ショウジョウバエ幼虫を用いた熱遺伝学的神経細胞スクリーンにおけるマクロ栄養素摂取量の定量化
June 11th, 2020
ここで説明するプロトコルは、異なる大栄養素の質の食事にさらされた ショウジョウバエメラノガスター 幼虫によって定義された間隔内に食べられる食物の量の着色定量を可能にするプロトコルである。これらのアッセイは、神経細胞の熱遺伝学的スクリーンの文脈で行われる。
私たちのプロトコルは、2つの主要な主要栄養素、タンパク質と炭水化物の摂取量の制御に関連する栄養選択をコードする幼虫のニューロン集団の同定を可能にします。私たちの方法のシンプルさと比較的高いスループットにより、さまざまな栄養条件にさらされたいくつかの遺伝子型の食物摂取量を定量化できます。遺伝的に親の血統を越えるために、活性酵母ペーストを補充したL3飼育ダイエットプレートを備えた60ミリメートルの胚収集ケージを設定します。
5〜8日齢の成虫TripA1メス処女とJanelia GAL4オスを胚収集ケージに移し、摂氏25度で60%の湿度と12、12の明るい暗いサイクルで24〜48時間交配を行います。交配期間後、交配した成虫のハエを新鮮なL3飼育用飼料プレートに移し、摂氏25度で3〜4時間産卵を行います。すべてのプレートに卵の遺伝子型と産卵日がラベル付けされていることを確認してください。
産卵期間が終了したら、プレートをケージから取り出し、プレートの4分の1の胚の数を数えて、プレートあたりの卵の数を推定します。幼虫の密度をプレートあたり最大200個の胚に保ち、プレートをプラスチック製の蓋で覆います。L3飼育プレートを摂氏18度、湿度60%、および12、12の明るい暗いサイクルで9日間インキュベートします。
インキュベーション後、試験する各遺伝子型から10個のL3の3つのグループを、ゼロ色素食品の制御用に10個のL3の1つのグループを収集します。5番またはフェザーウェイトの鉗子を使用して、幼虫の収集をできるだけ穏やかに行います。集めた幼虫を1ミリリットルの水が入ったプラスチック製の皿重りボートに移します。
摂氏30度のインキュベーターを設置し、アッセイ中の幼虫の脱水を避けるために、水で満たされたトレイを追加して湿度レベルを高く保ちます。アッセイプレートを30°Cに温めて温度を平衡化してから開始します。すべてのプレートに、食事の遺伝子型とタンパク質と炭水化物の比率がラベル付けされていることを確認してください。
実験用幼虫に2分間熱ショックを与え、動物を乗せたプラスチックボートを摂氏37度の水浴に直接移します。必要なタイマー数を1時間に設定し、プラスチックボートから慎重に水を排出し、ボートからL3グループをアセットプレートの中央に移します。プレートを覆い、タイマーを開始します。
暗闇の中で幼虫が摂氏30度で1時間餌をやるのを待ちます。プレートを氷浴に移すことにより、フィーディングアッセイを停止します。試験したL3グループごとに2ミリリットルのマイクロチューブを準備し、マイクロチューブの底部を満たすのに十分な0.5ミリメートルのガラスビーズと300マイクロリットルの氷冷メタノールを含んでいます。
ベンチクーラーを使用して、マイクロチューブを冷たく保ちます。フィーディングアッセイプレートからL3基を慎重に回収し、水を少し入れてプレートの蓋に移します。幼虫をすすぎ、怪我をしないように注意しながら、体から食物の破片を取り除きます。
幼虫を準備したマイクロチューブに移し、組織ライザーで溶解して腸から食用色素を抽出します。抽出物をきれいな1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し、2ミリリットルのマイクロチューブを新しいチューブに直接反転させます。ガラスビーズのほとんどが2ミリリットルのチューブの底に留まるように、優しく行ってください。
抽出物を最大速度および摂氏4度で10分間遠心分離することにより、細胞の破片を取り除き、次に上清をきれいな1.5ミリリットルのチューブに移します。食品消費量の熱量測定を行うには、青色染料の標準溶液をメタノールで1〜2回連続希釈して調製します。100マイクロリットルの実験サンプル、標準試料、ブランクを96ウェルマイクロプレートのウェルに移し、600ナノメートルでの吸光度を測定します。
このプロトコルは、幼虫神経系の特定のニューロン集団の熱遺伝学的活性化下で動物に消費される主要栄養素の相対量を定量するために使用されました。ニューロンの集団の異なる活性化は、第3幼虫の主要栄養素のバランスに有意に影響を及ぼしました。対照線で観察された摂食パターン(ここでは灰色で示されています)は、タンパク質と炭水化物の比率が高い食事で予想される食物摂取量の減少を示しており、この方法の有効性を示しています。
実験動物に対して確立された表現型の5つのクラスは、たくさん食べて過食によってタンパク質の希釈を補う、たくさん食べるが補償しない、少し食べるが補償しない、少し食べるが補償する、少し食べて補償しない、異常に食べる、というものでした。これらの表現型クラスと遺伝子型のそれぞれについて、3齢幼虫の中枢神経系におけるGFPパターンが示されています。このプロトコルを試みるときは、動物の行動に関連する変動を最小限に抑えるために、発生的に同期した初期のサードインスター幼虫を生成することが重要です。
このプロトコルに従うと、食品のラジオラベリングにより、この方法を使用して見つかったヒットの確認とさらなる分析が可能になります。
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概要
この研究では、様々なマクロ栄養素の食事を与えられたショウジョウバエの幼虫の食事摂取量の比色定量法について説明しています。研究は、タンパク質と炭水化物の比率が異なる中で、栄養の選択と食事摂取量の制御に関与する幼虫の神経細胞集団の特定に焦点を当てています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 行動生物学
- 遺伝学
背景
- ショウジョウバエの幼虫は栄養行動の研究モデルとして使用されます。
- 食事のマクロ栄養素の質が摂食パターンに与える影響は、代謝の選択を理解する上で重要です。
- このプロトコルは、遺伝子型全体にわたる食事摂取量のハイスループットスクリーニングを可能にします。
研究の目的
- ショウジョウバエの幼虫段階での食事摂取量を定量化する手法を開発すること。
- 栄養決定の背後にある神経メカニズムを理解すること。
- 異なるタンパク質と炭水化物の比率が摂食行動に与える影響を調べること。
使用した方法
- プロトコルは、3齢幼虫の摂食活動を定量化するために行動アッセイを使用します。
- ショウジョウバエの幼虫は異なる食事を与えられる一方で、神経細胞集団は熱遺伝学的に活性化されます。
- 評価には、幼虫を熱ショックし、その後、食事から吸収された食品染料の比色測定が含まれます。
- 一貫した行動結果を得るために、幼虫の発育の慎重な同期化が重要です。
- 定量化のための標準曲は、連続希釈された染料溶液を使用して確立されます。
主要な結果
- 異なる神経細胞の活性化が摂食パターンのマクロ栄養素の均衡に重要な影響を与えます。
- 食事の変化に対する摂取反応に基づいて、5つの表現型クラスの摂食行動が特定されました。
- この方法は、食事の組成と食事摂取量の関係を効果的に定量化することができました。
結論
- このプロトコルにより、研究者は幼虫の食事の選択における特定の神経細胞集団の役割を調査することができます。
- 食事摂取量と行動表現型の明確な測定は、代謝の決定メカニズムの理解を深めます。
- この発見は、栄養生理学とその神経基盤の知識に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput quantification of macronutrient intake in a genetically tractable model, supporting target validation in metabolic and feeding behavior research. By linking specific neuronal populations to dietary choice phenotypes, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on obesity, diabetes, and nutrient-sensing pathways. The quantitative, dye-based readout offers predictive confidence in screening workflows where nutritional homeostasis is a key biomarker.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying larval neuronal populations that regulate protein and carbohydrate intake under controlled dietary conditions.
- Operational Value: Enables functional target validation through thermogenetic activation screens that link genotype to feeding behavior phenotypes.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by classifying genotypes into phenotypic classes based on macronutrient compensation patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing food intake quantification across genotypes and diet conditions.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative outputs via colorimetric measurement of dye uptake, enabling reliable compound or genetic perturbation evaluation.
- Scalability: Supports platform reuse through simple larval collection, feeding, and extraction steps compatible with 96-well plate formats.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase neuronal hits to preclinical validation by establishing disease-relevant feeding phenotypes in a conserved model system.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development through quantifiable macronutrient intake metrics that reflect nutritional homeostasis.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on whether genetic perturbations normalize or exacerbate feeding imbalances across protein-to-carbohydrate ratios.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in neuronal mechanism elucidation before progressing to lead identification and preclinical validation in metabolic disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating the effect of specific neuronal activations on macronutrient balancing in larval feeding behavior.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized larval synchronization, diet exposure, and dye-based quantification that yields comparable data across conditions.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (food intake via absorbance at 600 nm) that allow comparison of conditions and statistical evaluation of genotype effects.
- Translational Research: Advances preclinical continuity by identifying neuronal regulators of dietary choice that may inform target selection in mammalian models of metabolic disorder.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable screening capability for metabolic and behavioral phenotypes due to its simplicity, low cost, and compatibility with genetic libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in nutrient-sensing pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled larval staging, diet composition, and timed feeding assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early evidence of on-target metabolic effects, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their ability to restore balanced macronutrient intake in perturbed feeding phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, larval staging, and thermogenetic techniques.
- Dependent on incubation equipment, water baths for heat shock, and microplate readers for absorbance measurement.
- Necessitates cross-team standardization of larval density, diet labeling, and assay timing to minimize variability.
- Adaptation to other model systems would require modification of diet composition, dye compatibility, and larval recovery methods.
- Practical limitations include the need for dexterous larval handling and the assumption that dye uptake linearly correlates with food intake.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:32
Preparation of Third-instar Larvae (L3)
2:24
Thermogenetic Activation and No-choice Feeding Assay
3:35
Food Dye Extraction and Colorimetric Quantification of Food Consumption
5:37
Results: Amount of Food Eaten per Larva under Neuronal Thermogenetic-activation Conditions in Three Macronutrient Balancing Diets
6:49
Conclusion
