Name: グノトビオティック・アメリカン・ゴキブリの設立と維持 (ペリプラネタ・アメリカーナ) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 学ぶ、卵鞘の表面滅菌を用いたグノトビオティック・アメリカン・ゴキブリの設立と維持法。Periplaneta americanaを用いて腸内微生物叢の宿主健康への影響を研究し、低コストで再現性の高い実験系を構築できます。

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本書は、国立衛生研究所の国立総合医学研究所が、受賞番号R35GM133789の下で支援を受けました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。著者らは、生殖不能率、ハッチ率、及び生殖神経ゴキブリの増殖率を追跡したジョゼイ・ダイアーを認めさせたい。

1. 材料の準備
<ol><li>ストックゴキブリ文化の維持 注:これらの堅牢な昆虫を飼育する多くの方法があります。避難所と水を提供する際の詳細は、アクセス可能な材料(すなわち、段ボールチューブの代わりに卵のカートン)によって異なる場合があります。次の滅菌プロトコルは、任意のストックタンクのセットアップに対して動作します。<ol>
<li>37.85 L (10 ガロン) の魚のタンクに十分なウッドチップの寝具を広げて、約 1 インチの寝具でタンクの底を覆います。(平らな)段ボールを2分の4に切って住宅を準備します。段ボールの管(例えば、トイレットペーパーチューブ)とタンクの一端に積み重ね管に段ボール片を挿入する(図1)。</li>
		<li>昆虫の脱出を防ぐために、タンクの内側の上2インチに石油ゼリーの薄い層を塗ります。 注:タンクの角の内側を適切にコーティングしてください。</li>
		<li>以前のストックタンクから(占有された)段ボールチューブを転送してゴキブリを追加し、住民を解放するためにそれらを振ります。各転送のために、100-200混合年齢、混合セックスゴキブリを移動します。ドッグフード(20~30個)を加え、タンク内のドッグフードの量を監視し、低いときに補充します。</li>
		<li>水皿をセットする。<ol>
<li>小さなプラスチック製の再利用可能な食品容器に二重蒸留水(ddH2O)を充填します。食品容器の蓋にセルローススポンジと穴をほぼ同じ大きさに切ります。 注:セルローススポンジは、ゴキブリが水皿に溺れるのを防ぎます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>蓋の穴にスポンジを挿入し、充填された容器の上に蓋を置きます。容器をタンクに入れ、低い時に補充します。綿布でタンクを覆い、弾性バンドで所定の位置に固定します。</li>
		<li>タンクが過剰な量のフレームや昆虫の死骸を蓄積し始めると、新しいタンクを設置し、ゴキブリを移送します。 注:タンクは通常6ヶ月ごとに転送されます。廃炉ストックタンク内の残りのゴキブリ/卵は、1時間-20°Cで凍結することによって安楽死させられ、ストックタンクの内容物は、その後、オートクレーブバッグに移され、処分前にオートクレーブ(1時間、重力サイクル)に移されます。ストックタンクは、使用間に2%の漂白剤で滅菌されます。</li>
	</ol></li>
	<li>二次容器を消毒する。 注:このコンテナにはフィルタは含まれていませんが、代わりに無料の空気交換が可能です。<ol>
<li>蓋と底の両方の内側に2%の漂白剤をスプレーし、10分間浸します。きれいなペーパータオルで漂白剤を拭き取ります。</li>
		<li>蓋の内側と底部に70%のエタノールをスプレーし、清潔なペーパータオルで拭きます。使用するまで蓋を交換してください。</li>
	</ol></li>
	<li>卵や住宅のニンフをインキュベートするためのBHIスラントとフラスコを作ります。<ol>
<li>パッケージの指示に従ってBHIを準備し、2%寒天を追加します。明確になるまでBHI-寒天溶液を沸騰させます。</li>
		<li>スラントの場合は、5 mLアリコートを18 mm x 150 mmガラス試験管とキャップに移します。オートクレーブ(滅菌時間=20分、液体サイクル)を介して滅菌します。45°の角度でオートクレーブチューブを置き、スラントに冷却します。固めたら、乾燥を防ぐために使用するまで冷蔵する。</li>
		<li>フラスコの場合、煮たBHI寒天溶液の10 mLアリコートを250 mLのエルレンマイヤーフラスコに移し、フラスコの底部を完全に覆います。フラスコをホイルで覆い、オートクレーブ(20分、液体サイクル)で滅菌します。オートクレーブフラスコを冷却し、乾燥を防ぐために使用するまで冷蔵します。 注: このセットアップにはエアフィルタは必要ありません。ホイルカバーは、オープンエアフローからの汚染を防止しながらガス交換を可能にするのに十分です。</li>
	</ol></li>
	<li>オートクレーブを介して殺菌:ホイルで覆われたビーカー(滅菌時間= 1時間、重力サイクル)で半サイズ(約1/2インチ)に分割されたオートクレーブ可能なラットチャウ、キャップボトルのddH2O(滅菌時間= 20分、液体サイクル)、およびホイルで覆われたビーカーの鉗子(滅菌時間= 20分、重力サイクル)。 注:ラットチャウビーカーをオーバーフィルしないでください。ペレットはオートクレーブで膨らむ。</li>
	<li>「産科病棟」タンクを設置する。 注:このタンクにはストックタンク(段ボールチューブ、スポンジ付きの水皿、ドッグフード、ウッドチップ寝具、 図1参照)と同じ材料が含まれており、oothecaeコレクションのために転送されない限り、ゴキブリは空でなければなりません(セクション2参照)。</li>
	<li>過飽和塩化ナトリウム(NaCl)溶液を満たしたビーカーを調製して、インキュベーターを加湿します。この溶液を調製し、DDH2Oの100mLあたり37gのNaClを加え、溶解するまで撹拌します。 注:通常、500 mLの飽和塩溶液は、通常、チャンバー寸法51cm x 46 cm x 46 cm(H x W x D)を加える前に、約1ヶ月間、培養器を湿気させます。</li>
</ol>2. オテカエのコレクション
<ol><li>ウーテカイ(図2)を運ぶ女性(計画実験に応じて任意の数)をストックタンクから「産科病棟」に移し、鉗子を使用して、グラビドメスを含む段ボールチューブを移動します。<ol>
<li>車のチューブにグラビドメスに加えて複数の昆虫が含まれている場合は、まずチューブを振り出して石油ゼリーで鳴らされた追加のプラスチック容器に入れ、次にターゲット昆虫が一人で段ボールチューブに戻るように促します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>彼らは彼らのオテカイを落とした後、ストックタンクに戻って女性を転送します。鉗子でタンク内のごみからオテカエを取り出します。 注:オテカエは、多くの場合、転送されている女性の24時間以内にドロップされます。</li>
</ol>3. オテカエの洗浄
<ol><li>3 mLのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む5mL遠心分離管にオテカエを加えます。10 sのための渦。新鮮なSDSを含む遠心管で2回目の洗浄ステップを繰り返します。 注:SDSの3 mLあたり最大5つのオテカエを使用することができます。</li>
	<li>繊細な作業ワイプを使用して、各オテカの表面を静かにこすって破片を取り除きます。徹底的なクリーニングを支援するために、より多くのSDSを追加することができます。洗浄されたオテカエを計量艇に入れ、殺菌の準備が整うまで置きます。 注: プロトコルはここで一時停止する場合がありますが、oothecae を長期間(数日から数週間)低湿度環境に放置すると、脱水症状が発生し、生存率が失われます。</li>
</ol>4. オテカエの殺菌とインキュベーション
<ol><li>滅菌後の水のアリコート滅菌水滅菌されるすべてのオテカのために、滅菌水の1 mLで2つの1.5 mL遠心分離管を充填します。</li>
	<li>濃縮物を10μL加える(32%)5 mL 遠心分離管内の 3.2 mL の ddH2O に対する過酢酸ストック溶液を、殺菌用の 0.1% 溶液を作成します。キャップと反転を数回混合します。 注意:過酢酸は皮膚や肺と接触して有害です。ヒュームフードで希釈します。 注:これは、殺菌と同じ日に行う必要があります。あらかじめ希釈すると、溶液はすぐに分解され、適切に殺菌されません。5個もの洗浄済みオテカエを3.2mLの希酸で滅菌することができる。</li>
	<li>0.1%の過酢酸溶液に(最大5個)洗浄したオテカエを5分間入れます。チューブを60sごとに数回反転します。</li>
	<li>層流フードでは、滅菌鉗子を使用して、各オテカを、分け入れ菌リンス水を入れて独自の遠心管に移します(ステップ4.1)。ミックスするために数回反転します。2回目のすすいで繰り返し、滅菌鉗子を使用してそれぞれのリンスオテカを独自のBHI傾斜に移します。</li>
	<li>滅菌された二次容器にスラントを入れます。孵化するまで4〜5週間、30°Cの加湿インキュベーターに容器を移動します。 注:スラントは、小さな試験管ラックまたは中小ビーカーによって直立して保持することができます。</li>
	<li>スラントを定期的に確認します(週1-2倍)。寒天に真菌または細菌コロニーの成長が現れた場合は、汚染された傾斜を取り除きます。4週間のタイムポイントが近づくと、毎日スラントをチェックしてください。 注:一度孵化すると、ニンフはBHIだけで数週間まで生き残ることができますが、最適に成長しません。</li>
</ol>5. グノトビオティックニンフのメンテナンス
<ol><li>層流フードでは、無菌鉗子で調製されたBHIフラスコ(ステップ1.3.3から)に殺菌されたラットチャウのペレットを無菌的に移す。滅菌性チェックとして、フラスコを24時間30°Cインキュベーターの二次容器に入れ、増殖が現れる場合は使用しないでください。</li>
	<li>無菌食品ペレットでBHIフラスコにニンフを加えます。BHIの傾斜からそれらを振り、彼らはラミナーフローフードでフラスコに落ちてみましょう。 注:ニンフは試験管のガラス壁に牽引力を持っていません。チューブを振って傾斜部分からノックオフし、チューブを傾け、ガラスをフラスコに滑り込まさせるのが効果的です。ニンフは鉗子を使って移すことができるが、致命的な傷害のリスクは高い。</li>
	<li>フラスコのBHI床に直接ピペットを入れ、ラミナーフローフードで週に1回300 μLの無菌水を水にします。</li>
	<li>ニンフフェックがBHI床を覆い始めると、新しいBHIフラスコに移し、ステップ5.1のように(滅菌を検証するために)事前に殺菌されたラットチャウ24時間を加える。</li>
</ol>6. 無菌の品質管理
<ol><li>制限フラグメント長ポリモーフィズム(RFLP)を介してグノトビオティック状態の培養に依存しない品質管理チェックのために犠牲にするためにBHIフラスコから1つのニンフを取り除きます。これを行うには、無菌遠心分離管(ステップ5.1からのニンフの移動に似ています)にニンフを注ぐか、無菌木製アプリケーターをフラスコに入れ、ニンフが登り始めるのを待ってから遠心分離管に移します。</li>
	<li>遠心管のニンフに0.5mのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え、すべての大きな部分が分解されるまで無菌マイクロペステスルで均質化します。渦はよく。</li>
	<li>細菌DNA抽出キット(材料表)を用いて、ニンフホモジネートからDNAを抽出します。<ol>
<li>5,000 x g で10分間均質化されたニンフを遠心分離し、上清を取り除きます。サーマルシェーカーを37°Cに予熱します。</li>
		<li>1x Tris-EDTAを100 μL、渦を加え、ペレットを完全に再懸濁します。10 μLのリソチームを加えて混ぜ、次に予熱した37°Cサーマルシェーカーで30分(揺れなし)インキュベーションを行います。</li>
		<li>サンプルに25mgのガラスビーズを加え、最大速度で5分間渦を加えます。サーマルシェーカーを55°Cに予熱します。</li>
		<li>100 μL のプロテナーゼ K バッファーと 20 μL のプロテナーゼ K. ボルテックスを使用して新しい 1.5 mL 遠心分離管に上清を移す前にビーズを落ち着かせるようにします。</li>
		<li>インキュベートは、600rpmで振盪し、55°Cのサーマルシェーカーで60分間行う。2分間10,000xgで遠心分離機、上清を新しい1.5 mL遠心管に移します。サーマルシェーカーを65°Cに予熱します。 溶出バッファーを 65 °C ハイブリダイゼーションオーブンで予熱します。</li>
		<li>220 μLのエタノールを100%加えます。20 sの最高速度で渦。10倍上下にピペットを入れて、目に見える沈殿物を分解します。</li>
		<li>DNAカラムを2mLの採取チューブに挿入し、形成した可能性のある任意の沈殿物を含むカラムにサンプルを移す。10,000 x g で1分間遠心分離機を、回収管から濾液を捨てて、回収管を交換してください。</li>
		<li>500 μL の結合バッファーをカラムに加え、遠心分離機を 10,000 x g で 1 分間追加します。コレクションチューブから濾液を捨て、回収管を交換してください。</li>
		<li>カラムに700μLのDNA洗浄バッファーを加え、遠心分離機を10,000 x g で1分間追加します。コレクションチューブから濾液を捨て、回収管を交換してください。2回目の洗浄手順を繰り返します。</li>
		<li>遠心分離機空柱を2分間乾燥させ、その後新しい1.5 mL遠心分離管に移した。50 μLの予熱溶出バッファーをDNAカラムマトリックスに直接加え、65°Cで5分間インキュベートします。</li>
		<li>10,000 x g で遠心分離機を1分間に溶出する。分光光度測定またはフルオロメトリーを介して濾液中の抽出DNAを定量化する。</li>
	</ol></li>
	<li>16S遺伝子全体を増幅して消化する。ゲル電気泳動を用いてフラグメントを可視化する。<ol>
<li>2xマスターミックスの12.5 μL、各プライマー1492R(5'-GGTTACCTGTTACGACTT)および27F(5'-AGAGTTTTGTCCGGCTCTCAG)、5 ngのDNA、および分子グレードの水を使用して25μLの総反応量を達成します。</li>
		<li>次のサーモサイクラープログラムを実行します: 60 sのための94 °C;続いて、30 sの94°Cの35サイクル、45sの50°C、90sのための68°Cが続きます。68°Cを5分間続く。</li>
		<li>DNA精製キット(材料表)を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)製品を精製する。<ol>
<li>PCR産物に120μLの精製バッファーを加え、混合する渦を加えます。蓋の中に液滴を集めるために簡単に遠心分離機。DNAカラムを2mLの回収チューブに挿入し、調製したカラムに液体を移し、13,000 x g で1分間遠心分離機≥。</li>
			<li>濾液を捨てて、回収管を交換してください。700 μL の DNA 洗浄バッファーと遠心分離機を ≥13,000 x g で 1 分間追加します。濾液を捨てて、回収管を交換してください。2回目の洗浄手順を繰り返します。</li>
			<li>2分間空の柱を乾燥させて新しい1.5 mL遠心管に移します。50 μLの予熱溶出バッファーをDNAカラムマトリックスに直接加え、室温で2分間インキュベートします。</li>
			<li>10,000 x g で遠心分離機を1分間に溶出する。分光光度測定またはフルオロメトリーを介して濾液中の抽出DNAを定量化する。</li>
		</ol>
</li>
		<li>精製PCR産物1μgを5μLの消化バッファー、10単位のRsaI、分子グレードの水に加え、総反応量50μLに加え、37°Cで60分間インキュベートします。</li>
		<li>2%アガロースゲル上で20μLの消化DNAを実行することにより、ゲル電気泳動で消化された製品を分離します。ゲルを視覚化して、グノトビオティックの状態を確認します。 注:グノトビオティック昆虫は、402 bp、201 bp、および163〜148bpのスミアのバンドを、endosymbiont、 ブラタバクテリウムの16S rDNA配列に基づいてのみ生じるべきである。ゲルに見られる余分なバンドは、微生物種を汚染していることを示しています。</li>
	</ol></li>
</ol>7. ニンフガルの成長の無菌追跡
<ol><li>フラスコの半透明のBHI床を通して昆虫を測定することによってニンフルの成長を追跡するために体長を記録する。 注:ニンフは、動きを遅くするために4°Cに15分間置き、測定しやすくすることができます。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示する利益相反を持っていません。

グノトビオゴキブリの生成を記述する他の方法は、オテカ科のコレクションを記述しなかったか、またはオテカエが母親23、25、26からいつ取り除くことができるかを示すために他のゴキブリ種に特有のベンチマークを使用した。もともと、ストックタンクのウッドチップ寝具からオテカエを回収し、非常に低いハッチレート(〜10%)を生み出した。非滅菌オーテカエ(47%)29と比較して。これは、孵化していないウーテカイがストックケージに時間の経過とともに蓄積し、oothecaの年齢や生存率を検証する方法がないためである可能性があります。「産科病棟」アプローチの実施は、既知の年齢の新しく堆積したオテカエの収集を可能にする。これは、研究者が個々のオテカエの可能性が高いハッチ時間を予測することができるので、実験計画をさらに容易にする。初期および公表されたプロトコルからの別の修飾は、過飽和塩化ナトリウム溶液を含む半密封室におけるオテカおよびニンフのインキュベーションを含む。溶液の存在は、約75%30の相対湿度を維持する。Oothecaeは30°Cで日常的にインキュベートされ、インキュベーションに必要な日数を最小限に抑える一方で、胚の生存率およびオオテカ31あたりに産生されるニンフの数を最大化することが示されている。孵化後、グノトビオティックニンフは実験室の室温と周囲の条件でベンチトップで日常的に培養されますが、湿度制御チャンバーは再び重要な実験に利用されます。これらの変更をオテカコレクションおよびインキュベーションに設定した後、ハッチレートは約41%(n = 51)に増加し、汚染によるウーテカを含まない。ハッチレートのさらなる最適化への潜在的な経路は、ウーテカの収集と滅菌の間の時間を延長することを含んでよい。卵ケースのキューティクルは、初期放出32で完全に日焼けしないことがあり、したがって、落とされた24時間以内に殺菌中に使用される溶液に透過性がある。
0.1%過酢酸を用いた殺菌プロトコルをDollらから適合させ、25.他の研究は、oothecae23、26を殺菌するための代替技術を文書化しています。汚染率は、BHI傾斜でオテカエをインキュベートする非破壊法に基づいています。このアプローチは、汚染されたオテカエの迅速な同定と除去を可能にするので非常に有利である。ほとんどの以前のプロトコルは、細菌学的培地上の便またはニンフホモゲネートをめっきし、成長22、23、25、27、28、33をチェックすることによって、伝道可能な生物をテストする。少なくとも1つのケースでは、gnotobioticの状態をテストするための方法は完全に説明されなかった26.ボトル24を飼育するために滅菌検査培地の小さなスラブを添加したクレイトンを除いて、以前の方法22、23は、最初に殺菌プロトコルを評価するために短期間だけ細菌学的培地上にグノトビオティック昆虫を収容した。
組み込みの品質管理措置としてBHI培地に生じるニンフのハウジングを継続することで、そのグノトバイオティクスの状態を半リアルタイムで監視することができます。これは、グノトビオティックニンフにアクセスする必要がある長期実験に特に有用です。ニンフの下のBHI床が細菌または真菌の成長で汚染されているように見える場合、フラスコは廃棄されるべきです。このタイプの汚染は、通常、水のニンフにフラスコを発見するときに発生しますが、不十分に殺菌されたオテカエまたは食品の場合には、便から生じる可能性もあります。水を入れる際の層流フードの使用は、フラスコの発見による汚染率を向上させます。
すべての汚染生物がBHI培地上で好気的に成長するわけではないので、無菌検査の追加の培養非依存的な方法が必要である。考えられるアプローチの 1 つは顕微鏡27ですが、このアプローチは労力を要する場合があります。他のプロトコルは、シーケンスベースの技術を使用して、文化14、23、27、28を逃れる可能性のある生物を検出します。しかし、このようなアプローチは、高スループットシーケンシングアプローチの結果が試薬34およびバーコードホッピング35の低レベル汚染によって容易に影響を受けやすいため、高価で解釈が困難であることが多い。代わりに、16S rRNA遺伝子のPCR増幅と制限断片長多型を組み合わせて、endosymbiontと汚染された腸の共生生物の両方を視覚化する新しいアプローチが開発されました。この技術には、ブラッタバクテリウムの16S遺伝子が配列決定されているため、内部PCRコントロールが含まれており、そのバンディングパターンは、グノトバイオティクスおよび非生殖昆虫の両方に存在すべきである。endosymbiontの制限パターンはそのゲノム配列36から予測することができるので、いかなる汚染物質の同定が望まなければ、アンプリコンまたは制限断片を配列する必要はない。このプロトコルの現行バージョンでは、PCR/RFLPに対してニンフを犠牲にすることが求められていますが、この技術は非破壊対策として便でも使用できます。しかし、それは、便が多くのBlattabacteriumを含んではならないので、組み込みのコントロールを含み込まない。
グノトビオティック動物を飼育する追加の簡単に変更可能でありながら重要なコンポーネントは、食事です。BHI寒天は昆虫の一時的な食料源として機能することができるが、長期間の唯一の食料源として使用すると、ニンフの間で実質的な成長赤字をもたらすことが判明した。多様な食事が試みられてきたが、オートクレーブ可能なラットチャウは、グノトバイオティクス昆虫の維持のための日常的な食事として推奨される。滅菌のために特別に処方されていない食事は、しばしば完全に無菌をレンダリングすることは困難であり、多くの無菌またはオートクレーブ可能な実験室動物の食事は、無菌状態下で急速な真菌の成長を示すことが判明した。この傾向は、非無菌状態下で分解する傾向があり、グノトビオティックと非グノトバイオティクスの昆虫を直接比較する実験では不適当でした。推奨される食事は、2つのグループ間の特性(例えば、成長率)の比較を促進する、gnotobioticと標準ニンフの間で一貫した食事を使用することを可能にします。
他の人が観察しているように 27,グノトバイオティクスニンフは、彼らの非生殖力の対応よりもゆっくりと成長します。.グノトビオティック(n = 105)と無菌ニンフ(n = 50)の体長を比較すると、同じ、オートクレーブげっ歯類の食事を与え、室温に保たれて、無菌ニンフは平均0.059 mm/日に成長し、グノトバイオティックニンフは0.028mm/日(p<000)成長することを明らかにする。P.アメリカーナにおける腸内微生物叢の存在は、昆虫の代謝率37を変化させると示されており、腸内群は一般的に栄養吸収38,39に影響を及ぼすと考えられている。これらの理由は、グノトビオティックと非生殖リンパの成長速度の観察された違いを支持する。
この技術の可能な制限は、最も古い無菌コホートが生後10ヶ月以上であり、体長40に近似された7番目のインスター(10のうち10個、成人期である11)に達しているので、グノトバイオティックニンフが性的成熟に達しない可能性があることである。これらの最も古いコホートは、オートクレーブラットダイエットではなく、照射されたラットチャウ、過剰なカビの成長なしに非生殖コホートに供給するにはあまりにも多くの水分を含む食事を食べます。無滅菌ドッグフードダイエットの無菌ニンフは、実験室の条件(室温と湿度)の下で9〜10ヶ月後に成人に達することが判明しました。共有されたオートクレーブラットチャウのグノトビオティックおよび非無菌ニンフのコホートは現在7ヶ月未満であり、無菌昆虫は7番目のインスター(平均:16.7mm)であると推定され、無菌昆虫は5番目のインスター(平均:11.2mm)であると推定される。その結果、私たちのグノトビオティックゴキブリが正常に再現できるかどうかをまだ確認することはできません。しかし、この方法を用いて新しいグノトビオティックコホートを確立できる容易さを考えると、この方法は、ノトビオティック昆虫の実証された再生がない場合でも大きな約束を示す。
結論として、このプロトコルは、マイクロバイオームの研究者が一般的な実験室材料を使用して独自の低コストのグノトビオティック「施設」を操作することを可能にする汎用性の高いツールを提供します。このアプローチは、宿主の挙動、免疫、発達、およびストレス応答21、26、27の形成における微生物叢の役割を調べる実験のためのグノトビオティックゴキブリを生成するために使用され得る。これらのグノトバイオティクス昆虫はまた、合成または異種生物群集を接種し、その後腸内微生物叢研究23,28の対象として使用することができる。さらに、このアプローチの要素は、組み込みの滅菌検査として細菌学的媒体に並んだインキュベーションチャンバーの使用を含め、他のモデルシステムに一般化可能であり、小規模な施設でのグノトビオティック動物の定期的なメンテナンスを容易にすることができる。

グノトビオティック動物は、マイクロバイオーム研究1、2、3のための非常に貴重なツールであることが証明されています。無菌および定義された植物相動物は、宿主免疫応答、腸上皮成熟、および宿主代謝1、4、5、6、7を含む宿主微生物相互作用の解明を可能にした。単純化されたコミュニティを接種したグノトビオティック動物はまた、腸内の微生物と微生物の相互作用、特に交差摂食および拮抗関係を解明する際に、8、9、10、11をより完全に理解するのを助けた。哺乳類の腸内微生物叢における研究のための現在の好ましいモデルシステムは、マウスモデルである。このシステムは、上記の発見において不可欠でしたが、重要な欠点は、関連するコストです。特別な装置と高度な訓練を受けた技術者は、グノトバイオティクス施設を設立し、維持する必要があります。これは、動物動物の動物維持のあらゆる側面に与えられなければならない特別な注意と組み合わせて、動物動物を標準的な動物モデル12よりも10〜20倍の費用がかかるグノトビオティック動物を引き起こす。高コストのため, 多くの研究者は、グノトビオティックマウスモデルを買う余裕がないかもしれません.さらに、マウスモデルは、人間の健康に翻訳することを探している研究のための最も広く受け入れられている選択肢かもしれないが、人間とマウスの間の多くの生理学的および形態学的な違いがあります 13.明らかに、腸内微生物叢の多くの側面に関する増え続ける質問に答えるのに十分な特異なモデルはありません。
昆虫モデルは、哺乳類の種と比較してメンテナンスコストが低いため、安価な代替品です。さまざまな昆虫種の広範な無菌およびグノトビオティック研究は、複数の一般的に使用されるモデルの開発につながっている。蚊とショウジョウバエは、世界的な疾患と遺伝的な難病への関連性のために生殖不能な仕事のための一般的なモデルである14,15.もう一つの新興モデルシステムは、ミツバチ(アピス・メリベラ)の、受粉と社会性研究におけるその重要性を考えると16である。しかし、これらの一般的に使用される昆虫の多くは、哺乳類の腸内群17に見られる分類学的複雑さを欠き、より高次の相互作用をモデル化する能力を制限している。アメリカのゴキブリの腸内に見られる微生物の多様性の総量は哺乳類に似ているだけでなく、ゴキブリの腸内に存在する微生物の多くは、哺乳類およびヒトの腸内微生物叢に一般的に見られる家族およびフィラに属する。ゴキブリの後腸はまた、哺乳類の大腸に機能的に類似しており、栄養分19,20の抽出を補助する細菌を密集した発酵室である。最後に、ゴキブリの雑食性は、食事の専門家では不可能であろう食事療法の多様性を可能にします。
アメリカのゴキブリは、高等生物の腸内微生物群集を理解するための有用なモデルシステムであり得るが、ゴキブリの害虫としての地位は、このシステムを害虫駆除21に関連する。腸内のコミュニティのゴキブリの健康と生理学への影響に関する基本的な知識を活用することは、害虫管理のための新しい技術の開発に支援します。
この方法の目的は、グノトビオティックアメリカゴキブリ(ペリプラネタアメリカーナ)の確立と維持の包括的な説明を概説することですが、このプロトコルは、任意の排卵ゴキブリのニンフを生成するために使用することができます。成熟したオテカエの効率的で非侵襲的な収集のための方法と、昆虫22、23、24のグノトバイオティクス状態を監視する非破壊技術が含まれる。グノトビオゴキブリを達成し維持する以前の方法は、oothecaコレクション23、24、25、26、27を記述しているが、ootheca成熟度は、種固有の手がかり(Blattellaゲルマニカ22、24、25)の観点から解釈されるか、または明示的に記述されていない27、28であり、システムに不慣れな人にとっては実装が困難である。ここで説明する方法は自然に落とされたウーテカエを使用するため、卵を早期に除去する誤差は存在しない。このプロトコルには、培養依存的な品質管理方法と文化依存性の両方の方法が含まれ、培養に依存する方法は、昆虫を犠牲にする必要はありません。最後に、この方法は、複数のグノトビオティックゴキブリ研究からの情報をまとめ、Gnotobioticゴキブリを達成し維持するために必要なすべての情報を含む包括的なプロトコルを作成します。

<table><tbody><tr><td>2X マスターミックス</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0482</td><td>OneTaq MasterMix</td></tr><tr><td>オートクレーブ可能なラットチャウ</td><td>Zeigler</td><td>NIH-31 モディファイドオート</td><td></td></tr><tr><td>バクテリアDNA抽出キット</td><td>オメガバイオテック</td><td>D-3350</td><td>E.Z.N.A. バクテリアDNAキット;リゾチーム、ガラスビーズ、プロテイナーゼK、バッファー(プロテイナーゼK、結合、洗浄、溶出)、DNAカラム、2mLコレクションチューブ</td></tr><tr><td>結合バッファー</td><td>を含むオメガバイオテック</td>の<td>細菌DNA抽出キット(「HBC」バッファー)に含まれる</td>オメガバイオテック<td>PD099</td>脳</tr><tr><td>心臓注入(BHI)ブロス</td><td>研究製品インターナショナル</td><td>B11000</td><td></td></tr><tr><td>デリケートタスクワイプキ</td><td>ムワイプ</td><td>JS-KCC-34155-PK</td><td>キムワイプ</td></tr><tr><td>DNA精製キット</td><td>オメガバイオテック</td><td>D6492</td><td>E.Z.N.A. Cycle Pureキット;D6493も使用できます。緩衝液(精製、洗浄、溶出)溶</td></tr><tr><td>出緩衝液</td><td>オメガBiotek</td><td>PDR048</td><td>オメガBiotekの細菌DNA抽出キットに含まれる</td></tr><tr><td>ガラスビーズ オ</td>メガ<td>バイオテックの細菌DNA抽出キットに含まれる</td><td>オメガバイオテック</td><td>n / a</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td>UVP</td><td>95-0330-01</td><td>溶出バッファーの予熱にはハイブリダイゼーションオーブンを使用しますが、ウォーターバスもおそらく中古</td></tr><tr><td>層流生物学的安全キャビネット</td><td>NuAire, Inc.</td><td>NU-425-400</td><td>プロトコルは、これを簡潔な</td></tr><tr><td>リゾチーム</td>オ<td>メガBio-Tek</td><td>n / a</td>オ<td>メガBiotekの細菌DNA抽出キット</td></tr><tr><td>に含まれる過酢酸ストック溶液(32%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269336</td><td></td></tr><tr><td>ワセリンワセ</td><td>リン</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼKバッファ</td><td>オメガBio-Tek</td><td>PD061</td><td>のための「層流フード」として参照しますOmega Biotekの細菌DNA抽出キット(「TLバッファー」)精製</td></tr><tr><td>バッファー</td>に含まれる <td>Omega Bio-Tek</td><td>PDR042</td><td>Omega BiotekのCyclePureキットに含まれる(「CP」バッファー)</td></tr><tr><td>RsaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0167</td><td>CutSmart(消化)バッファー</td></tr><tr><td>を含む 二次容器</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>蓋付きのプラスチック容器(Kritter Keeperなど)は、これにはうまく機能します(長さ25cmx幅15cmx高さ22cm)。それはBHIの傾斜および試験管の</td></tr><tr><td>分光光度計</td>に合うように十分に大きいべきである <td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td>カタログ情報はNanoDrop2000</td></tr><tr><td>熱シェーカー</td><td>Eppendorf</td><td>EP5386000028</td><td>Thermomixer R</td></tr><tr><td>Tris-EDTA</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP1338-1</td><td>10 nmのトリス、1 mM EDTA、pH 8</td></tr>の<tr><td>洗浄緩衝液</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>PDR044</td><td>のためであるOmega Biotekの細菌DNA抽出キット(「DNA洗浄」バッファー)に含まれる</td></tr><tr><td>木材チップ寝具</td><td>P.J.マーフィーフォレストプロダクツ</td><td>サニチップス</td><td></td></tr></tbody></table>

グノトビオティック・アメリカン・ゴキブリの設立と維持 (ペリプラネタ・アメリカーナ)

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

グノトビオティック動物は、マイクロバイオームの構造と機能に関するコントロールの研究のための強力なツールです。ここで提示は、グノトビオティックアメリカゴキブリの確立と維持のためのプロトコルです (ペリプラネタアメリカーナ).このアプローチには、継続的な品質管理のための組み込みの無菌検査が含まれます。グノトビオティック昆虫は、垂直に透過した内膜バイオエント(Blattabacterium)をまだ含むゴキブリとして定義されていますが、通常は表面とその消化管に存在する他の微生物が欠いています。このプロトコルでは、卵の場合(オテカエ)は、(無菌)ストックコロニーから除去され、表面滅菌される。いったん採取して滅菌すると、オーテカイは、孵化するか、汚染のために除去されるまで、脳心注入(BHI)寒天で約4〜6週間、30°Cでインキュベートされます。孵化したニンフはBHIの床、無菌水および無菌ラットの食糧を含んでいるアーレンマイヤーフラスコに移される。ニンフが所定の条件でBHIで増殖できない微生物を収容していないことを確認するために、追加の品質管理措置は、非endosymbiotic微生物をテストするために制限断片長ポリモーフィズム(RFLP)を使用します。このアプローチを使用して生成されたグノトビオティックニンフは、単純または複雑な微生物群集で接種し、腸内微生物叢研究のツールとして使用することができます。

ストックタンクは図 1に示すように設定されています。「妊娠した」女性は、 図2に示すように、後腹部に付着したオテカによって識別される。BHI寒天上のオテカのインキュベーションは、非破壊的な方法でグノトビオティック品質管理を可能にする。場合によっては、殺菌が失敗し、 図3Bのようにウーテカの周りに成長が現れます。これらのウーテカエは削除し、廃棄する必要があります。我々の手では、殺菌に対して10%の平均故障率が認められた(n=51)。oothecaeハッチは、 図3Aに示すように、培地上で増殖せずに滅菌後平均34日をハッチする。滅菌された非汚染オテカの典型的なハッチ率は41%(n = 46)で、1oothecaあたり平均11ニンフを観察しました。 図4のように、より大きなニンフはホイルで覆われたBHIフラスコに移されます。ホイルは汚染を防ぎ、ニンフは成長する余地がある。均質化されたニンフからの16S rDNAのRFLPは、グノトビオティックの状態を確認するために使用される。グノトビオティックニンフは、 図5に示すように、非無菌のニンフよりも遅い速度で成長することが観察されている。 図6 は、正常にグノトバイオティクス昆虫だけでなく、標準(非無菌)ニンフからの結果を示しています。
この試験は、陽性の培養結果がない場合の汚染をまだ特定していないが、このステップは、酸素感受性または潔癖性微生物の汚染を排除するための重要な実験中に日常的に行われている。標準的/無菌昆虫と比較して、生殖神経ゴキブリでは成長が遅く見られた。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig01.jpg"> 図1:ゴキブリのストックカルチャーのセットアップ 段ボールチューブは、タンクの端に積み重ねられています。食料と水はタンクの前部近くにあります。綿布カバーと弾性バンドは、視認性のために取り外されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig02.jpg"> 図2:"妊娠"アメリカゴキブリ。 矢印はオテカを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig3v2.jpg"> 図3:BHIスラント上で正常にグノトビオティックニンフが孵化し、滅菌に失敗した画像。 このプロトコルに記載されているように、オーテカエを殺菌し、インキュベートした。(A)BHI傾斜の微生物の増殖の欠如は、昆虫が、培養可能な生物を含まないことを示す。(B) コロニー形成をもたらすスラント上のオテカエは、汚染されたものとして廃棄されるべきである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig04.jpg"> 図4:グノトビオティック飼育装置。 昆虫は、汚染を防ぐためにホイル蓋で覆われた無菌フラスコに保管されます。二次容器(緑色の蓋)は、2%の漂白剤とそれに続く70%エタノールで殺菌される。二次コンテナ内の空気の流れは制限されません。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig5v2.jpg"> 図5:生殖腺生物と非生殖腺の体長を比較した代表的な成長率データ。 昆虫の両方のグループは、オートクレーブげっ歯類の食事を与えられました.グノトビオティック昆虫(ここでは:n=105)は、記載されているようにBHI上に保持される。無菌昆虫(ここではn = 50)は、水のための小さな皿とオートクレーブウッドチップ寝具付きのフラスコに住んでいます。無菌ニンフは平均0.059 mm/日で成長し、グノトビオティックニンフは0.028 mm/day(p &lt; 0.0001)で成長します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig5v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig05.jpg"> 図6:品質管理のためのRFLP結果の代表的なゲル画像。 全16S遺伝子アンプリコンをRsaIで消化した。PCR用のDNAを、1x PBSで均質化したニンフから抽出した。「Gニンフ」レーンはグノトビオティックニンフに対応し、「conv nymph」レーンは従来の非生殖管に対応します。仮想制限ダイジェストに基づいて、endosymbiont(Blattabacterium)は、163 bpと148 bpの間のバンドのスミアを有するサイズ402 bp、206 bp、および163 bpのバンドを有することが期待される。グノトビオティック昆虫は 、ブラタバクテリウム バンディングパターンのみを示す必要があります。混合細菌群集は、様々なサイズのバンドのスミアを有することが期待され、ここでは「他の細菌16S断片」とラベル付けされる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、孵化前に卵のケース(oothecae)を表面殺菌することによって、グノトビオティックアメリカゴキブリ(ペリプラネタアメリカーナ)を確立し、維持するために使用されます。これらのグノトバイオティクス昆虫は、垂直に伝染した ブラタバクテリウム 内介生物を含むが、無菌の根性を有する。

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Gnotobioticゴキブリ生成プロトコルは、宿主の健康およびマイクロバイオームアセンブリに対する天然の腸内微生物群集の除去および置換の影響の試験を促進する。この技術は、高価な専門ラボ機器を使用せずにグノトビオティックゴキブリを生成するためのまとまりのある合理化されたワークフローを形成するために、複数のソースからの方法を使用しています。このノトビオティックプロトコルの多くの異なる可動部分を考慮すると、視覚化は研究者がより簡単に独自の小規模で低コストのベンチトップのグノトバイオティクス施設を確立するのに役立ちます。計画された実験のためにoothecaeを運ぶ女性の適切な数の収集を容易にするために、ストックタンク内のグラビッドメスを含む段ボールチューブを移動するために鉗子を使用する。段ボールチューブにグラビドメスに加えて複数の昆虫が含まれている場合は、チューブの内容物を石油ゼリーで鳴らされた追加のプラスチック容器に振り、ターゲット昆虫がダンボールチューブに単独で戻るように促します。収集時に、各グラビッド女性を産科病棟に移します。メスがオテカエを落としたら、メスをストックタンクに戻し、鉗子を使ってゴミからオテカエを取り出します。オテカエをきれいにするには、3ミリリットルのドデシル硫酸ナトリウムを含む5ミリリットル遠心分離管に最大5個の卵ケースを入れ、オテカエを10秒間渦巻く。ちょうど実証したように2回目の洗浄の後、繊細な作業ワイプを使用して各オテカの表面を優しくスクラブして破片を取り除き、洗浄したオテカを計量ボートに入れます。滅菌前に、オテカ当たり1.5ミリリットルの遠心分離管をチューブあたり1ミリリットルの無菌水で満たします。また、ヒュームフードの5ミリリットル遠心分離管に3.2ミリリットルの二重蒸留水に32%の過酢酸ストック溶液の10マイクロリットルを加えます。キャップと反転を数回混合し、5分間、新たに調製した0.1%過酢酸溶液に5つまで洗浄したオテカエを入れ、60秒ごとにチューブを数回反転させます。過酢酸は、強い酸化剤である目、皮膚、および呼吸刺激性であり、可燃性および腐食性である。取り扱い時には必ず適切なPPEを着用し、適切な廃棄物を処分してください。インキュベーションの終わりに、滅菌鉗子と層流フードを使用して、各オテカを無菌リンス水の独自の遠心分離管に移します。オテカエをリンス水のチューブの第2セットに移す前に、数回反転して混合します。2回目のリンスの後、生殖不能鉗子を使用して、オテカエを個々のBHIスラントに移す。スラントを殺菌した二次容器に入れ、孵化するまで4~5週間加湿した30°Cインキュベーターに容器を移します。4週目まで、週に1~2回、真菌や細菌の増殖を定期的に確認し、その時点でスラントを毎日チェックする必要があります。ニンフが孵化し始めると、滅菌鉗子と層流フードを使用して、殺菌されたラットチャウのペレットを準備されたBHIフラスコに無菌的に移します。滅菌性チェックとして、フラスコを20°Cインキュベーターの2次容器に24時間置き、汚染成長の欠如を確認します。フラスコが無菌のままの場合は、傾斜からニンフを振り出し、ラミナーフローフードのフラスコに落ちるようにします。その後、薄層流れフードで週に1回300マイクロリットルの無菌水でニンフに水を与えます。ニンフフェックが中程度の床を覆い始めると、実証したように、24時間前に加えた殺菌されたラットチャウを含む新しいBHIフラスコにニンフを移します。妊娠中の女性は、後腹部に付着したオテカによって識別することができる。オテカエは、殺菌後平均34日ハッチ。殺菌に失敗した場合、孵化の間にウーテカの周りに成長が現れ、孵化のグノトバイオティクスの状態を損なう可能性があります。次に、昆虫の体長を測定することによってニンパルの成長率を追跡することができます。均質化されたニンフ由来の16SリボソームDNAの制限断片長多型は、グノトビオティックの状態を確認するために使用され得る。グノトビオティックゴキブリは、合成または異種微生物群集を接種することができます。この特定のワークフローは新しいが、グノトバイオティクスゴキブリを使用した以前の研究は、腸内微生物叢アセンブリと、その昆虫宿主の社会的行動、腸の健康、および免疫を形作る際の微生物の役割に関する洞察を生み出した。

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