Name: 固形腫瘍移植による骨原発性骨腫瘍と骨転移のモデリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学ぼう、固形腫瘍移植による骨原発性骨腫瘍と骨転移のモデリング手法。懸濁液注入による肺塞栓のリスクを回避し、より均一なモデルを構築。患者由来異種移植片を用いた個別化医療への応用も可能です。

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著者らは、この技術の開発に対するベス・チャフィー博士、DVM、PhD、DACVPの重要な貢献を認めています。

記載されているすべての動物実験は、英国ケンブリッジのケンブリッジ大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
1. 細胞株の調製
<ol><li>従来の細胞培養またはマウスへの注射のためのラボの標準的な細胞培養プロトコルに従って細胞株を増殖させます。ここで使用される標準プロトコルは、10%ウシ胎児血清(FBS)、L-グルタミン、およびペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(以下、完全増殖培地と呼びます)での増殖です。 注:この実験では、エイブラムス骨肉腫細胞をBalb / c Foxn1 nu / nu マウスで使用しました。乳がん研究では、Balb / cマウスの4T1細胞とC57BL / 6マウスのEO771細胞が使用されます。</li>
	<li>通気組織培養フラスコまたは6ウェル組織培養プレートのいずれかで、5%CO2中で37°Cで細胞を増殖させます。</li>
	<li>目的の細胞株を継代し、細胞がマウスへのこれらの細胞の注射で一般的に使用されるコンフルエントに達したら、注射用の細胞を準備します。</li>
</ol>2.動物
<ol><li>皮下腫瘍の生成に少なくとも6〜8週齢のBalb / c Foxn1 nu / nu マウスを使用して、動物が急速な成長段階を超え、成体期および骨格の成熟を達成していることを確認します。</li>
	<li>オスまたはメスのマウスを使用してください。ホルモン応答性細胞株(例えば、雌マウスの乳癌細胞および雄マウスの前立腺癌細胞)を選択するときは例外を設けてください。</li>
	<li>異種移植片の実験には、通常の条件下では無傷のマウス免疫系と互換性がないことに基づいて、免疫不全の無胸腺ヌードマウスを使用します。</li>
	<li>マウス細胞株を用いた同種移植実験では、異なるマウスの遺伝的背景と免疫的背景に基づいて、これも推奨されます。しかしながら、同系実験のためには、目的の細胞株と同じ株の動物を使用する。</li>
	<li>施設の飼育方針に応じた標準的な密度で動物を飼育します。</li>
</ol>3.皮下腫瘍
<ol><li>トリプシン処理によって培養物から細胞株を回収し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。</li>
	<li>細胞の生存率を評価し、トリパンブルー排除法によって細胞密度を決定します。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。90%の最小細胞生存率は、皮下腫瘍を作成するためのマウスへの注射に使用されます。</li>
	<li>細胞密度を調整して、1〜2 x 105 個の細胞を0.1〜0.15 mL(100〜150 μL)の滅菌PBSの最終容量に注入します。注射まで細胞を氷上に保ちます。</li>
	<li>あるいは、800 x g で5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。上清を廃棄し、ペレット化した細胞を希釈していない滅菌基底膜マトリックス培地に再懸濁して、最終容量0.1〜0.15 mL(100〜150 μL)の1〜2 x 105 細胞を得ます。さらに使用するまで細胞を氷上に保管してください。</li>
	<li>酸素麻酔でイソフルランによる皮下腫瘍増殖に使用するマウスを麻酔する。2 L /分の酸素中に5%イソフルランの誘導用量を使用し、2 L /分の酸素中に2〜3%イソフルランの維持用量を使用します。.先に進む前に、まばたきやペダルの反射神経がないかどうかを確認してください。 注:イソフルランは吸入麻酔薬です。.イソフルランは、適切な掃気および遊離ガス収集システムを備えた換気の良い場所で使用してください。麻酔の導入、維持、および監視の計画を策定するために施設の獣医スタッフと相談し、検査室のスタッフが麻酔モニタリングと吸入麻酔薬の取り扱いについて適切なトレーニングを受けていることを確認してください。</li>
	<li>麻酔をかけたマウスの胸部または腹部の背側領域から脱毛液または電気バリカンで毛髪を除去する。脱毛溶液は、皮膚への潜在的な外傷を最小限に抑えるために好ましい。無胸腺ヌードマウスを使用する場合は、この手順をスキップしてください。</li>
	<li>細胞懸濁液を注入する前に、調製した領域を70%エタノール綿棒で洗浄する。</li>
	<li>27 Gの針が付いた1 mLのツベルクリン注射器を使用して、肩甲骨の動きの影響を受けないように、胸部または腹部の背部に細胞を皮下注射します。あるいは、市販の細胞外マトリックスに懸濁液として細胞を皮下注射する。 注:市販の細胞外マトリックスへの注射は、これらのマトリックスが室温で固化するため、皮下空間での細胞懸濁液の移動を制限します。</li>
	<li>歩行可能になるまで、個々のケージの加熱パッドでマウスを回収します。その後、マウスは清潔で乾いた寝具を備えた通常のケージに入れることができます。</li>
	<li>背胸部または腹部を覆う皮下腫瘍のサイズをノギスで監視し、毎週体重を測定して、皮下腫瘍が潰瘍化していないこと、またはマウスが施設の動物管理および使用委員会によって確立された早期除去基準を満たしていることを確認します。皮膚潰瘍や中枢性腫瘍壊死のリスクを減らすために、任意の寸法で最大15 mmの腫瘍サイズが推奨されます。 注:地域のガイドラインを参照して、最大許容腫瘍サイズ/体積を決定してください。</li>
	<li>3〜4週間後に皮下腫瘍を有するマウスをCO2 吸入とそれに続く頸部脱臼により安楽死させる。マウスの安楽死に関する機関の許容可能な方針に従ってください。</li>
	<li>無菌手術技術を使用して皮下腫瘍を採取します。脱毛後、以前と同様に腫瘍の上にある皮膚を70%エタノールで滅菌します(該当する場合)。#15メスの刃(メスの刃のハンドルの有無にかかわらず)で腫瘍の上にある皮膚を切開します。滅菌外科用ハサミで周囲の付着軟部組織から腫瘍を鋭く解剖します。</li>
	<li>腫瘍を完全増殖培地を含む6ウェル組織培養プレートに入れ、#15メス刃(メス刃ハンドルの有無にかかわらず)で、事前に決定されたサイズ(~0.6 mm x 0.6 mm x 0.6 mm – 0.25 mm、3、最大1 mm x 1 mm x 1 mm– 1 mm3)の複数の小さな断片に細刻します。</li>
	<li>脛骨内移植時まで、室温で滅菌完全増殖培地中の腫瘍断片を維持します。ルシフェラーゼまたは蛍光レポーター遺伝子を有する細胞株の場合、マウスへの脛骨内移植の前に、ex vivo生物発光または蛍光イメージングを使用して腫瘍の生存率を確認します。</li>
	<li>凍結保存のために、20%FBSおよび10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を添加した完全増殖培地中の同じクライオバイアルに複数のフラグメントを配置します。市販の凍結保存システムを使用して–80°Cで徐々に凍結し、液体窒素で長期間保存します。液体窒素浸漬を使用した急速凍結により、その後の分析のために腫瘍断片を保存しますが、将来の移植のためには保存しません。これらの凍結腫瘍断片は、–80°Cで長期間保管してください。 注:スナップ凍結腫瘍はin vivoで生着および成長しないことが以前に報告されています8。</li>
</ol>4.皮下腫瘍片の外科的移植
<ol><li>外科的移植の前に、皮下腫瘍の新鮮なまたは凍結保存された断片を完全な増殖培地で室温に戻します。</li>
	<li>目的の系統のマウスを、セクション3に記載される酸素麻酔でイソフルランを使用して麻酔する。先に進む前に、ペダル反射の欠如を確認してください。術期鎮痛を提供するために、0.02〜0.05 mg / kgの用量で皮下ブプレノルフィンを投与します。.必要に応じて、術後の期間に6〜8時間ごとにこれを繰り返すことができます。</li>
	<li>皮膚への潜在的な外傷を最小限に抑えるために、脱毛液で右膝関節と後肢の近位脛骨の毛を取り除きます。</li>
	<li>準備した部分を外科用消毒剤でこすります。最初に70%エタノール綿棒でスクラブし、次にクロルヘキシジンと生理食塩水スクラブを交互にスクラブします。</li>
	<li>近位脛骨を、関節を曲げたり伸ばしたりしながら、膝関節のすぐ遠位にある領域として視覚化します。</li>
	<li>#15メスの刃(メスの刃のハンドルの有無にかかわらず)を使用して、四肢の内側の近位脛骨のレベルで3〜4 mmの切開を作成します。皮膚と皮下組織を切開して、近位脛骨の内側皮質を露出させます。</li>
	<li>25Gの針の先端で軽く圧力をかけ、先端を回転させて、近位脛骨の内側皮質に小さな穴を開けます。この穴を、頭蓋脛骨皮質と尾脛骨皮質の間の等距離の点で膝関節から約2 mm遠位にします。腫瘍片の大きさに応じて針の大きさを選択してください。</li>
	<li>滅菌鉗子を使用して腫瘍片を拾い上げ、近位脛骨の髄腔に挿入します。27〜30 Gの針を使用して、腫瘍断片を髄管に操作します。腫瘍断片のサイズに応じて、各脛骨に最小0.5 mm3 の総腫瘍体積を移植します。これは、作成された腫瘍断片のサイズに応じて、1つ以上の腫瘍断片の移植を必要とする場合がある。 注:骨の外側への移植片の変位を防止または制限するための変更は、骨欠損部への骨ワックスまたは骨セメントの配置、または骨の穴へのゲルフォームまたは皮下脂肪移植のいずれかです。</li>
	<li>滅菌液体組織接着剤または単一の皮膚縫合糸で皮膚の端を任命します。このサイトでは傷付きクリップを使用しないでください。術後に蛍光イメージングを使用する場合は、組織接着剤と縫合糸の両方が蛍光を発する可能性があるため、注意してください。</li>
	<li>歩行可能になるまで、個々のケージの加熱パッドでマウスを回収します。</li>
</ol>5. シリアルおよびエンドポイント評価
<ol><li>前述のように酸素麻酔でイソフルランを使用してマウスを麻酔する。</li>
	<li>毎週のデジタルX線撮影、生物発光、または蛍光イメージング(ルシフェラーゼまたは蛍光レポーター遺伝子を発現する細胞を使用する場合)のいずれかによって、脛骨腫瘍の成長を非侵襲的に評価します。移植部位における四肢のキャリパー測定は、覚醒マウスにおいても行うことができる。</li>
	<li>担癌マウスの従来のモニタリング(体重、活動レベル、呼吸数、グルーミング、姿勢、メンテーション、および行動)に加えて、後肢の跛行、腫脹、および手術部位感染の兆候についてマウスを毎週監視します。</li>
	<li>皮膚の創傷が治癒するまで、最初の10〜14日間、過度の発赤、腫れ、排液、および創傷裂開がないか、皮膚の外科的創傷を監視します。4〜5週間後、生存または安楽死後の研究結果評価に従ってマウスを評価する。</li>
</ol>

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</ol>

ヒルドレス博士は、NIHから賞番号K01OD026527で資金提供を受けました。 コンテンツは著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。

このレポートは、腫瘍同種移植片の脛骨内移植後の原発性骨腫瘍または骨転移を作成するためのモデルを文書化しています。このプロセスにはいくつかの重要なステップがあると考えています。腫瘍細胞懸濁液の皮下注射と得られた腫瘍断片の脛骨内埋入の両方について、安全な麻酔面を確立する必要があります。皮下同種移植片の除去および同種移植片の脛骨内埋入の両方のための手術部位の滅菌調製物があるべきである。腫瘍同種移植片の断片は、その後の脛骨内移植のために均一に作成する必要があります。腫瘍片の移植のために、近位脛骨に適切なサイズの欠陥を作成する必要があります。術後の創傷合併症のリスクを減らすために、外科的皮膚創傷を完全に閉じる必要があります。最後の重要なステップは、皮下注射用の腫瘍細胞懸濁液の一部として細胞外マトリックスを使用する場合、注射前の懸濁液の固化を避けるために、メーカーが推奨する取り扱い指示書を使用する必要があることです。四肢の適切な滅菌準備、滅菌術中技術、および完全な創傷閉鎖により、術後の外科的創傷合併症の可能性が最小限に抑えられます。
移植された腫瘍の特徴と外科的技術は、研究集団に組み込むための...

ヒトおよび動物の疾患のマウスモデルは、生物医学研究においてますます人気が高まっています。この文脈でマウスを使用することの有用性は、それらの解剖学的構造と生理学が人間に非常に似ているということです。それらは、成熟を達成するための出生後の生活における妊娠期間と期間が比較的短く、開発または購入のコストの増加は、遺伝子組み換え、免疫不全、および/またはヒト化の程度が高いことに関連していますが、比較的低コストと住居の容易さに大きく関連しています1。近交系株を使用すると、研究に含める前に、ほぼ均一な動物集団が得られます。それらのゲノムの完全な知識は、ヒトとの高度な類似性を示唆しています。多くの疾患プロセスのオーソログ分子標的がマウスゲノムで同定されており、現在、容易に入手できるマウス特異的試薬の広範なライブラリがあります。したがって、それらは、より大きな動物モデルと比較して、より迅速かつ安価な方法で比較的ハイスループット分析の機会を提供します1。さらに、特定の遺伝子の過剰発現または欠失をグローバルに、または細胞型特異的に、および/または構成的または誘導可能な方法で可能にする遺伝子編集戦略の出現により、それらはヒトおよび動物の病気の研究のための非常に生物学的に有用なモデルシステムを表しています2。
がんは、マウスモデルが大きな有用性を持つ分野の1つです。がんの遺伝子マウスモデルは、細胞が発癌性形質転換を受けるために、単独または組み合わせて、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子のいずれかの発現の調節に依存しています。マウスへの初代または確立された腫瘍細胞株の注射も行われる。ヒトまたはマウスを含む他の動物種からの細胞株または組織のいずれかの導入は、依然としてin vivoで最も広く使用されている癌のモデルである。免疫不全マウスにおける異種(異種移植片)由来の細胞および組織の使用は、最も一般的に行われている2。しかしながら、宿主およびレシピエントの両方が同じ種のものである同種移植腫瘍細胞または組織の使用は、同系系において同じ宿主マウス系統と組み合わされたときに無傷の免疫系との相互作用を可能にする3。
原発性骨腫瘍または固形腫瘍からの骨転移は、痛みを伴う溶骨性、骨芽細胞性、または混合骨溶解性/骨芽細胞性病変をもたらします3,4。これらの腫瘍は骨構造を損ない、病的骨折のリスクを高め、患者に限られた治療選択肢を残します。原発性骨腫瘍は遠隔臓器に転移し、一部のタイプは他の骨格部位に広がる可能性があります。乳がん患者では、骨は最初の転移の最も一般的な部位であり、転移性疾患の最も頻繁な最初の症状部位です5,6。さらに、播種性腫瘍細胞(DTC)は、他の臓器の転移の診断前に骨髄に存在し、その発症を予測します7。したがって、骨に存在する癌細胞は、最終的に他の臓器系に転移する細胞の源であると考えられています。固形腫瘍転移の多くのマウスモデルが存在し、主に肺およびリンパ節に転移を発症し、腫瘍の種類および注射技術によっては、潜在的に他の臓器系3。しかし、骨転移のマウスモデルは、マウスが原発腫瘍量または他の臓器への転移からの早期除去基準に達する前に、部位特異的な骨格転移を確実に再現可能に生じ、骨転移を発症するモデルを欠いている。我々は、マウスの近位脛骨への固形腫瘍同種移植の外科的移植に依存する原発性骨腫瘍骨肉腫のモデルを報告した8。骨腫瘍はマウスの100%で形成され、88%が肺転移を発症しました。この転移の発生率は、臨床的に一般的に報告されているもの(~20-50%)を超えていますが、肺が骨肉腫の最も一般的な転移部位であるため、非常に興味深いものです9,10,11。このモデルは原発性骨腫瘍のモデリングに有利ですが、乳房、肺、前立腺、甲状腺、肝臓、腎臓、胃腸腫瘍などの他の骨刺激性固形腫瘍からの骨転移のモデリングにも大きな有用性があります。
このモデルの開発の理論的根拠は、原発性骨腫瘍または骨転移をモデル化するために、典型的には近位脛骨または遠位大腿骨への従来の骨内注射に代わるものを開発することでした12。私たちの主な目標は、この技術の既知の制限、すなわち肺の腫瘍塞栓術を軽減することでした。これは、これらの塞栓性腫瘍細胞の生着と、肺に転移する確立された原発性骨腫瘍からの完全な転移カスケードを再現しない「人工性転移」をもたらします8,13。これは、確立された骨転移が離れた部位に広がる場合の状況でもあります。さらに、この技術は、同所性または血管内注射技術と比較して、骨内および均一な部位での腫瘍の生着および成長の発生率を高める骨転移のモデルを作成するためにも開発されました。このモデルには、これらの説明されている手法に比べて明確な利点があります。このモデルには、骨への腫瘍細胞の制御された一貫した送達が含まれます。また、肺塞栓術後の人工肺転移を回避し、ベースラインの均一な研究集団を確立します。このモデルでは、原発腫瘍や他の臓器への転移に起因する早期除去基準のリスクなしに、部位特異的腫瘍の利点があります。最後に、このモデルは、患者由来の異種移植片の使用を含む、変更のための大きな有用性を有する。
提示されたモデルは、外科的アプローチの後に骨に直接細胞懸濁液注入を行い、その後皮質を介して注入するか、皮質に小さな欠陥を作った後に骨髄腔に送達するのと類似しています(髄腔のリーマ化の有無にかかわらず)8,14,15,16,17 .ただし、腫瘍同種移植片の移植により、この手法は明らかに異なります。したがって、このレポートの目的は、前述のモデルの多くの制限を克服する原発性骨腫瘍と固形腫瘍からの骨転移のこのモデルを実証することでした。細胞培養、マウスモデル、マウス麻酔と手術、マウス解剖学の経験を持つ研究グループは、マウスの原発性骨腫瘍または骨転移をモデル化する技術を再現するための設備が整っています。

<table><tbody><tr><td>#15メスの刃</td><td>ヘンリー・シャイン社</td><td>75614</td><td>なし</td></tr><tr><td>6ウェル組織培養プレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10578911</td><td>腫瘍片のミンチに使用されます。細胞培養にも使用できます</td></tr><tr><td>エイブラムス骨肉腫細胞株</td><td>該当</td><td>なし 該当なし</td><td>なし</td></tr><tr><td>イソフルラン気化器と酸素タンクを備えた麻酔器</td><td>VetEquip</td><td>901805</td><td>なし</td></tr><tr><td>動物体重計</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>SCL- 1015</td><td>なし</td></tr><tr><td>BALB/c ヌードマウス (nu/nu)</td><td>Charles River Ltd.</td><td>NA</td><td>生後6-8週齢。オスまたはメス</td></tr><tr><td>マウス ボーンセメント</td><td>Depuy Synthes 160504</td><td></td><td>骨ワックスの代わりにオプション使用</td></tr><tr><td>ボーンワックス</td><td>Ethicon</td><td>W31G</td><td>オプション</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Animalcare Ltd.</td><td>N/A</td><td>Buprecare 0.3 mg/ml 犬と猫のための注射用溶液</td></tr><tr><td>二酸化炭素安楽死ステーション</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>動物施設内に設けるべき</td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーターは 37°C に設定;C and 5% carbon dioxide</td><td>Heraeus</td><td>Various</td><td>None</td></tr><tr><td>Chlorhexidine surgical scrub</td><td>Vetoquinol</td><td>411412</td><td></td></tr><tr><td>None Cryovials (2 ml)</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>5000-0020</td><td>腫瘍断片を凍結保存する場合はオプション</td></tr><tr><td>D-ルシフェリン(ホタル)、カリウム塩</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td>目的の細胞株が生物発光レポーター遺伝子を持っている場合はオプション</td></tr><tr><td>デジタルノギス</td><td>Mitutoyo</td><td>500-181-30</td><td>手動にすることができます</td></tr><tr><td>デジタルマイクロラジオグラフィーキャビネット</td><td>Faxitron Bioptics, LLC</td><td>MX-20</td><td>腫瘍増殖に対する骨の反応を評価するオプション</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td> <td>シグマ・アルドリッチ</td><td>1371171000</td><td>腫瘍片を凍結保存する場合</td></tr><tr><td>Dulbecco'修正されたイーグル」s medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>なし</td></tr><tr><td>エタノール (70%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2483</td><td>なし</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td>なし</td></tr><tr><td>鉗子, Dumont</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11200-33</td><td>フリー</td></tr><tr><td>ザーなし (&ndash; 80 °;C)</td><td>Sanyo</td><td>MDF-794C</td><td>腫瘍の断片を凍結保存またはスナップ凍結する場合、オプション</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11704939</td><td>利用可能な場合は、自動セルカウンターも使用できます</td></tr> 皮<tr><td>下注射針(27ゲージ)</td><td>Henry Schein Ltd.</td><td>DIS55510</td><td>25G(DIS55509)と30G(カタログDIS599)の針も使用できます</td></tr><tr><td>氷</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>注射器と細胞懸濁液保存用の容器に入った小片が理想</td></tr>的 <tr><td>アイリスはさみ</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>14084-08</td><td>なし</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ヘンリー シャイン 株式会社</td><td>1182098</td><td>なし</td></tr><tr><td>IVIS Lumina III 生物発光/蛍光イメージングシステム</td><td>パーキン・エルマー</td><td>CLS136334</td><td>目的の細胞株が生物発光または蛍光レポーター遺伝子を有する場合</td></tr><tr><td>オプション L-グルタミン</td><td>サーモフィッシャー scientifc</td><td>25030081</td><td>なし</td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>British Oxygen Corporation</td><td>NA</td><td>腫瘍断片を凍結保存またはスナップ凍結する場合はオプション</td></tr><tr><td>液体窒素デュワー、5リットル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>TY509X1</td><td>腫瘍片を凍結保存する場合、マ</td></tr><tr><td>トリゲル&reg;マトリックスGFR、LDEVフリー、5ml</td><td>Corning Life Sciences</td><td>356230</td><td>オプション。10mlサイズでも利用可能(354230)</td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>75002549</td><td>ペレット細胞 1200rpmで5〜6分間</td></tr><tr><td>フロスティ冷凍封じ込め装置</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10110051</td><td>腫瘍の断片を凍結保存する場合オプション</td></tr><tr><td>NAIR脱毛剤ローション/オイル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC0132811</td><td>代わりに、細かい刃の電気クリッパーを使用できます</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>なし</td></tr><tr><td>メスの柄、#7 Short</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>10007-12</td><td>ユーザーの好み #15 メス刃</td></tr><tr><td>小動物用加熱パッド</td><td>VetTech</td><td>HE006</td><td>なし</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>GT Vision Ltd.</td><td>H600BV1</td><td>なし</td></tr><tr><td>滅菌済みリン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>10010023</td><td>注射用および外科用スクラブの一部として、クロルヘキシジンと交互に使用</td></tr><tr><td>組織接着剤(滅菌)</td><td>3M Corporation</td><td>84-1469SB</td><td>代わりに非吸収性皮膚縫合糸(6-0サイズ)を使用することができます</td></tr>トリ<tr><td>パンブルー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>5250061</td><td>なし</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25300054</td><td>0.05%-0.25%</td></tr><tr><td>ツベルクリンシリンジ(0.1mlグラデーションで1ml)</td><td>ベクトンディキンソン</td><td>309659</td> ルアーベント組織培養フラスコ<td>よりも好ましいスリップチップ</td></tr><tr><td>、T-75</td>コー<td>ニングライフサイエンス</td><td>CLS3290</td><td>必要に応じて、小型または大型のフラスコを使用することもできます</td></tr></tbody></table>

固形腫瘍移植による骨原発性骨腫瘍と骨転移のモデリング

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

原発性骨腫瘍または固形腫瘍からの骨転移は、痛みを伴う骨溶解性、骨芽細胞性、または混合骨溶解性/骨芽細胞性病変をもたらします。これらの病変は骨構造を損ない、病的骨折のリスクを高め、患者に限られた治療選択肢を残します。原発性骨腫瘍は遠隔臓器に転移し、一部のタイプは他の骨格部位に広がる可能性があります。しかし、最近の証拠は、多くの固形腫瘍では、骨に転移した癌細胞が、最終的に他の臓器系に転移する細胞の主要な供給源である可能性があることを示唆しています。原発性骨腫瘍のほとんどの同系または異種移植マウスモデルは、腫瘍細胞懸濁液の骨内(同所性)注射を伴う。固形腫瘍からの骨格転移の一部の動物モデルも直接骨注入に依存していますが、他のモデルでは、細胞を血管内または原発腫瘍の臓器に注入することにより、骨転移カスケードの追加ステップを再現しようとします。しかし、これらのモデルはいずれも、確実に、または100%の発生率で骨転移を発症しません。さらに、腫瘍細胞の直接骨内注射は、肺の潜在的な腫瘍塞栓術と関連していることが示されている。これらの塞栓性腫瘍細胞は生着しますが、転移性カスケードを再現しません。今回われわれは,新鮮または凍結保存された腫瘍片(腫瘍細胞と間質からなる)を低侵襲手術を用いて近位脛骨に直接移植した骨肉腫のマウスモデルについて報告した。これらの動物は、再現可能な生着、成長、そして時間の経過とともに、骨溶解および肺転移を発症した。この技術は、固形腫瘍の骨転移をモデル化するために使用できる汎用性を備えており、光学的または高度なイメージングによって追跡できる1つまたは複数の細胞型、遺伝子組み換え細胞、患者由来の異種移植片、および/または標識細胞からなる移植片を容易に使用できます。本稿では,骨への固形腫瘍移植を用いて原発性骨腫瘍と骨転移をモデル化し,この手法を実証する.

肯定的な結果は、腫瘍の生着と時間の経過に伴う進行性の腫瘍の成長に関連しています。腫瘍の種類によっては、骨内腫瘍の成長が進行性後肢の跛行と関連している可能性がありますが、多くの腫瘍は付随する骨疾患の兆候にもかかわらず跛行を引き起こしません。生着の成功は高度なイメージングで文書化され、目的の細胞株の骨表現型(溶骨性、骨芽細胞性、または混合骨溶解性/骨芽細胞性転移)に関連する近位脛骨に進行性のX線写真、μCT、またはμMRIの変化があります(図1)8。前回の報告では,移植後1週間で近位脛骨に皮質欠損が認められた(図1A)。2週目までに、皮質欠損に隣接して目に見える骨溶解および骨リモデリングがあった。2〜5週目から、進行性の骨破壊と、腫瘍の生着と成長に関連する新しい骨の形成がありました(図1B-E)。レポーター遺伝子を持つ細胞株の場合、骨の変化は、時間の経過に伴う蛍光または生物発光イメー...

骨転移モデルは、一様に転移を発症したり、発生率が100%であったりすることはありません。骨内腫瘍細胞を直接注射すると、肺の塞栓術を引き起こす可能性があります。固形腫瘍移植による骨への移植を用いて原発性骨腫瘍と骨転移をモデル化し,再現性のある生着と成長に導く技術を紹介します。

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

この研究では、固形腫瘍移植片を骨に留置することにより、原発性骨腫瘍または骨転移を柔軟に作成できます。この技術は、骨に腫瘍細胞懸濁液を注入することからの脱却です。この方法は、腫瘍細胞懸濁液注射肺塞栓の制限を克服します。また、自然発生的な骨転移や血管内細胞注入後と比較して、より均一なモデルを作成できるという利点もあります。固形腫瘍移植片移植に基づくと、ヒトやマウスのモデルを超えて可能性が存在しますが、患者由来の異種移植片を使用することで、特定の患者に合わせた治療につながる可能性があります。主な焦点は、腫瘍微小環境、転移、創薬、がん遺伝学、精密医療などのがん研究での使用です。視覚的なデモンストレーションは、皮下腫瘍の作成、腫瘍移植片の解剖と作成、および脛骨への外科的移植の主要なステップを示すための鍵です。皮下腫瘍導入のためには、適切な細胞解離溶液を用いて目的の細胞株を採取し、細胞を10〜5番目の細胞の1〜2倍で100〜150マイクロリットルの無菌PBS濃度に再懸濁する。細胞を氷の上に置きます。露出した皮膚を70%エタノールで洗浄し、27ゲージの針を備えたツベルクリン注射器に細胞をロードします。次に、肩甲骨の動きの影響を受けない消毒された皮膚の領域に細胞を皮下注射します。背側胸部または腹部を覆う皮下腫瘍のサイズを監視するためにキャリパーを使用し、毎週動物の体重を測定して、腫瘍が潰瘍化しないこと、またはマウスが施設動物管理および使用委員会によって確立された早期除去基準を満たしていないことを確認します。腫瘍が任意の寸法で15ミリメートルに達した場合は、70%エタノールを使用して皮膚を滅菌し、15メスを使用して腫瘍の上にある皮膚を切開します。滅菌外科用ハサミを使用して、周囲の付着軟部組織から腫瘍を鋭く解剖し、腫瘍を完全な増殖培地を含む6ウェルプレートの1つのウェルに入れます。メスを使用して腫瘍を適切なサイズの断片にミンチし、その断片を室温で滅菌した完全増殖培地の新しい容器に入れます。凍結保存のためには、20%ウシ胎児血清と10%ジメチルスルホキシドを添加した完全増殖培地で、単一のクライオバイアルに複数のフラグメントをプールし、マイナス80°Cの市販の凍結保存システムを使用して組織を徐々に凍結してから、液体窒素で長期保存します。腫瘍の断片をその後の分析のために保存し、将来の移植のために保存しないようにするには、液体窒素浸漬によってサンプルをスナップ凍結し、凍結した腫瘍の断片を摂氏マイナス80度で長期保存します。腫瘍片の皮下移植の場合は、まず腫瘍片懸濁液を室温に戻します。次に、麻酔を施したレシピエントマウスでペダル反射に対する反応の欠如を確認し、鎮痛剤を皮下投与します。皮膚への潜在的な外傷を最小限に抑えるために、脱毛クリームを使用して、接続された後肢の右膝関節と近位脛骨の毛を取り除きます。露出した皮膚を70%エタノールでこすり洗いし、続いてクロルヘキシジンと生理食塩水のスクラブを交互にこすります。関節を曲げて伸ばしながら、近位脛骨を膝関節のすぐ遠位の領域として視覚化し、15メスの刃を使用して、皮膚と皮下組織を通じて手足の内側の近位脛骨のレベルで3〜4ミリメートルの切開を作成し、近位脛骨の内側皮質を露出させます。近位脛骨の内側皮質に小さな穴を開けるには、25ゲージの針の先端を使用して、先端を膝関節から約2ミリメートル遠位、頭蓋脛骨皮質と尾脛骨皮質の間で等距離に回転させながら穏やかな圧力をかけます。穴が開いたら、滅菌鉗子または27〜30ゲージの針を使用して、近位脛骨の髄腔に最低0.5立方ミリメートルの腫瘍片を挿入し、27〜30ゲージの針を使用して腫瘍の断片を髄管に操作します。すべての断片を配置した後、皮膚の端を適切な材料で対抗させ、歩行可能になるまで監視しながら動物をケージに戻します。次に、毎週のデジタルX線撮影、生物発光、または蛍光イメージングにより、脛骨腫瘍の成長を非侵襲的に評価し、ノギスを使用して移植部位の四肢を測定します。成功した生着は、高度なイメージングで記録できます。この代表的な解析では、腫瘍移植移植のために生じた皮質欠損が、移植後1週間で近位脛骨に認められました。2週目までに、皮質欠損に隣接する目に見える骨溶解と骨のリモデリングが観察されました。2週目から5週目にかけて、腫瘍の生着と成長に関連する追加の進行性骨破壊と新しい骨の形成が起こりました。近位脛骨に小さな穴を開ける際には注意が必要です。針先が作業を行うことができるように、穏やかな圧力から最小限の圧力で先端を回転させることに頼ります。この手順に続いて、他の骨部位への腫瘍移植片の配置、細胞外マトリックス中のオルガノイドまたは腫瘍細胞の骨欠損への配置、またはイメージングに加えて分子および組織学的分析を行うことができます。

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固形腫瘍移植による骨原発性骨腫瘍と骨転移のモデリング

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