リナル皮質-海馬の組織性スライス培養におけるてんかん発生のモデル
2021年3月18日
ここでは、鼻皮質海馬の組織性スライスの調製について述べています。徐々に制御された血清の剥奪の下で、これらのスライスは進化するてんかんのような出来事を描写し、てんかん発生の元vivoモデルと考えることができる。このシステムは、自発的な活動のダイナミクスを監視するだけでなく、てんかん発生の過程を通じて神経炎症性の進行を評価するための優れたツールを表します。
てんかんは一般的な神経疾患です。鼻皮質海馬組織ノミスティックスライスは、生体内てんかんに似ており、てんかん発生の元生体モデルとして使用できる進化するてんかん様イベントを描いています。このシステムは、てんかん発生のダイナミクスと進行を監視し、この脳病理の潜在的な治療目標をスクリーニングするための優れたツールです。
私と一緒に手順を示すのは、私の学生フランシスコ・メダとマファルダ・カルヴァーリョです。出生後6日目から7匹のスプレイグ・ドーリーの子犬に脳を収穫するには、まず5ミリリットルのGBSSで頭を3回洗う。バイオセーフティキャビネットで作業し、鋭い鉗子をしっかりと目のソケットに挿入して頭を所定の位置に保持し、薄い先端はさみを使用して脊椎の房から前頭葉までの正中線に沿って頭皮を切断します。
同じ方法で頭蓋骨を切り取り、脳横裂きに沿って、頭蓋骨の破片を離れて移動するために湾曲した長い鉗子を使用します。嗅球を捨て、5ミリリットルの冷たいGBSSを含む60ミリメートルのプレートに脳の後ろ側を移すためにスパチュラを使用してください。小脳に細かい鉗子を挿入し、慎重に半球を開くために正中線に沿ってへらを挿入します。
短い湾曲した鉗子を使用して、海馬の構造に触れることなく、海馬を覆う余分な組織を慎重に取り除き、各海馬の下に切り取ります。一度に海馬側を上に1つの半球を移動し、フィルターペーパーの上に互いに平行にします。半球をブレードに垂直にした組織チョッパーにフィルターペーパーを置き、半球を350ミクロンのスライスに切ります。
5ミリリットルの冷たいGBSSを含む新しいペトリ皿にスライスしたティッシュを移し、丸い先端電極を使用して、構造的に無傷の鼻皮質と海馬でサンプルのみを保持するスライスを慎重に分離します。DGおよびCA領域は、内膜および内皮質領域と同様に完全に定義されるべきである。ヘラと丸い先端電極を使用して、ウェルあたり1.1ミリリットルの培養培地を含む6ウェルプレートの適切な数のウェルに、個々のインサートに最大4つの無傷のスライスを配置します。
P20ピペットを使用して、各スライスの周りから余分な解剖媒体を取り除きます。プレートを細胞培養インキュベーターに入れる。2~ 3 日ごとにメディアを変更します。
フォースを使用して、インサートを持ち上げます。対応するウェルから培地を吸引し、挿入物を所定の位置に戻します。P1000ピペットを使用して、新鮮な37度の摂氏培地を各ウェルに1ミリリットル加えます。
閉回路で電気生理学のセットアップを準備します。インターフェースタイプチャンバの流量が毎分2ミリリットルに設定されていることを確認し、炭水化物-牛弁を開きます。システム内の水位を確認し、余分な媒体を排出するために、インターフェイス記録室にフィルターペーパーの一部を置きます。
レンズクリーニング用紙をフレームの下に置いて、スライスに媒体を供給し、温度コントローラ、アンプ、マイクロマニピュレータをオンにします。注射器を使用して、作りたての人工脳脊髄液をガラス電極にロードします。ガラス電極を受電電極に入れ、インターフェイスチャンバーの温度が摂氏37度で安定するのを待ちます。
バイオセーフティキャビネットで作業し、インサートを60ミリメートルのプレートに入れ、ミディアムを落とします。鋭利な刃を使用して、インサートからスライスを切り取り、海馬を右下にインターフェイスチャンバーに置き、受信電極をCA3ピラミッド型セル層に入れ、連続集録プロトコルを開始し、スライスを30分間記録します。ヨウ化プロピジウム取り込みアッセイを行うために、バイオセーフティキャビネットで働く。
インサートをウェルから持ち上げ、ヨウ化プロピジウムを培地に加え、井戸当たり2マイクロモルの最終濃度にします。チップを井戸に戻す前にゆっくりとプレートを攪拌し、スライスの下に泡がなさ注意してください。すべてのスライスが処理されたら、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。
スライスの免疫染色については、ヨウ化プロピジウムインキュベーションの終わりに、各ウェルの底部から培地を吸引し、各インサートの上下に4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルを加える。室温で1時間後、スライスを1回10分間2回洗浄し、1回のPBSを1ミリリットルで洗浄し、疎水性ペンを使用して顕微鏡スライドに2つの長方形を描きます。鋭い刃を使用して、挿入物からスライスをカットし、各長方形に1つのスライスを配置します。
パーメビレーションブロッキング溶液を各スライスに加えて、室温で3時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、一晩4度摂氏インキュベーションのために各スライスに関心のある一次抗体を加える。翌朝、PBS-Tweenでスライスを1回10分間3回洗浄し、適切な二次抗体でスライスを室温で4時間インキュベートします。
その後、デモンストレーションしたようにスライスを洗い、各スライスに50マイクロリットルのHoechst溶液を加え、室温で20分間インキュベーションします。Hoechstインキュベーションに続いて、スライスを再び洗い、それぞれに50マイクロリットルの取り付け媒体を加え、スライスの上にカバースリップを置き、マニキュアで密封します。スライドを室温で24時間乾燥させた後、共焦点顕微鏡によるヨウ化プロイドと免疫染色を可視化します。
鼻皮質海馬の組織性のスライスは、体外で7日間で混合間およびイクタル様の活動を描いています。14日間のインビトロでは、自発的な活動は、1分以上続くイクタルイベントでインビトロで21日で圧倒的なイクタル活動に進化するictal放電によって特徴付けられる。神経マーカーNeuNに対するヨウ化プロピジウム取り込みおよび免疫体化学は、海馬のすべての領域で14日間でかなり増加するインビトロスライスの7日間でいくつかの神経細胞死を明らかにした。
インビトロで7日間で、低いCD68発現を有するミクログリアがIba1陽性CD68陽性反応性ミクログリアよりも豊富である。一方、14日間インビトロでは、海馬のすべての領域で、Iba1陽性CD68陽性アモエボイドM1ミクログリアは、低いCD68発現を有するミクログリアを超える。14日間のインビトロで、Iba1陽性CD68陽性細胞の一部を、ハイパービッフェリン外観を特定することができ、M2抗炎症ミクログリア表現型の可能性を示唆している。
7日間のインビトロでは、CD3の発現はほとんど検出不能であり、14日間のインビトロスライスでは、肥大性グリア性フィブリリン酸タンパク質陽性CD3陽性アストロサイトが観察され、A1アストロサイトの進行的活性化を示唆する。細心の注意を払って鼻皮質海馬スライスを準備します。スライス中にスライスの完全性を損なう可能性がありますので、海馬の上の余分な組織を取り除くことを確認してください。
構造的な欠陥は、スライスの実行可能性に悪影響を及ぼします。実証されたアプローチに加えて、ウエスタンブロット分析、リアルタイムPCRおよびELISAなどの多数のアッセイをこのシステムに適用して、てんかん発生に関する特定の質問に対処することができます。
概要
この研究は、発作形成のin vitroモデルとして機能する嗅皮質-海馬の組織型切片の調製を探っています。これらの切片は、血清欠乏下でてんかん様の事象を示し、発作形成全体を通じて自発活動と神経炎症の進行をモニタリングするのに適しています。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 発作形成
- 電気生理学
背景
- てんかんは一般的な神経学的障害です。
- 組織型切片はin vivoの条件に近いモデルを提供します。
- このモデルを通じて発作形成の進行を評価できます。
- 研究者はこのモデルを使用して潜在的な治療標的を特定できます。
研究の目的
- 嗅皮質-海馬の組織型切片を調製すること。
- てんかん様の活動のダイナミクスを調査すること。
- 発作形成中の神経炎症性の特徴を評価すること。
使用した方法
- 嗅皮質と海馬の組織型切片はSprague-Dawleyの子犬から調製されました。
- 切片は培養され、てんかん様の活動がモニタリングされました。
- 自発活動を調べるために電気生理学的記録が行われました。
- プロピジウムヨウ化物取り込みと免疫組織化学を用いて神経細胞の完全性を評価しました。
- 3週間の期間にわたって活動の動的な変化をモニタリングしました。
主要な結果
- in vitroで7日後、切片は間発作および発作様の活動が混在していました。
- in vitroで14日後、自発活動は発作放電の増加とともに進化しました。
- in vitroで21日後、主要な発作事象は1分以上持続しました。
- in vitroで7日から14日までの間に神経細胞死が著しく増加しました。
結論
- この研究は、発作形成と関連メカニズムを理解するための信頼できるモデルを提供します。
- この知見はてんかんの治療標的の探索を促進する可能性があります。
- 発作形成中の神経細胞メカニズムと可塑性に関する洞察が強調されています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This model provides a reproducible ex vivo platform for studying epileptogenesis progression, enabling early-stage target validation and mechanistic de-risking in epilepsy drug discovery. By capturing evolving epileptic-like activity and neuroinflammatory changes over time, it supports predictive confidence in therapeutic screening and translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modeling evolving epileptogenesis dynamics in a disease-relevant system.
- Operational Value: Supports functional target validation through longitudinal monitoring of epileptiform activity and neuronal death.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying compounds that modify epileptogenesis progression and neuroinflammatory markers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible system for preparing validated biological structures suitable for compound screening.
- Operational Value: Delivers quantitative electrophysiological and immunohistochemical readouts for reliable compound evaluation.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple time points and intervention studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant epileptogenesis progression with temporal dynamics mirroring in vivo pathology.
- Operational Value: Enables assessment of neuroinflammatory biomarkers and neuronal integrity changes over a three-week culture period.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by capturing key epileptogenesis hallmarks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, offering a platform for mechanistic de-risking and predictive modeling in epilepsy research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by modeling epileptogenesis evolution in rhinal cortex-hippocampus circuits.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slice preparation and stable electrophysiological recording conditions.
- Analytics: Provides quantitative measurements of epileptiform activity, neuronal death (via propidium iodide), and glial activation for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling progressive epileptogenesis and neuroinflammation relevant to therapeutic intervention.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for longitudinal epileptogenesis studies across multiple compound screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by modeling epileptogenesis progression and reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of epileptogenesis modeling across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of disease-modifying effects and reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through longitudinal assessment of antiepileptogenic potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organotypic slice culture, electrophysiology, and immunohistochemical techniques.
- Depends on specialized instrumentation including interface recording chambers, temperature controllers, and confocal microscopy systems.
- Necessitates cross-team standardization of slice preparation, culture maintenance, and assay timing for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending the model to other brain regions or neurological conditions.
- Practical limitations include the need for meticulous dissection to preserve hippocampal and rhinal cortex integrity during slicing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Rhinal Cortex-Hippocampus Slice Preparation
3:41
Electrophysiological Recordings
5:07
Propidium Iodide (PI) Uptake Assay and Immunohistochemistry
7:26
Results: Epileptic-like Events, Neuronal Death and Gliosis are Observed in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slices
9:18
Conclusion
