固形腫瘍移植による骨原発性骨腫瘍と骨転移のモデリング

この研究では、固形腫瘍移植片を骨に留置することにより、原発性骨腫瘍または骨転移を柔軟に作成できます。この技術は、骨に腫瘍細胞懸濁液を注入することからの脱却です。この方法は、腫瘍細胞懸濁液注射肺塞栓の制限を克服します。

また、自然発生的な骨転移や血管内細胞注入後と比較して、より均一なモデルを作成できるという利点もあります。固形腫瘍移植片移植に基づくと、ヒトやマウスのモデルを超えて可能性が存在しますが、患者由来の異種移植片を使用することで、特定の患者に合わせた治療につながる可能性があります。主な焦点は、腫瘍微小環境、転移、創薬、がん遺伝学、精密医療などのがん研究での使用です。

視覚的なデモンストレーションは、皮下腫瘍の作成、腫瘍移植片の解剖と作成、および脛骨への外科的移植の主要なステップを示すための鍵です。皮下腫瘍導入のためには、適切な細胞解離溶液を用いて目的の細胞株を採取し、細胞を10〜5番目の細胞の1〜2倍で100〜150マイクロリットルの無菌PBS濃度に再懸濁する。細胞を氷の上に置きます。

露出した皮膚を70%エタノールで洗浄し、27ゲージの針を備えたツベルクリン注射器に細胞をロードします。次に、肩甲骨の動きの影響を受けない消毒された皮膚の領域に細胞を皮下注射します。背側胸部または腹部を覆う皮下腫瘍のサイズを監視するためにキャリパーを使用し、毎週動物の体重を測定して、腫瘍が潰瘍化しないこと、またはマウスが施設動物管理および使用委員会によって確立された早期除去基準を満たしていないことを確認します。

腫瘍が任意の寸法で15ミリメートルに達した場合は、70%エタノールを使用して皮膚を滅菌し、15メスを使用して腫瘍の上にある皮膚を切開します。滅菌外科用ハサミを使用して、周囲の付着軟部組織から腫瘍を鋭く解剖し、腫瘍を完全な増殖培地を含む6ウェルプレートの1つのウェルに入れます。メスを使用して腫瘍を適切なサイズの断片にミンチし、その断片を室温で滅菌した完全増殖培地の新しい容器に入れます。

凍結保存のためには、20%ウシ胎児血清と10%ジメチルスルホキシドを添加した完全増殖培地で、単一のクライオバイアルに複数のフラグメントをプールし、マイナス80°Cの市販の凍結保存システムを使用して組織を徐々に凍結してから、液体窒素で長期保存します。腫瘍の断片をその後の分析のために保存し、将来の移植のために保存しないようにするには、液体窒素浸漬によってサンプルをスナップ凍結し、凍結した腫瘍の断片を摂氏マイナス80度で長期保存します。腫瘍片の皮下移植の場合は、まず腫瘍片懸濁液を室温に戻します。

次に、麻酔を施したレシピエントマウスでペダル反射に対する反応の欠如を確認し、鎮痛剤を皮下投与します。皮膚への潜在的な外傷を最小限に抑えるために、脱毛クリームを使用して、接続された後肢の右膝関節と近位脛骨の毛を取り除きます。露出した皮膚を70%エタノールでこすり洗いし、続いてクロルヘキシジンと生理食塩水のスクラブを交互にこすります。

関節を曲げて伸ばしながら、近位脛骨を膝関節のすぐ遠位の領域として視覚化し、15メスの刃を使用して、皮膚と皮下組織を通じて手足の内側の近位脛骨のレベルで3〜4ミリメートルの切開を作成し、近位脛骨の内側皮質を露出させます。近位脛骨の内側皮質に小さな穴を開けるには、25ゲージの針の先端を使用して、先端を膝関節から約2ミリメートル遠位、頭蓋脛骨皮質と尾脛骨皮質の間で等距離に回転させながら穏やかな圧力をかけます。穴が開いたら、滅菌鉗子または27〜30ゲージの針を使用して、近位脛骨の髄腔に最低0.5立方ミリメートルの腫瘍片を挿入し、27〜30ゲージの針を使用して腫瘍の断片を髄管に操作します。

すべての断片を配置した後、皮膚の端を適切な材料で対抗させ、歩行可能になるまで監視しながら動物をケージに戻します。次に、毎週のデジタルX線撮影、生物発光、または蛍光イメージングにより、脛骨腫瘍の成長を非侵襲的に評価し、ノギスを使用して移植部位の四肢を測定します。成功した生着は、高度なイメージングで記録できます。

この代表的な解析では、腫瘍移植移植のために生じた皮質欠損が、移植後1週間で近位脛骨に認められました。2週目までに、皮質欠損に隣接する目に見える骨溶解と骨のリモデリングが観察されました。2週目から5週目にかけて、腫瘍の生着と成長に関連する追加の進行性骨破壊と新しい骨の形成が起こりました。

近位脛骨に小さな穴を開ける際には注意が必要です。針先が作業を行うことができるように、穏やかな圧力から最小限の圧力で先端を回転させることに頼ります。この手順に続いて、他の骨部位への腫瘍移植片の配置、細胞外マトリックス中のオルガノイドまたは腫瘍細胞の骨欠損への配置、またはイメージングに加えて分子および組織学的分析を行うことができます。