グノトビオティック・アメリカン・ゴキブリの設立と維持 (ペリプラネタ・アメリカーナ)
May 28th, 2021
このプロトコルは、孵化前に卵のケース(oothecae)を表面殺菌することによって、グノトビオティックアメリカゴキブリ(ペリプラネタアメリカーナ)を確立し、維持するために使用されます。これらのグノトバイオティクス昆虫は、垂直に伝染した ブラタバクテリウム 内介生物を含むが、無菌の根性を有する。
Gnotobioticゴキブリ生成プロトコルは、宿主の健康およびマイクロバイオームアセンブリに対する天然の腸内微生物群集の除去および置換の影響の試験を促進する。この技術は、高価な専門ラボ機器を使用せずにグノトビオティックゴキブリを生成するためのまとまりのある合理化されたワークフローを形成するために、複数のソースからの方法を使用しています。このノトビオティックプロトコルの多くの異なる可動部分を考慮すると、視覚化は研究者がより簡単に独自の小規模で低コストのベンチトップのグノトバイオティクス施設を確立するのに役立ちます。
計画された実験のためにoothecaeを運ぶ女性の適切な数の収集を容易にするために、ストックタンク内のグラビッドメスを含む段ボールチューブを移動するために鉗子を使用する。段ボールチューブにグラビドメスに加えて複数の昆虫が含まれている場合は、チューブの内容物を石油ゼリーで鳴らされた追加のプラスチック容器に振り、ターゲット昆虫がダンボールチューブに単独で戻るように促します。収集時に、各グラビッド女性を産科病棟に移します。
メスがオテカエを落としたら、メスをストックタンクに戻し、鉗子を使ってゴミからオテカエを取り出します。オテカエをきれいにするには、3ミリリットルのドデシル硫酸ナトリウムを含む5ミリリットル遠心分離管に最大5個の卵ケースを入れ、オテカエを10秒間渦巻く。ちょうど実証したように2回目の洗浄の後、繊細な作業ワイプを使用して各オテカの表面を優しくスクラブして破片を取り除き、洗浄したオテカを計量ボートに入れます。
滅菌前に、オテカ当たり1.5ミリリットルの遠心分離管をチューブあたり1ミリリットルの無菌水で満たします。また、ヒュームフードの5ミリリットル遠心分離管に3.2ミリリットルの二重蒸留水に32%の過酢酸ストック溶液の10マイクロリットルを加えます。キャップと反転を数回混合し、5分間、新たに調製した0.1%過酢酸溶液に5つまで洗浄したオテカエを入れ、60秒ごとにチューブを数回反転させます。
過酢酸は、強い酸化剤である目、皮膚、および呼吸刺激性であり、可燃性および腐食性である。取り扱い時には必ず適切なPPEを着用し、適切な廃棄物を処分してください。インキュベーションの終わりに、滅菌鉗子と層流フードを使用して、各オテカを無菌リンス水の独自の遠心分離管に移します。
オテカエをリンス水のチューブの第2セットに移す前に、数回反転して混合します。2回目のリンスの後、生殖不能鉗子を使用して、オテカエを個々のBHIスラントに移す。スラントを殺菌した二次容器に入れ、孵化するまで4~5週間加湿した30°Cインキュベーターに容器を移します。
4週目まで、週に1~2回、真菌や細菌の増殖を定期的に確認し、その時点でスラントを毎日チェックする必要があります。ニンフが孵化し始めると、滅菌鉗子と層流フードを使用して、殺菌されたラットチャウのペレットを準備されたBHIフラスコに無菌的に移します。滅菌性チェックとして、フラスコを20°Cインキュベーターの2次容器に24時間置き、汚染成長の欠如を確認します。
フラスコが無菌のままの場合は、傾斜からニンフを振り出し、ラミナーフローフードのフラスコに落ちるようにします。その後、薄層流れフードで週に1回300マイクロリットルの無菌水でニンフに水を与えます。ニンフフェックが中程度の床を覆い始めると、実証したように、24時間前に加えた殺菌されたラットチャウを含む新しいBHIフラスコにニンフを移します。
妊娠中の女性は、後腹部に付着したオテカによって識別することができる。オテカエは、殺菌後平均34日ハッチ。殺菌に失敗した場合、孵化の間にウーテカの周りに成長が現れ、孵化のグノトバイオティクスの状態を損なう可能性があります。
次に、昆虫の体長を測定することによってニンパルの成長率を追跡することができます。均質化されたニンフ由来の16SリボソームDNAの制限断片長多型は、グノトビオティックの状態を確認するために使用され得る。グノトビオティックゴキブリは、合成または異種微生物群集を接種することができます。
この特定のワークフローは新しいが、グノトバイオティクスゴキブリを使用した以前の研究は、腸内微生物叢アセンブリと、その昆虫宿主の社会的行動、腸の健康、および免疫を形作る際の微生物の役割に関する洞察を生み出した。
概要
このプロトコルは、孵化前に卵嚢（oothecae）を表面滅菌することで、gnotobioticなアメリカゴキブリ（Periplaneta americana）を確立し維持します。この方法は、高価な実験機器を必要とせず、合理化されたワークフローを強調しながら、宿主の健康に対する腸内微生物叢の影響の研究を可能にします。
主要な研究構成要素
研究分野
- 微生物叢研究
- 昆虫生理学
- 宿主-微生物相互作用
背景
- gnotobioticモデルは、微生物叢コミュニティの影響を調査することを可能にします。
- この方法は、共生微生物を保持しながら無菌状態を維持するのに役立ちます。
- 腸内細菌叢の健康における役割を理解することは、昆虫と高次生物両方に広範な影響を持つ可能性があります。
使用方法
- 卵嚢の表面滅菌とインキュベーションプロトコル
- gnotobioticなアメリカゴキブリの使用
- 若虫の成長と微生物状態の定量的追跡
主な結果
- gnotobioticなゴキブリの作成と維持の成功した方法を検証しました。
- 腸内微生物叢が昆虫の健康と行動を形成する役割を確認しました。
- 微生物叢コミュニティの組立とその影響に関する将来の研究を可能にしました。
結論
- この研究は、腸内微生物叢の役割を調査するための信頼できる方法を示しています。
- 微生物学と生態学研究における潜在的な応用への洞察を提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Establishing gnotobiotic insect models enables mechanistic de-risking in target validation by isolating host-microbe interactions. This approach supports predictive confidence in preclinical models by defining microbiome-dependent phenotypes. The protocol provides a disease-relevant system for screening host responses to defined microbial communities.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by removing confounding microbial variables.
- Operational Value: Provides a standardized system for functional target validation in host-microbe pathways.
- Strategic Value: Supports predictive confidence and portfolio triage through biological de-risking of microbiome-dependent mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for reliable compound evaluation in microbiome-modulating assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through defined gnotobiotic conditions.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and scalability for microbiome-targeted compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by preserving vertically transmitted endosymbionts while eliminating extraneous microbes.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation with controlled microbiome variables.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by isolating microbiome-specific host responses.
Pipeline & Workflow Integration
Positions the method within early discovery to preclinical workflows by enabling hypothesis testing and mechanistic de-risking of microbiome-dependent targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating host-microbe interactions.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, contamination-free biological systems.
- Analytics: Provides quantitative microbial status verification via RFLP for confident data interpretation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through defined, translatable host-microbe models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative microbiome modulation studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in host-microbe studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of gnotobiotic model generation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in microbiome programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on microbiome-dependent target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aseptic technique and insect husbandry.
- Needs access to laminar flow hoods, incubators, and molecular biology tools for RFLP.
- Demands cross-team standardization between entomology and microbiology groups.
- Involves adaptation considerations across insect species and developmental stages.
- Includes practical limitations such as incubation time and sterility verification timelines.
