートは、4°Cで最大2週間保存することができます。</li>
	<li>基質膜(BM)マトリックス2の調製-コーティングされた版:9 mLの無菌蒸留水のBMマトリックス2の適切な量を希釈して5μg/mLの最終濃度を作製する。BMマトリックス2溶液700μLを12ウェルプレートのウェルに加え、室温でプレートを2時間または4°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>BMP7、アクティビンA、VEGFの各100 μg/mLストック溶液を次のように準備します:0.1%(wt/vol)BSAを含む無菌蒸留水でBMP7を再構成し、アクチビンAとVEGFを0.1%(wt/vol)BSAを含む無菌PBSで別々に再構成します。頻繁な凍結融解サイクルを避けるために、各ストック溶液から100 μLのアリコートを準備し、-20°Cで最大6ヶ月間保管します。</li>
	<li>3.079 mLの無菌蒸留水に10mgのY27632を溶解して、Y27632の10mMストック溶液を調製します。アリコート100 μLは、在庫から-20°Cで6ヶ月間保管します。</li>
	<li>滅菌DMSOの143.4 μLにCHIR99021の2mgを溶解し、30mMストック溶液を調製します。5 μLのアリコートを準備し、-20°Cで最大1ヶ月間保管してください(またはメーカーの推奨に従ってください)。</li>
	<li>3.33 mL滅菌DMSOでオールトランス レチノイン酸の10mgを溶解する。500 μL アリコートを準備し、-20 °Cで6ヶ月間保管します。</li>
</ol>2. 文化メディアの作成
<ol><li>グルタミンサプリメントを含むDMEM/12の適切な容積で、対応するストック溶液を最終濃度100 ng/mL ActR99021、10 μM Y27632、および1x B27無血清サプリメントに再構成して中皮分化培地を調製します。 注:中皮分化培地は、分化ステップの前に、実験の規模に適したボリュームで新たに調製する必要があります(通常、50 mLの培地は2つの12ウェルプレートに適しています)。</li>
	<li>グルタミンサプリメントを用いて、DMEM/F12の最終濃度100 ng/mL BMP7、3 μM CHIR99021、および1x B27のB27血清フリーサプリメントに対応するストック溶液を再構成することにより、中間中皮分化培地を調製します。 注:必要に応じて、培地は1%(vol/vol)ペニシリンストレプトマイシンで補うことができます。グルタミンサプリメントで DMEM/F12 を使用して、媒体の量を調整します。.この媒体は大きいバッチで準備することができる。しかし、凍結融解サイクルを繰り返さないように、小さなアリコート(例えば、50 mL円錐管で45 mL)に保存することをお勧めします。この培地は-20°Cで3ヶ月間保存でき、使用前に一晩4°Cで解凍することができます。</li>
	<li>最終濃度100 ng/mL BMP7、100 ng/mLアクチビンA、50 ng/mL VEGF、3 μM CHIR99021、1x B27血清無血清サプリメント、および0.1 μM全トランスレチノイン酸をDMEM/F12型食品で補間して再コンセプトして、ポドサイト誘導培地を調製します。媒体を光から守る(例えば、ホイル紙で容器を包むことで)。 注:この培地は、大きなバッチで調製し、3ヶ月まで-20°Cで暗闇の中に保存することができます。冷凍アリコートは、使用前に4°Cで一晩解凍する必要があります。</li>
	<li>DMEM/F12に10%(vol/vol)熱不活化FBSを加え、滅菌条件下でフィルターを加えて25 mLのトリプシン中和溶液を調製します。</li>
	<li>幹細胞由来ポドサイトの分化後のメンテナンスのために、製造者のガイドラインに従って基礎培地にサプリメントを添加してポドサイト維持培地でコンプリート培地を準備し、4°Cで最大2週間保存します。</li>
</ol>3. ハイプス細胞培養培地を用いたフィーダーフリーHiPS細胞培養
<ol><li>BMマトリックス1の残留溶液をプレコートされたプレートから吸引し、1〜2mLの加温DMEM/F12でウェルを3回洗浄した。</li>
	<li>吸引はhiPS細胞からhiPS CCMを使用し、温められたDMEM/F12で細胞を3回すすいでください。1 mLの温細胞剥離液を加え、37°Cで1分間インキュベートして細胞の解離を助けます。組織培養顕微鏡で細胞を目視検査し、細胞コロニーの縁部が丸みを帯びているように見えるようにし、細胞外着液を細胞から素早く吸引する(細胞コロニーがプレートに付着していることを確認する( ゆるやかに見えるが、細胞コロニーがプレートに付着していることを確認する)。DMEM/F12で細胞を1回緩やかにすすいで、細胞剥離液を除去します。</li>
	<li>3 mLのhiPS CCMを、細胞剥離液で処理したhiPS細胞(6ウェルプレートの各ウェル)に加えます。セルリフターを使用してコロニーを擦り、ピペット細胞懸濁液を上下に静かにして緩やかに接着した細胞を取り除きます。プレートを十分に洗い、すべての細胞が収穫されるようにします。 注:細胞に余分なせん断を避けるために5 mLピペットの使用をお勧めします。</li>
	<li>1ウェルあたり2 mLのhiPS CCMを含む新しいBMマトリックス1コーティング6ウェルプレートの各ウェルに、細胞懸濁液の0.5 mLを移します。ウェル内の細胞コロニーを分配し、5%CO2インキュベーターで37 °Cでインキュベートするために、図8の方法でプレートを移動します。細胞が分化実験に通過または使用される準備ができるまで、毎日培地をリフレッシュします(約70%の合流率)。 注:iPSCのルーチンパスエージングのための理想的なコロニーサイズはhiPS CCM(ROCK阻害剤なし)を使用してフィーダーフリー条件下で200-500 μmの間です。解離酵素またはバッファーを使用した処理中に細胞を個別化した場合、hiPS CCMをROCK阻害剤(例えば、10 μM Y27632)で補い、細胞の生存率を向上させることができます。</li>
</ol>4. 中皮細胞へのhiPS細胞の分化(0-2日目)
<ol><li>HiPS細胞培養は指数成長段階にあるが(通過後約4日以内、約70%の合流率)、コロニーの縁の内側および周囲に自発的に分化した細胞の存在を視覚的に検査する。必要に応じて、分化の無菌的に擦り落ち領域。</li>
	<li>hiPS細胞からHIPS CCMを吸引し、温かいDMEM/F12で細胞を3回すすます。37°Cで10分間酵素フリー細胞解離バッファーを1 mLで培養し、顕微鏡下で解離を確認します。異なるhiPS細胞株間の固有の違いのために、細胞解離バッファーの実際のインキュベーション時間は、所定の細胞株について決定されなければならない。</li>
	<li>セルリフターでウェルを静かにこすり取り、ゆるやかに接着した細胞を取り除き、細胞懸濁液を15 mL円錐形チューブに移し、続いて数回上下にピペットを作ってHiPS細胞を個体化します。<ol>
<li>セル懸濁液を、温かいDMEM/F12で15mLの体積に、遠心分離機を室温で290 x g で5分間持ちます。</li>
		<li>優しく上清を吸引し、残存BMマトリックス1および解離緩衝成分を除去するために遠心分離の別のラウンドのために暖かいDMEM / F12で細胞を再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>上清を吸引し、上述のように中皮誘導培地の1mLで細胞を再懸濁する。1 x 105 細胞/mLの濃度を達成するために必要な中皮分化培地の適切な体積を決定するために、ヘモサイトメーターまたはコールターカウンターを使用して細胞の総数を数えます。</li>
	<li>BMマトリックス2コーティングプレートからのECM溶液を吸引し、温かいDMEM/F12でプレートを2回リンスします。数回ピペットを使用して、hiPS細胞の懸濁液を軽く混ぜます。セル懸濁液1mLをBMマトリックス2コーティング12ウェルプレートのウェルそれぞれに移し、プレートを穏やかに振って細胞をより均等に分配します。</li>
	<li>プレートを37°Cで5%CO2インキュベーターでインキュベートします。翌日中皮誘導培地をリフレッシュします。 注:2日後、hiPS細胞由来の中皮細胞は中間中皮誘導の準備が整いました。</li>
</ol>5. 中間中半分へのhiPS細胞由来中皮細胞の分化(2-16日目)
<ol><li>分化プロトコルの2日目には、中皮誘導媒体を吸引し、1 mL当たり1mLの中間中期中期誘導媒体で補充する。</li>
	<li>代謝活性細胞の成長因子と小分子の正確な閾値を維持するために、毎日培地をリフレッシュします。実質的な細胞増殖およびメディア栄養素の急速な枯渇(メディアの黄変によって示される)がある場合、中間中皮分化培地の体積は、12ウェルプレートのウェル当たり1.3mLに増加させることができる。</li>
	<li>培養細胞は、中間中皮細胞を得るためにさらに14日間を行った。16日目までに、これらの細胞は後で使用するために凍結保存することができる。</li>
</ol>6. hiPS細胞由来中間中中軟体細胞のポドサイトへの分化(16日~21日目)
<ol><li>中間中皮細胞を温かいDMEM/F12でリンスし、37°Cで3分間0.05%トリプシン-EDTAのウェル当たり0.5 mLで細胞をインキュベートします。細胞の解教が始まっていることを確認するために目視検査を行います。</li>
	<li>細胞リフターを使用して細胞をスクレープし、1,000 μLピペットチップを使用して細胞懸濁液を数回使用して、個別化された(または小さな塊の)細胞を得る。 注: この段階では、集約されたセルがプロトコルのタイムライン内で末端に分化された表現型を取得できない可能性があるため、セルが完全に解約されていることを確認してください。</li>
	<li>トリプシン中和溶液のウェルあたり約2 mLを加えてトリプシンの活性を停止する。</li>
	<li>細胞を50 mL円錐形チューブに移し、DMEM/F12を使用して体積を最大50 mLにし、室温で201 x g で5分間細胞懸濁液を遠心分離します。</li>
	<li>上清を吸引し、ポドサイト誘導培地中の細胞を再懸濁する。最適な結果を得るには、12ウェルプレートの約100,000個の細胞/ウェルの最終播種密度を確保してください。セル懸濁液をBMマトリックス2コーティングプレートに加え、プレートを穏やかに振って細胞をより均等に分配します。</li>
	<li>細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベートし、培地を毎日5日間までリフレッシュし、21日目までにポドサイトを得た。 注:得られたhiPS細胞由来ポドサイトは、ポドサイト維持培地を含む完全な培地を使用することにより、培養で2〜4週間維持することができます。一度ポドサイト維持培地に入ると、細胞は1日おきに供給することができ、その後の研究や下流の分析に使用することができます。</li>
</ol>

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</ol>

S.Mは、多能性幹細胞からの腎臓ポドサイトの生成方法の特許出願中の著者です(米国特許出願14/950859)。残りの著者は、彼らが競合する利益を持っていないと宣言します。

本報告では、hiPS細胞からの腎臓糸球体ポドサイトの生成プロトコルについて述べている。hiPS細胞由来ポドサイトは、成熟した腎臓ポドサイト表現型13に関連する形態学的および分子的特徴を示す。これまでの刊行物では、hiPS細胞由来ポドサイトが、透過性マイクロ流体臓器オンチップ装置8,11で糸球体微小血管内皮細胞と共培養した場合に腎臓糸球体の構造および選択的濾過機能を模倣できることを示した。
このプロトコルの適応に関心のある研究者は、次の重要なステップを考慮する必要があります。まず、中皮細胞の誘導のためのラミニンコーティングプレートへのhiPS細胞の播種が重要なステップです。100,000個の細胞/ウェルの播種密度が推奨されますが、研究者は研究に使用される幹細胞ラインの複製速度に応じて、初期細胞播種密度を調整することができます。必要に応じて、この最適化により、メソダーム誘導段階で十分な細胞密度が確保され、メソダーム、中間メ...

ヒト多能性幹細胞培養の進歩は、再生医療、疾患モデリング、および薬物スクリーニングに革命をもたらす準備ができているので、研究者は、人体内のほぼすべての細胞型を得るように設計することができる再生可能でスケーラブルな生物学的材料の供給源を提供する1。この方法は、他の方法では入手が困難な特殊な機能型のセル型を派生する場合に特に役立ちます。ヒト人工多能性幹細胞(hiPS)細胞2、3、4、5は、体細胞起源と個別化医療の可能性から特に魅力的です。しかし、hiPS細胞から他の細胞系統を導き出す方法の開発は、不十分に定義された培養条件を頻繁に使用し、不十分な培養条件を使用し、6,7の異種細胞集団の低効率および非特異的生成を招くため、依然として困難である。
ここで提示される、化学的に定義された条件下で特異性および高効率のhiPS細胞からの成熟した腎臓ポドサイトの導出のための方法である。細胞微小環境内での複数因子の役割を考慮することにより、細胞培養培地に示される可溶性因子の最適化や、細胞外マトリックス成分や接着基材などの不溶性因子の最適化を含む幹細胞分化戦略が開発されました。ポドサイトの発達と機能におけるインテグリンシグナル伝達の重要性を考えると、細胞表面上のインテグリン受容体の発現を最初に検討した。β1インテグリンはhiPS細胞のみならず、中皮細胞及び中間中皮細胞8、9、10を含む誘導体においても高発現した。その後の実験では、β1インテグリン(ラミニン511またはラミニン511-E8フラグメントを含む)に結合するリガンドが、以下に記載の可溶性誘導体と組み合わせて使用した場合に、hiPS細胞のポドサイトへの接着および分化を支持することが確認された。
細胞系統の誘導は、アクチビンA、CHIR99021、およびY27632ロック阻害剤を含む培地の存在下で2日間ラミニンコーティングされた表面上で培養されたhiPS細胞が、初期のメソダームマーカーHAND1、グースコイド、および小頭体8,11を発現する細胞に分化できることを最初に確認することによって開始された。骨形態形成タンパク質7(BMP-7)およびCHIR99021を添加した培地を用いた14日間の中皮細胞の治療は、ニーフロン前駆細胞マーカーウィルム腫瘍1(WT1)を発現する中間中足細胞の誘導を可能にし、奇数スキップ関連タンパク質1(OSR1)8、11、およびペア化したタンパク質22(PAX)を用いた。成熟した腎臓糸球体の細胞を導出するために、中間中期細胞をBMP-7、アクチビンA、血管内皮増殖因子(VEGF)、全トランスレチノイン酸、およびCHIR99021からなる新規培地で4〜5日間処理した。フローサイトメトリーおよび免疫染色は、得られた細胞の90%> が成熟した腎臓ポドサイト8、11、13の分子、形態学的、および機能的特徴を示すことを確認するために使用した。これらの特性には、一次および二次的な足のプロセスの開発が含まれます。SYNPO、PODXL、MAF、EFNB28を含むポドサイト系統特異的遺伝子の発現と、ポドシン、ネフリン、およびWT114、15、16を含むタンパク質の発現。さらに、hiPS細胞由来ポドサイトは、下流実験のタイミングにさらなる柔軟性を提供する市販の培地8、11を用いることによって、最大4週間の培養液中で維持できることが分かった。hiPS-podocytesの純度を決定するために使用されるフローサイトメトリーパネルの詳細については、当社の前の出版物11を参照してください。

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DU11ヒトiPS細胞</td><td></td><td></td><td>DU11(Duke University clone #11) iPS細胞株は、デューク大学のiPSCコアファシリティで作製され、デューク大学のBursac Labから提供されました。この系統はマイコプラズマについて試験され、2019年7月に当研究室で最後に核型が決定され、核型が正常であることがわかりました。</td></tr><tr><td>Growth Factors and Media Supplements</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All-trans レチノイン酸 (500 mg)</td><td>72262</td><td>Stem Cell Technologies</td><td></td></tr><tr><td>B27 serum-free supplement</td><td>17504044</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>04-0004</td><td>Stemgent</td><td>May show lot-to-lot variation</td></tr> Complete <tr><td>Medium Kit with CultureBoost-R</td><td>4Z0-500-R</td><td>細胞システム</td><td>足細胞維持培地</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>12634028</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 with GlutaMAX supplement</td><td>10565042</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>DMEM/F12 with glutaine supplement</td></tr><tr><td>熱不活化 FBS</td><td>10082147</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>ヒトアクチビン A</td><td>PHC9564</td><td>Thermo/Life技術</td><td></td></tr><tr><td>ヒト BMP7</td><td>PHC9544</td><td>サーモ/ライフ テクノロジー</td><td></td></tr><tr><td>ズ ヒト VEGF</td><td>PHC9394</td><td>サーモ/ライフ テクノロジー</td><td></td></tr>ズ <tr><td>mTeSR1 培地</td><td>05850</td><td>幹細胞技術</td><td>hiPS 細胞培養培地 (CCM)</td></tr><tr><td>ペニシリン&ndash;ストレプトマイシン、液体(100回;)</td><td>15140-163</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Y27632 ROCK阻害剤</td><td>1254</td><td>Tocris</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&ndash; and Alexa Fluor 594&ndash;標識二次抗体</td><td>A32744;A32754;A-11076;A32790</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury(T)</td><td>ab20680</td><td>アブカム</td><td></td></tr><tr><td>ネフリン</td><td>GP-N2</td><td>Progen</td><td></td></tr><tr><td>OCT4</td><td>AF1759</td><td>R&D Systems</td><td></td></tr><tr><td>PAX2</td><td>71-6000</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>WT1</td><td>MAB4234</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>ECM Molecules</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment</td><td>N-892012</td><td>Iwai North America</td><td>Basement membrane (BM) matrix 2</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial</td><td>354277</td><td>BDBiosciences</td><td>基底膜(BM)マトリックス 1.ロット間の変動を示す場合があります</td></tr><tr><td>Enzymes and Other Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>A1110501</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>細胞剥離液</td></tr><tr><td>BSA</td><td>A9418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td> <td>D2438</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DMSOは有毒です。化学物質安全フード、</td></tr><tr><td>酵素フリー細胞解離バッファー、Hank'で取り扱う必要がありますS balanced salt</td><td>13150016</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>エタノール溶液、70% (vol/vol)、バイオテクノロジーグレード</td><td>97065-058</td><td>VWR</td><td>エタノールは可燃性で有毒</td></tr>です <tr><td>FBS</td><td>431097</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>28906</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>PFAは、手袋、白衣、安全眼鏡などの適切な個人用保護具を備えた化学ドラフトで取り扱う必要があります。吸入や皮膚との接触を避けてください。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>14190-250</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>滅菌蒸留水</td><td>15230162</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>97062-208</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td><td>25300-120</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸引ピペット、個別包装</td><td>29442-462</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-15R Centrifuge</td><td>B99516</td><td>Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>コニカル遠心チューブ、15 mL</td><td>352097</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>コニカル遠心チューブ、50 mL</td><td>352098</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Cryoboxes</td><td>3395465</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>冷凍保存用アリコート</td></tr><tr><td>EVOS M7000</td><td>AMF7000</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>固定および染色されたiPS細胞およびその誘導体の画像を取得するために使用される蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>100503-092</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2インキュベーター</td><td>51030403</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>iPS細胞およびその誘導体の</td></tr><tr><td>日常的な培養とメンテナンスにInverted Zeiss Axio Observer with AxioCam 503 camera</td><td>491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>足細胞分化の各段階における生きたiPS細胞とその誘導体の位相コントラスト画像の取得に使用</td></tr><tr><td>Kimberly-Clarkニトリル手袋</td><td>40101-346</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes, Large</td><td>21905-049</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes, Small</td><td>21905-026</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>P10精密バリアピペットチップ</td><td>P1096-FR</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td></td></tr><tr><td>P100バリアピペットチップ</td><td>P1125</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td></td></tr><tr><td>P1000バリアピペットチップ</td><td>P1126</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td></td></tr><tr><td>P20バリアピペットチップ</td><td>P1121</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td></td></tr><tr><td>P200バリアピペットチップ</td><td>P1122</td><td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Serological ピペット、10 mL、個別包装</td><td>356551</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipette、25 mL、個別包装</td><td>356525</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipette、5 mL、Corning</td><td></td><td></td>Steriflip <td>356543</td>個包装</tr><tr><td>、0.22 &mu;メートル、PES</td><td>SCGP00525</td><td>EMDミリポア</td><td></td></tr><tr><td>滅菌マイクロ遠心チューブ</td><td>1138W14</td><td>トーマス科学</td><td>成長因子の組織培養を分注するため</td></tr><tr><td>。Corning</td><td></td><td>Tissue</td> culture <td>353043</td>処理された12ウェルプレート</tr><tr><td>&ndash;処理された6ウェルプレート</td><td></td><td>353046 Corning</td><td></td></tr><tr><td>VWR white techuni lab coat</td><td>10141-342</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Wide-beveled cell lifter</td><td>3008</td><td>Corning</td><td></td></tr></tbody></table>

化学的に定義された条件下でのヒト人工多能性幹細胞からの成熟した腎臓ポドサイトの誘導分化

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

腎臓病は世界人口の10%以上に影響を及ぼし、連邦支出に数十億ドルの費用がかかります。腎臓病の最も重篤な形態および最終的な末期腎不全は、しばしば、内皮細胞および糸球体地下膜と一緒に機能する高度に特殊化された上皮細胞である糸球体ポドサイトの損傷によって引き起こされ、腎臓の濾過障壁を形成する。腎医学の進歩は、一次組織の利用が限られており、ポドサイトなどの機能性ヒト腎臓細胞の誘導のための堅牢な方法の欠如によって妨げられてきた。幹細胞などの再生可能な供給源からポドサイトを導き出す能力は、ヒト腎臓の発達と病気のメカニズムに関する現在の理解を進めるだけでなく、治療的発見のための新しいツールを提供するのに役立つ可能性があります。このプロトコルの目的は、高効率かつ特異性のヒト誘導多能性幹細胞(hiPS)細胞から、化学的に定義された条件下で成熟した、後の有糸球体を導き出す方法を開発することであった。この方法で生成されたhiPS細胞由来ポドサイトは、系統特異的マーカー(ネフリン、ポドシン、ウィルム腫瘍1を含む)を発現し、成熟した機能的ポドサイトに関連する特殊な形態学的特徴(一次および二次足プロセスを含む)を示す。興味深いことに、これらの特殊な特徴は、この分野で広く使用されている不死化ポドサイト細胞株には特に存在せず、本明細書に記載されているプロトコルは、ヒト腎臓生物学を研究するために典型的に使用される既存のポドサイト細胞株よりも発達的により成熟した表現型を有するヒト腎臓ポドサイトを産生することを示唆している。

このプロトコルの目的は、成熟したヒトポドサイトが化学的に定義された条件下でhiPS細胞から誘導できることを実証することであった。この原稿に記載されたデータは、DU11 hiPS細胞株17を用いて生成され、最初に試験され、マイコプラズマが含まれなかったことが判明した。染色体分析も行われ、細胞はカルヨタイプ正常であることが判明した。未分化DU11 hiPS細胞から、この報告書に概説されている分化戦略(図1)を用いて、まず、小子状(T)を発現する中皮細胞(図1Bおよび図2B)に幹細胞を分化し、続いてPAX2陽性の中間中間メソダーム細胞(図2C)に分化し、最終的に成熟した腎細胞に分化した。 図 2D</...

ここで提示されるのは、高効率(>90%)を有する誘導多能性幹細胞からのヒト腎臓ポドサイトの誘導のための化学的に定義されたプロトコルであり、遺伝子操作または亜集団選択とは無関係である。このプロトコルは、26日以内に望ましい細胞タイプを生成し、腎毒性試験および疾患モデリングに有用であり得る。

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

幹細胞を機能的な腎臓細胞に分化させるためのプロトコルは、まだとらえどころのないままです。この方法は、特異性と効率を備えた成熟した有足細胞を作製し、腎臓病のメカニズムを研究するための新しいツールを提供します。この方法は、細胞培養培地と化学的に定義された組成の細胞外マトリックスタンパク質を用いて、亜集団選択や遺伝子操作を行わずに高純度のヒトiPS細胞由来有足細胞を作製する方法です。腎臓病の患者さんの治療選択肢は限られています。この方法は、疾患メカニズムのモデル化と理解に影響を及ぼし、新しいバイオマーカーと治療法の開発を促進する可能性があります。フィーダーフリーのヒトiPS細胞培養液を調製するには、プレコートプレートから基底膜マトリックス1の残留溶液を吸引し、温めた基礎培地のウェルごとに1〜2ミリリットルでウェルを3回洗浄します。ヒトiPS細胞培養液から使用済み細胞培養液を吸引し、温めた培地で細胞を3回すすぎます。各ウェルに1ミリリットルの温かい細胞剥離溶液を加え、摂氏37度で1分間インキュベートします。丸みを帯びた細胞コロニーの縁を組織培養顕微鏡で確認した後、細胞剥離液を迅速に吸引し、細胞培養培地で細胞を穏やかにすすいでください。ヒト人工多能性幹細胞に3ミリリットルのヒトiPS細胞培養液を加え、セルリフターを使用してコロニーを掻き取ります。細胞懸濁液を静かにピペットで動かして、緩く付着した細胞を取り除き、プレートを完全に洗浄して、すべての細胞が確実に回収されるようにします。新しい基底膜マトリックスの各ウェルに500マイクロリットルの細胞を移し、ウェルごとに2ミリリットルのヒト誘導多能性幹細胞を含む1コーティングされた6ウェルプレートに移し、プレートを8の字型に動かしてウェル内の細胞コロニーを均等に分配します。プレートを細胞培養インキュベーターに置き、細胞が約70%の密度に達するまで毎日培地をリフレッシュします。必要に応じて、ウェルから上清を吸引する前に、分化領域を無菌的にこすり落とします。ウェルを3回洗浄した後、実証されたように細胞を解離し、得られた細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に引き込みます。ピペッティングで混合した後、温かい培地でチューブ内の最終容量を15ミリリットルにし、遠心分離によって細胞を回収します。ペレットを新鮮な培地に再懸濁して2回目の遠心分離を行い、細胞を1ミリリットルの中胚葉誘導培地に再懸濁してカウントします。カウント後、細胞を中胚葉誘導培地濃度の1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞の1倍に再懸濁し、基底膜マトリックス2コーティングプレートから細胞外マトリックス溶液を吸引する。プレートを温かい培地で2回すすぎ、ヒト誘発多能性幹細胞懸濁液を穏やかなピペッティングで混合します。基底膜マトリックス2でコーティングされた12ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの細胞を加え、プレートを穏やかに振とうして細胞をより均一に分布させます。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。分化の2〜15日目に、中胚葉誘導培地をウェルあたり1ミリリットルの中間中胚葉誘導培地と交換します。培地の黄変によって示されるように、実質的な細胞増殖および栄養素の急速な枯渇が観察される場合、中間中胚葉分化培地の容量は、ウェル当たり1.3ミリリットルに増加させることができる。培養16日目に、中間中胚葉細胞を温かい培地ですすぎ、ウェルあたり500マイクロリットルの0.05%トリプシンEDTAで細胞を37°Cで3分間インキュベートします。細胞が解離し始めたら、セルリフターで細胞をこすり落とし、ピペッティングで細胞を穏やかに混合します。ウェルごとに約2ミリリットルのトリプシン中和溶液で反応を停止し、細胞を50ミリリットルの円錐管に移します。培地で容量を最大50ミリリットルにし、遠心分離によって細胞を回収します。ペレットを足細胞誘導培地に中濃度の1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞の1回で再懸濁し、細胞を基底膜マトリックス2コーティングプレートに添加します。次に、プレートを静かに振って、細胞をより均等に分散させ、細胞を最大5日間インキュベーターに入れます。実証された培養戦略を使用して、幹細胞は最初にBrachyuryを発現する中胚葉細胞に分化し、次にPAX2陽性の中間中胚葉細胞に分化し、最終的には成熟した腎臓糸球体足細胞に分化させることができます。幹細胞由来の足細胞は、WT1および系統同定マーカーのネフリンに対して陽性です。興味深いことに、ネフリンの細胞内局在は、主に足細胞の突起と細胞質内にあり、成熟した足細胞の表現型と一致しています。12ウェルプレートのウェルあたり1×10から5番目の細胞の推奨密度を大幅に超える密度で播種された細胞は、プロトコルの標準タイムライン内で成熟した足細胞の期待される形態学的表現型を欠く細胞の大きなクラスターをもたらします。しかし、このプロトコルで推奨されている密度で播種すると、所望の形態の細胞が培養されます。細胞の剥離には適切な基底膜タンパク質を使用し、中胚葉および足細胞の誘導には適切な細胞播種密度を維持することをお勧めします。この足細胞分化法は、臓器チップ、マイクロ流体システム、または3Dバイオプリンティング技術と統合して、薬物スクリーニングや腎毒性試験のためのヒト腎臓の機能モデルを開発できます。適切な細胞培養モデルの欠如は、腎臓病のメカニズムの理解の進展を妨げてきました。このプロトコルは、疾患モデリングのための患者由来の有足細胞の無尽蔵の供給源を研究者に提供します。

guided-differentiation-mature-kidney-podocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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学ぶ：化学的に定義された培地を用いてiPS細胞から90%以上の効率で成熟した腎臓ポドサイトを26日間で誘導分化する方法。遺伝子操作不要で腎毒性試験や疾患モデリングに応用可能です。

化学的に定義された条件下でのヒト人工多能性幹細胞からの成熟した腎臓ポドサイトの誘導分化

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