げっ歯類の脳サンプルの単一のセットで脳卒中後脳浮腫、梗塞ゾーンおよび血液脳関門破壊を測定する
2020年10月23日
このプロトコルは、げっ歯類の脳サンプルの同じセット上の虚血性脳損傷の3つの最も重要なパラメータを測定する新しい技術を記述する。1つの脳サンプルのみを使用することは、倫理的および経済的コストの面で非常に有利である。
現在のプロトコルでは、虚血性脳損傷を測定して、梗塞ゾーン、脳浮腫、およびBBB透過性を測定する修正中大脳動脈閉塞技術を提示します げっ歯類の脳のセットで。倫理的および経済的コストの観点から、この手法の主な利点は、3つの測定すべてに必要な脳サンプルが1つだけであることです。虚血性脳損傷の主なパラメーターのこの評価は、虚血性脳卒中の病態生理学を包括的に調査するのに役立ちます。
まず、ラットの脳を取り出し、0.009インチのステンレス鋼のコーティングされていない片刃のかみそりの刃で2ミリメートルの厚さの水平部分を切り取ります。切片を0.005%TTCに置き、摂氏37度で30分間インキュベートした後、脳組織を顕微鏡スライド上に置き、1600×1600DPIの解像度で6つの脳スライスの光学スキャンを行います。フォトエディタを使用して、画像に青いフィルターを追加します。
ソフトウェアを開いた後、画像、調整、チャンネルミキサーに移動します。出力チャンネルとして青を選択し、モノクロをチェックしてから、[OK]をクリックします。画像をJPEGファイル形式で保存します。
ImageJ バージョン 1.37 のポリゴン選択ツールを使用して、6 つの脳スライスの各半球を選択し、個別の画像ファイルとして保存します。梗塞の体積と脳浮腫を計算するには、マクロを使用して、しきい値に基づいて画像内のピクセルを白または黒に変換します。次に、すべてのファイルを閉じ、2番目のマクロを使用して白と黒のピクセルの数を比較し、梗塞の体積と脳の浮腫を決定します。
生データをスプレッドシートにコピーします。梗塞容積を計算するときは、同側大脳半球と対側大脳半球の比率を使用して組織の腫れを補正します。脳浮腫領域を、影響を受けていない対側半球の標準領域のパーセンテージとして表します。
閉塞後24時間で血液脳関門の破壊を特定します。左右の半球を6つのスライスに分割し、各スライスを微量遠心チューブに入れます。脳組織の各スライスをトリクロロ酢酸で均質化し、脳組織の1グラムあたり4ミリリットルの50%トリクロロ酢酸を使用します。
サンプルを 10, 000 倍 G で 20 分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、96% エタノールで 1:3 に希釈します。プレートリーダーで発光分光光度計を行います。独立したサンプルのt検定では、永久的な中大脳動脈閉塞術(MCAO)を受けた19匹のラットは、偽手術を受けたラット16匹と比較して脳梗塞量の有意な増加を示したことが示されました。
また、恒久的なMCAOを受けたラットは、偽の手術を受けた動物と比較して、24時間後の脳浮腫および血液脳関門の破壊の程度が有意に増加したことを示しました。この手順を試みるときは、化学物質の濃度がプロトコルに準拠していることを確認することが重要です。このプロトコルにより、脳の 1 つのサンプルで虚血性損傷の 3 つのパラメーターすべてを評価することができます。
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概要
本プロトコルでは、同一のげっ歯類脳サンプルを用いて梗塞領域、脳浮腫、および血液脳関門（BBB）透過性を評価することで、虚血性脳損傷を解析するための改良型中大脳動脈閉塞法について詳述します。単一の脳サンプルを利用することで、虚血性ストロークの病態生理を包括的に検討しつつ、倫理的および経済的な効率性を高めることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 虚血性脳損傷
- げっ歯類モデル
背景
- 虚血性脳卒中は、罹患率および死亡率の主要な原因となっています。
- 脳損傷の複数のパラメータを評価することで、脳卒中のメカニズムへの理解を深めることができます。
- 現在の手法では複数のサンプルが必要となることが多く、倫理的な制約やリソースの制限が生じています。
- 本研究では、1つのサンプルを用いてさまざまな損傷指標を測定する効率的なアプローチを導入します。
研究の目的
- げっ歯類の脳における梗塞体積、浮腫、およびBBB（血液脳関門）破綻を測定する手法を開発すること。
- リソースの効率性を向上させ、多数の動物サンプルの使用への依存を低減すること。
- 虚血性脳損傷および回復に関するより包括的な理解を促進すること。
使用された手法
- この手法では、中大脳動脈閉塞により虚血を誘発したラットの脳サンプルを使用します。
- 脳切片を作製し、浮腫やBBBの整合性を含むさまざまな傷害パラメータについて解析を行います。
- 主な手順には、画像処理、梗塞体積算出のためのピクセル解析、およびBBB破綻を評価するための分光光度法が含まれます。
- データは定量化され、統計解析を用いて虚血群と対照群の間で比較されます。
主な結果
- 本プロトコルにより、ラットモデルにおける梗塞体積、浮腫、およびBBB（血液脳関門）の完全性を同時に測定することが可能となった。
- 対照群と比較して、虚血を誘発したラットではこれらのパラメータに有意な増加が認められた。
- これらの知見は、動物使用数を削減しつつ虚血性損傷を評価する上での本手法の有効性を強調している。
結論
- 本研究では、虚血性脳損傷の主要なパラメータを同時に評価する新しい手法を提示します。
- このアプローチにより、脳卒中の病理への理解が深まり、より倫理的な研究実践が可能になります。
- 得られた知見は、潜在的な治療法の開発や神経保護戦略の理解に寄与します。
よくある質問
産業界への有用性
単一のげっ歯類脳サンプルから複数の虚血性損傷パラメータを測定することで、動物の使用数を削減し、実験的なばらつきを抑えることができ、倫理的かつコスト効率の高い前臨床脳卒中研究を支援します。この統合的な評価により、神経保護薬の創薬におけるより信頼性の高いターゲット検証とメカニズムのデリスキングが可能になります。本手法は、同一の生物学的システム内で梗塞体積、浮腫、およびBBB透過性を相関させることにより、予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：梗塞領域、浮腫、およびBBB（血液脳関門）破壊を統合的な病態生理学的リードアウトで関連付けることにより、治療仮説の検証を可能にする。
- 実用的価値：必要サンプル数を削減し、ターゲットエンゲージメント研究におけるスループットと一貫性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値：ピクセルベースの画像解析を通じて、梗塞体積と浮腫の標準化された定量的アウトプットを提供し、アッセイの再現性を向上させます。
- 運用の価値：ImageJマクロや分光光度法などの利用しやすいツールを使用しており、探索チーム間での技術移転を容易にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 単一のサンプルで脳卒中の主要な病理学的エンドポイントをモデル化することで、疾患に関連するシステムとの整合性を確保します。
- 運用の価値： 発見段階から前臨床検証に至るまで、バイオマーカーの連続性の縦断的評価を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットの検証からリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに適合しており、脳卒中治療薬における進退判断（go/no-go決定）に寄与するマルチパラメトリックな読み出しを提供します。
- 発見生物学：構造的および機能的な損傷マーカーの同時測定を可能にすることで、経路の解明を支援します。
- スクリーニング：標準化された画像処理と正規化を通じて、梗塞および浮腫に関する定量的なアッセイ済みデータを提供します。
- 分析：ルミネッセンス分光光度計を用いて、BBBの完全性と補正後の梗塞体積の算出に関する比較可能なデータセットを生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：浮腫およびBBB破綻を翻訳可能な損傷バイオマーカーとして検証することで、メカニズム的な知見を前臨床の連続性へと結びつけます。
- 企業での再利用：複数の損傷次元にわたって神経保護化合物を評価するための、再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： マルチパラメトリックな脳卒中評価における個体間変動による生物学的ノイズを低減し、予測の信頼性を向上させます。
- 運用的価値： 定義された切片作成、染色、および画像解析プロトコルにより、標準化と拡張性を高めます。
- 戦略的価値： 動物の使用数を最小限に抑え、より情報量の多い実験を可能にすることで、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 梗塞、浮腫、およびBBB（血液脳関門）の一致したデータに基づき、脳卒中治療薬のリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 正確なパラメータ定量化のためには、組織学、画像解析（ImageJ）、および分光光度法に関する専門知識が必要です。
- マイクロトーム、プレートリーダー、および校正済みイメージングシステムを含む精密機器に依存します。
- 染色しきい値、マクロパラメータ、およびデータ正規化手順について、チーム間での標準化が必要です。
- 異なるげっ歯類系統や損傷モデルにプロトコルを適用する場合、適応上の検討事項が含まれます。
- 実用上の制限として、信頼性の高いBBB測定のためには、一貫した組織切片作成と化学試薬の純度への依存が挙げられます。
