Name: 同種異系皮膚移植片で再建された火傷のマウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 学ぶ マウスモデルによる全層熱傷の皮膚移植再建法。同系統マウスを用いた移植片の固定と創傷治癒評価により、創傷治癒メカニズムの解明に貢献する再現性の高い実験系を構築します。

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この作品は、ラ・ディレクション・ジェネラル・ド・ラルマン、ラ・アジェンス・ド・ラ・イノベーション・ド・デファンス、エコール・ポリテクニックによって支えられてきました。私たちは、ビデオファイルの制作を大いに支援する洞察力と専門知識を提供したエコールポリテクニックの同僚ヤン・プランティエ氏に感謝します。著者らは、INSERMラヴォワジエ(SEIVIL)US 33、オピタルポールブルッセ、ヴィルジュイフのブノワ・ピューテマン氏とシャーロット・アウリアウ氏に、このプロジェクトの過程で提供された動物の幸福とケアの専門知識に感謝しています。

すべての実験はフランス高等教育研究省によって承認されました (研究番号: 122162017111616517670v2 と DAP180012).すべてのマウスは、プラスチックケージに到着すると一人収容され、研究の前に7日間の順応期間を許可された。動物室は12/12時間の明暗サイクル(07:00に点灯)で維持されました。食べ物と水道水は、アドリビタムを提供しました。BALB/cおよびSKH1-Hrhrマウスは、伝統的な小麦/大豆ベースの食事を与えた。おがくずの寝具は、入れ子材料と一緒に提供されました。
1. 設備準備
<ol><li>プロシージャのための燃焼装置を準備し、温度コントローラーを使用して80°Cに設定します(図1A)。赤外線熱画像カメラを使用して、真鍮テンプレートの温度(図1B,C)を確認します。</li>
	<li>デジタル・マノメーターが正しく動作していることを確認します。</li>
	<li>ステージを外科用ドレープで覆い、テーブルの高さを調整します(図1A)。</li>
</ol>2. 術前及び手術中の動物ケア
<ol><li>BALB/cおよびSKH1-Hrhrマウスを取得します, 6-8週齢.</li>
	<li>3 mg/mLのパラセタモール懸濁液を飲料水に加え、処置の12時間前と72時間前まで供給する。</li>
	<li>1 mLシリンジと26G針を使用して、手順の30分前に0.05 μg/gの下皮下投与し、手順の後の最初の72時間は6時間ごとに投与します。</li>
	<li>1 mLシリンジと26G針を用いて、リドカインをマウスのドーサムに投与し、2~3mmの熱傷の領域に遠位を投与する。焼け傷の誘導の15分前に0.05 μg/g皮下にリドカインを注入する。</li>
	<li>10 mg/kg のキシラジンおよびケタミン 100 mg/kg で腹腔内注射を使用してマウスを麻酔します。.注射剤を投与するために1mLの注射器と26G針を使用してください。</li>
	<li>重要なステップ:麻酔後の最初の30分間、麻酔からの回復後、少なくとも15分間、加熱されたパッドの上に麻酔マウスを置き、マウスを暖かく保ち、低体温症を予防します。加熱されたパッドに加えて、ヒートランプ、循環暖かい液体または空気、および事前に暖めた熱貯留層を含む他のモダリティは、体温を調節するために使用することができる。</li>
	<li>角膜の脱水を防ぐために、マウスの目に潤滑ゲルを塗布します。</li>
	<li>つま先ピンチ離脱反射を使用して、麻酔の深さを評価します。</li>
	<li>1 mL シリンジと 26 G 針を使用して、5% デキストロースを補った 200 μL のラクチンジャー溶液を投与します。麻酔の誘導直後に皮下に水分置換を行い、脱水を予防する処置の6時間後に投与する。</li>
</ol>3.完全な厚さの傷の誘発を燃やす
<ol><li>毛のバリカンで麻酔マウスを剃ります。</li>
	<li>マウスのドーサム表面に脱毛クリームを1分間塗布します。いくつかの滅菌ガーゼを使用してクリームを拭き取り、湿ったガーゼの一部で領域をきれいにします。肌にガーゼを入れ、乾くまで乾かします。</li>
	<li>手術用ドレープで覆われたステージにマウスを置き、ステージを予熱した真鍮テンプレートに近づけます。</li>
	<li>0.15 Nの一定圧力を使用して、マウスの背面(20の場合は80°C)に円形の真鍮テンプレートを適用します(図2)。</li>
	<li>
重要なステップ:火傷誘導の直後に、麻酔動物を加熱パッドに置いて低体温症を防ぎ、処置中および後にマウスを暖かく保つ。麻酔から回復したら、マウスをケージに戻します。</li>
	<li>
重要なステップ:外科的処置の後の最初の72時間のケージの床にマッシュダイエットを提供する。マウスは、火傷の怪我の後に水を飲むためにシッパーチューブに到達することに消極的になることがあります。</li>
</ol>4. ドナー移植片の収穫
<ol><li>ドナーマウスの尾部の上部にメスを入れた縦切開を行い、外科用鉗子を使用して皮膚をそっと取り除きます。</li>
	<li>10 mLの無菌0.9%生理食水で満たされた無菌ペトリ皿に尾の皮を入れます。定規を使用して個々の移植片を測定し、メスを使用して15mmを測定する尾の皮膚を粉々に切ります。</li>
	<li>調製後、皮膚移植片を最大2時間4°Cで0.9%生理食液に保ちます。</li>
</ol>5. 外科的切除と皮膚移植
<ol><li>焼け入れから24時間後、イオブルランを吸入して麻酔のためにマウスを準備する。マウスを誘導室に入れ、4 L/minの流量で100%酸素中の5%イオブルランを使用して麻酔を誘発する。手術中に麻酔を維持するには、2 L/分で2%イソファランを使用してください。</li>
	<li>マウスに外科用ドレープを置き、外科的分野を露出させるために窓を切り取ります。無菌技術を用いて、最初にポビドネヨウ素で創傷を綿棒し、次に70%のアルコールで傷を綿棒にする。</li>
	<li>穏やかに外科用ピンセットのペアで焼かれた組織を拾い、無菌の外科用はさみおよびピンセットとすべての壊死および非実行可能なティッシュを切除する。皮下のパンニクルカルノーサス層を取り除き、安定した受け取りベッドを作成します。</li>
	<li>作りたての創傷ベッドの上に皮膚移植片を置きます。外科用ピンセットを使用して、周囲の皮膚を皮膚移植片に向かってそっと引っ張ります。いくつかの外科用接着剤を塗布して、移植片を創傷床に取り付け、静かに押して皮膚の縁を合わせます。重要なステップ:創傷床のサイズは、正常な生着を確実にするために、皮膚移植片のサイズよりもわずかに大きくなければなりません。</li>
	<li>マウスが麻酔から回復することを許可します。クリティカルステップ:熱いパッドの上にマウスを置きます。低体温症を防ぐために、手順の間と後にマウスを暖かく保ちます。</li>
	<li>移植された創傷の上に不活性パラフィンガーゼドレッシングおよび接着二次ドレッシングを適用する。</li>
	<li>マウスを個々のケージに入れます。重要なステップ:外科的処置の後の最初の72時間ケージの床にいくつかのマッシュダイエットを提供し、毎日監視します。</li>
	<li>おもちゃを提供し、環境を豊かにします。</li>
</ol>6. デジタル画像化と事後創傷コレクション
<ol><li>傷の横に定規を置いて、デジタルカメラで傷を撮影する(図3)。</li>
	<li>実験の終点で、二酸化炭素および子宮頸部脱臼に曝されることによって動物を安楽死させる。重要なステップ: 子宮頸部脱臼時の皮膚の過剰な引っ張り作用は、移植片に損傷を与える可能性がある。</li>
	<li>死後、はさみを使用して鼻隠しに背びけの傷を外科的に切除する。二分の傷。10%緩衝ホルマリンとプロセスで半分を修正し、神学と免疫検査を行います。RNA抽出とタンパク質定量のために液体窒素で残りの半分を速く凍結し、-80°Cに保ちます。</li>
</ol>7. 皮膚構造学、免疫染色法、コラーゲン可視化
<ol><li>パラフィンに皮膚のサンプルを埋め込み、4μmのセクションにカットし、正に帯電したスライドに置きます。</li>
	<li>ヘマトキシリンとエオシンで染色されたスライドを使用して、再上皮化の速度(元の創傷の%)を評価します。表皮で覆われている創傷の面積は、創傷全体に対する割合として表わされ得る(図4)。デジタル顕微鏡アプリケーションとImageJソフトウェアを使用して、セクションの顕微鏡分析を行います。</li>
	<li>ホルマリン固定組織とパラフィン埋め込み組織から作られた組織学的切片(厚さ4μm)を使用し、免疫組織化学に供します。</li>
	<li>創傷におけるコラーゲンIおよびフィブロネクチン発現を評価するために、1時間の一次抗体およびインキュベートを適用し、検出は種特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)またはアルカリホスファターゼ(AP)共役二次抗体によって行われ得る。</li>
	<li>反応セクションは、(i)HRP、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)または(ii)AP、ボンドポリマー精製赤(材料表)のいずれかで反応し、明るい赤色を生み出す(図5)。機器を使用してセクションをスキャンし、デジタル顕微鏡アプリケーションとImageJで分析します。</li>
	<li>コラーゲン沈着の組織学的評価を可能にするには、市販キットを使用して組織学的セクションにトリクローム染色を行います。</li>
	<li>コラーゲン繊維の可視化には、多光子顕微鏡と第二高調波発生技術を用いる(図5)。先に説明した20のように組織イメージング用の多光顕微鏡を使用する。2番目の高調波および2光子励起蛍光信号(TPEF)を生成するためのレーザー源として、810 nmの中心波長を有するTi:Sapphireレーザーを使用してください。</li>
	<li>25x/0.95 W の目的を搭載したレーザービームを使用して、第 2 高調波発生(SHG)と TPEF を収集し、励起します。NDD PMT検出器により、前述の21の信号を検出します。レーザースキャン制御と画像取得にソフトウェアを使用します。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

火傷23の厚さの分類によれば、完全な厚さの火傷は皮下組織の皮膚の全厚および特定の部分の明らかな関与によって特徴付けられる。このタイプの創傷は、収縮または皮膚移植2によってのみ治癒することができる。この記事で説明する方法の本質的な制限は、臨床現場でよく使用される分割厚さ移植片とは対照的に、完全な厚さの移植片だけがマウスの尾部から採取されたことです。これは、マウスの皮膚が薄すぎて分割厚い移植片を得られないため、技術的な困難が原因であった。完全な厚さの移植片は十分に血管化された創傷のベッドを必要とし、一方、分裂した厚さの皮膚移植片は、より少ない血管を有するドナー部位で生き残ることができるのに対して24。これまでの研究では、マウスの背面に誘発された火傷は、新しい血管系5の堅牢な形成に関連付けられていることが示された。これは、マウスのドーサムのような十分な血管化領域が、火傷の誘発のための解剖学的ランドマークとみなされ得ことを示唆している。
火傷の深さは考慮すべき重要な要素です。火傷の深さは、個々のマウス間で一貫している必要があります。焼け傷深さの再現性は、真鍮テンプレートの温度、圧力、熱暴露の持続時間に依存します。火傷の深さは組織学的に検証されなければならない。予熱された真鍮テンプレートへの過度の圧力または皮膚の長時間の暴露は、基礎組織を傷つける可能性があることを覚えておいてください。中枢神経系および末梢神経系の成分を含む椎骨柱を取り巻く組織は熱に敏感であり、損傷した場合は後肢麻痺を引き起こし得る。
術後の死亡率は外科的処置に直接関連しなかったが、特に寒さに敏感な少数の無毛SKH1-Hrhrマウスは低体温症を発症し、全身麻酔後に回復できなかった。したがって、補助熱は、すべての審美的なイベントの間に提供する必要があり、マウスが麻酔されている間、一定の監視が必要です。
本研究で説明した方法は、手術部位感染と関連していなかった。しかし、無菌技術は、周術期の間に外科的創傷への微生物の移動を防ぐために使用されなければならない。創傷の接種は、生物発光または蛍光微生物を用いて、手順に組み込むことができる。この技術は、感染性生物とその病態25を研究するのに有用であり得る。例えば、生物発光菌の外因性添加または注射は、生体内全体の動物イメージング25を用いて微生物負荷のモニタリングを可能にし得る。マウスの毛は生体内全ての蛍光および生物発光イメージングに干渉することが知られていることを考えると、無毛SKH1-Hrhrマウスは、蛍光または生物発光レポーターを含む研究のための理想的な宿主である。
創傷組織サンプルは、異なる時点で収集され、組織学的および免疫組織学的分析のために処理され得る。タンパク質およびRNAは、創傷治癒に関与する主要分子の発現を評価するために使用され得る皮膚生検および分子生物学技術から単離され得る。
本研究では、火傷治癒と同種異系皮膚生着の実験モデルについて説明した。この手順は、変更することができ、前臨床試験のモデルとして役立ちます.

外科的脱花および皮膚移植は、慢性創傷1の管理に使用される一般的な臨床慣行である1、傷口2を燃やし、および外傷性創傷などの急性創傷3。皮膚移植は、身体のある部分から健康な皮膚を除去し、それを別の部分に移すことを含む外科的処置を指す。ドナー移植片は失われた組織を置き換え、細胞の移動および成長のための構造足場を提供する。レシピエント部位への統合後、皮膚移植片は、微生物の侵入からの保護、外部環境の有害な影響および水分の過度の損失を提供することによって失われた皮膚障壁を置き換える4。成功した皮膚移植片の統合はいくつかの要因に依存する。これらは、微生物感染および炎症の適時解決の存在下での適切な免疫応答、創傷部位における強固な血管新生およびレシピエントベッドとドナー移植片5との間の血管性アナストモーゼの確立を含む。移植片が分解し始めると、存在する真皮細胞は、新しい細胞外マトリックスを産生することができる細胞に置き換えられなければならない。同時に、表皮角化細胞は、新たに産生されたマトリックスを這って新表皮を形成し、創傷を再表皮化しなければならない。したがって、レシピエントベッドからドナー移植片への細胞の効率的な移行が、移植片の正常な組み込みに影響を及ぼすもう一つの決定因子である。創傷治癒に関与する膨大な数の因子6を考えると、倫理的な制限のためにヒト試験で制御することができない可能性があり、前臨床実験的皮膚移植のモデルが必要である。火傷治癒および関連する皮膚移植の前臨床モデルの開発は、皮膚組織修復に関与する複雑なメカニズムを理解し、新しい治療薬の検査に不可欠である。創傷治癒のin vitroモデルは、皮組織の複雑さを正確に模倣することができない。生体内動物モデルは、組織修復に関わるメカニズムを理解する上で不可欠な調査ツールです。
皮膚移植技術のいくつかの方法は、外科的切除を模倣し、創傷再建77、8、98,9を模倣するためにげっ歯類で開発された。しかし、前述の手順のほとんどは、皮膚移植前に熱焼け損傷を誘発することができなかった。火傷の代わりに、完全な厚さの切除創傷が誘発され、その後、完全な厚さの皮膚同種移植片7で再構築された。耳、尾、背部などの様々な解剖学的ランドマークは、げっ歯類77、88のドナー皮膚の収穫に使用されています。「縫合技術なし」9、縫合糸7、外科用接着剤10、11、1211,12を含む、異10なる移植片固定および安定化技術が報告された。
本研究の目的は、未生存組織切除および皮膚移植を伴う火傷治療における現在の金標準アプローチを再現する完全な厚さの火傷創傷のマウスモデルを開発することであった。熱熱熱は、予熱された真鍮のテンプレートを使用してマウスのドーサム表面に誘発された。焼きエシャルを摘出し、ドナーマウスの尾部から採取した完全な厚さの移植片に置き換えた。この実験モデルには3つの大きな利点があります。まず、レシピエントマウスの後部に複数の火傷が誘発され、ドナーマウスの単一の尾から4つのドナー皮膚移植片が採取され得る。これは、いくつかの実験的および制御的な治療法が、同じレシピエント動物とドナー動物を使用して比較される可能性があることを意味する。所望の投与経路に応じて、制御処理は、車両またはプラセボ制御の局所的または全身的な投与(例えば、軟膏の局所適用、皮下、腹腔内または静脈内注射溶液)を含む。第2に、実験の処理のタイミングおよび終点を制御してもよい。第3に、このモデルは、尾部から採取した完全な厚さ移植片を用いた創傷の再建に依存し、これは、背面13から採取された皮膚と比較してドナー部位への組み込みが成功する確率が高いことが知られている。これは、皮膚免疫生物学において重要な役割を果たす表皮ランゲルハンス細胞の数が少なく、皮膚移植片拒絶反応14に関連している可能性がある。
創傷治癒および移植片の統合の提案されたモデルは、トランスジェニックマウスおよびノックアウトマウスに適用される可能性がある。遺伝子組み換えマウスの使用は、創傷修復中に特定の遺伝子が果たす役割を解明する際に役立ちます。外傷部位における治療用抗体の外因性創傷製剤または皮下投与の外因性適用も考慮され得る。
技術的な困難のために、表皮と真皮の一部からなる分割厚さの皮膚移植片は、マウスで得ることは困難である。表皮および完全な厚さ真皮から成る完全な厚さの皮の接木は正常な統合のために十分に血管化された創傷の床を要求することが知られている。マウスで分裂厚皮膚移植片を収穫できないことは、このモデルの限界とみなされ得る。レシピエント創傷床への皮膚移植片の固定は、外科用接着剤の塗布を介して達成された、これは組織固定の他の手段と比較してより少ない外傷および急速な劣化に関連する15。これまでの研究では、縫合は、外科的処置15の後の24時間での外科用接着剤よりも強い組織固定に関連することが示されているが、これは処置の欠点と考えられる。しかし、後の時点で、手術用接着剤で治療された創傷の生体力学的強度は縫合糸15に匹敵し、ステープル固定16よりも優れる。手術用接着剤で組織固定に続いて、創傷は創傷のドレッシングで覆われなければならない。マウスの後ろ面の傷は動物が到達しにくいが、傷のドレッシングは、一方で、動物が操作し、除去することは容易である。頻繁な創傷のドレッシングの変更が保証される場合があります。
小さなげっ歯類における麻酔による低体温は、十分に文書化された現象である17.低体温症は、合併症を引き起こし、潜在的に動物の健康とデータの品質の両方を損なうこの手順の副作用です。したがって、この方法は、特にヘアレスSKH1-Hrhrが使用される場合、温度管理戦略の実施を保証する。
マウスを使用してヒトの創傷閉鎖を模倣する最も重要な制限は、皮膚解剖学と生理学の違いです。マウスの創傷は主に収縮を介して治癒し、一方、ヒトの創傷は造粒組織形成および再上皮化18によって治癒する。この不一致を考慮して、現在のモデルは、皮膚収縮を防ぐために傷口の周りにしっかりと付着した副木リングと組み合わせて変更して使用することができる19。このin vivoプロトコルのいくつかの長所と短所を考えると、このモデルは、インビトロで研究することができない創傷治癒に関与する特定のプロセスを研究するためのツールとして役立つ可能性がある。

<table><tbody><tr><td>1 mlシリンゲ</td><td>テルモ</td><td>SS + 01T1</td><td></td></tr><tr><td>26 G 針</td><td>テルモ アガニ</td><td>NN-2613R</td><td>1/2'' - 0,45 X 12mm</td></tr><tr><td>96X21 mm ペトリ皿</td><td>ダッチャー</td><td>193199</td><td></td></tr><tr><td>動物体重計</td><td>カーン</td><td>EMB 5.2K5</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c マウス</td><td>Janvier labs</td><td>BALB/cAnNRj</td><td>6 週齢</td></tr><tr><td>生検フォームパッド30.2X25.4X2mm</td><td>Simport</td><td>M476-1</td><td></td></tr><tr><td>ボンドポリマー リファインレッド</td><td>ライカ バイオシステム</td><td>ズ DS9390</td><td></td></tr><tr><td>真鍮ブロック</td><td>BVG</td><td>カスタム設計</td><td>円形 直径 10 mm</td></tr><tr><td>Buprenorphine (BUPRECARE)</td><td>Axience</td><td>FR/V/6328396 3/2011</td><td>0.05 &mu;g / g</td></tr><tr><td>燃焼装置Kausistar 400</td><td>Tra&ccedil;aMatrix</td><td>34010</td><td></td></tr><tr><td>CaseViewer</td><td>3DHISTECH株式会社</td><td></td><td>3Dhistech, Budapest, Hungary</td></tr><tr><td>コラーゲンI抗体</td><td>Abcam</td><td>ab34710</td><td>推奨濃度 1:50; 1:200</td></tr><tr><td>D-(+)- グルコース (デキストロース)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G-8769-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9432</td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>NIKON</td><td>D3400</td><td>対物レンズ: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45</td></tr><tr><td>脱毛クリーム</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr>使い捨て<tr><td>メス</td><td>Swann Morton</td><td>6601</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN</td><td>バイオテクノロジーP04-36300</td><td></td></tr>エ<tr><td>タノール絶対</td><td>VWR化学物質</td><td>20821.310</td><td></td></tr>フィ<tr><td>ブロネクチン抗体</td><td>Abcam</td><td>ab23750</td>推奨<td>希釈1:1000</td></tr><tr><td>フィルター0.22um</td><td>ザルトリウス</td><td>16532</td><td></td></tr><tr><td>ファインハサミ</td><td>F.S.T.</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>鉗子デュモン</td><td>F.S.T.</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>バリカン</td><td>AESCULAP</td><td>B00VAQ4KUY (ISIS)</td><td></td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>Petelevage</td><td>120070</td><td></td></tr><tr><td>イソフルオラン</td><td>Piramal ヘルスケア</td><td>FR/V/03248850/2011</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>イマルゲン</td><td>FR/V/0167433 4/1992</td><td>外科用麻酔薬、100mg/kg の用量で腹腔内投与</td></tr> 乳<tr><td>酸リンガーズ溶液</td><td>Flee-Flex</td><td>1506443</td><td></td></tr><tr><td>Lamina マルチラベルスライドスキャナー</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS ソフトウェア</td><td>ライカ</td><td></td><td>バージョン 2.7.3</td></tr><tr><td>ライカボンド III</td><td>ライカバイオシステム</td><td>1757</td><td></td></tr><tr><td>ロイコシルクドレッシング</td><td>BSN 医療</td><td>72669-01</td><td></td></tr><tr><td>リドカイン</td><td>Aguettant</td><td>N01BB02</td><td>局所鎮痛薬、0.05 &mu の用量で皮下投与;g/ g</td></tr><tr><td>圧力計</td><td>カーン</td><td>HDB-5K5</td><td></td></tr><tr><td>マッソン トリクローム染色キット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT15-1KT</td><td></td></tr><tr><td>マイクロメッシュ生検カセット</td><td>Simport</td><td>M507</td><td></td></tr><tr><td>多光子倒立スタンド ライカ SP5顕微鏡</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td>DM500</td><td>スキャナー 8000Hz NDD PMT検出器</td></tr><tr><td>非付着ドレッシング 適応</td><td>Systagenix</td><td>A6222</td><td>12.7cm X 22.9 cm</td></tr><tr><td>Ocrygel</td><td>Tvm France</td><td>###パラ</td><td></td></tr><tr><td>セタモール 300mg</td><td>Dolliprane</td><td>Liquiz</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldheyde 4%</td><td>VWR 化学薬品</td><td>1169945</td><td></td></tr><tr><td>ポビドン ヨード</td><td>MEDA pharma</td><td>D08AG02</td><td>1:2</td></tr><tr><td>SKH1-Hrhr マウス</td><td>チャールズ リバー</td><td>686SKH1-HR</td><td>6 週齢</td></tr><tr><td>に希釈スライド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>AGAA000080</td><td></td></tr><tr><td>外科用接着剤</td><td>BSN 医療</td><td>9927</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ガーゼ</td><td>ハルトマン</td><td>418545/9</td><td>10 X 10 cm</td></tr><tr><td>滅菌水</td><td>Versylene Fresenius</td><td>B230521</td><td></td></tr><tr><td>外科用ドレープ</td><td>ハルトマン</td><td>2775161</td><td></td></tr><tr><td>Ti:サファイア カメレオンウルトラ</td><td>コヒーレン</td><td>ト DS 16-02-16 F</td><td>690-1040 nm</td></tr><tr><td>熱画像カメラ</td><td>Testo</td><td>Testo 868</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン (ロンパム 2%)</td><td>、バイエル</td><td>FR/V/ 8146715 2/1980</td><td>外科用麻酔薬、10 mg/kg の用量で腹腔内投与</td></tr></tbody></table>

同種異系皮膚移植片で再建された火傷のマウスモデル

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

些細な表面的な創傷は、第一の意図によって合併症なしで治癒する。完全な厚さの火傷のような深い傷は二次的な意図によって治癒し、外科的デブリドメントおよび皮膚移植を要求する。ドナー移植片をレシピエント創傷床にうまく組み込むのは、免疫細胞のタイムリーな動員、堅牢な血管新生応答および新しい細胞外マトリックス形成に依存する。創傷治癒に関与するいくつかの重要なプロセスを標的とする新規治療剤の開発は、創傷閉鎖の最適化された客観的評価を伴う信頼性の高い前臨床モデルの欠如によって妨げられる。ここでは、同種の皮膚移植片で再現された実験的な全厚焼け創傷の安価で再現可能なモデルについて述べている。創傷はBALB/CおよびSKH1-Hrhrの背景から麻酔付き近血野生型マウスのドーサム表面に誘発される。火傷は直径10mmの真鍮テンプレートを使用して作製され、80°Cに予熱され、20sの一定の圧力で送達されます。プロシージャのための特別な装置は必要とされないし、外科技術は従うことは容易である。この方法は、ほとんどの研究設定で簡単に実装され、再現される可能性があります。特定の制限は、モデルに関連付けられます。技術的な困難のために、薄い分割厚さの皮の接木の収穫は不可能である。ここで説明する外科的方法は、完全な厚さの皮膚移植片を使用して火傷の再建を可能にする。前臨床治療試験を行うために使用してもよい。

この結果は、開発されたプロトコルがマウスの完全な厚さの火傷の誘導を可能にする簡単な方法であることを示している。火傷は、予熱された真鍮テンプレートを使用して誘発される(図1A-C)。焼けた領域は、白いエシャルと悪血帯を持つ円形の傷として表示されます。火傷の大きさは、火傷進行として知られているよく説明された現象の結果として、火傷後24時間でわずかに大きく、急性炎症22による可能性がある。切除後、同種異系皮膚移植を用いて火傷が再構築される(図3)。火傷後7日目に、創傷は血管化5となり、これは生着の成功を示す。表皮角化細胞は、創傷を閉じ、創傷の2つの縁の間のギャップを埋めるために、隣接するレシピエント皮膚から移行する。傷のHおよびE染色部の顕微鏡分析は、火傷後の7日目に、火傷後の7日目に、火傷後の3日目と比較して、表皮の長さが有意に長くなることを明らかにした(図4B)。大規模な研究を行う前に、研究者がパイロット研究を完了することを強くお勧めします, 新しい介入の探査を可能にします, 実現可能性の評価, 再現性を確保するための方法の変更の識別.統計的に有意な効果は小さいサンプルでは検出が難しいのに対し、サンプルサイズを大きくすることは検定の統計的パワーを高める一つの方法です。例えば、グループ間の創傷再皮化率(図4)における統計的に有意な差(p&lt;0.05)を検出するには、サンプルサイズは1群当たり6匹から8匹のマウスの間にあるべきである。 (pすべての実験は少なくとも2回繰り返す必要があります。線維芽細胞などのマトリックス産生細胞として、レシピエント組織から移植片に移行し、コラーゲンIおよびフィブロネクチンを含む細胞外マトリックスの主要成分が新たに形成されたマトリックスにおいて高発現する(図5)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig01.jpg"> 図1:デバイスの設定を書き込む。(A) 燃焼装置の配置とセットアップ。燃焼装置は温度コントローラーに接続され、圧力の監視を可能にするためにデジタル・モノメーターに取り付けられる。燃焼装置は調節可能な段階の上に吊り下げられる – マウスが火傷の誘導のために置かれる平らな表面。(B-C)創傷火傷を誘発するために使用される真鍮のテンプレートのクローズアップ画像。(C)真鍮テンプレートの直径は1cmです<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig01large.jpg" target="_blank">。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig02.jpg"> 図 2: この記事で説明する実験モデルを再現するために必要なさまざまな手順の概略図。手順には3つの主要なステップがあります:(i)予熱された真鍮テンプレートを使用して火傷の誘導。(ii) 火傷後24時間で生存不能な壊死組織の外科的切除;(iii)ドナーマウスから採取した全厚同種皮膚移植片を用いた外科的創傷再建。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig03.jpg"> 図3:再建されたマウス火傷の巨視的な図。火傷後0日目、1日目、3日目、7日目に同種異系皮膚移植片で再建された火傷の代表的なデジタル画像。イメージのルーラーはミリメートル単位です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig04.jpg"> 図4:火傷後3日目および7日目における創傷の顕微鏡的出現。火傷の3日と7日後の傷のH&amp;E染色された部分。(B)7日目の創傷と比較して、(A)3日目のA創傷において、新表皮(B点線)の長さが有意に増加する。(A)および(B)では、スケールバーは100μm(C)の創傷再上皮化の割合を示す図である。Cこれは、3日目および7日目の焼け傷におけるネオ表皮の長さを測定することによって評価し、全創傷長の割合として表した。結果は平均±S.E.M.(n=3日目群の6匹のマウス;n=7日目群の6匹のマウス、*p&lt;0.05;を表す;学生のtテスト)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig05.jpg"> 図5:細胞外マトリックスとコラーゲンIビジュアライゼーションの評価7日目の免疫検査の代表的な画像は、(A)コラーゲンおよび(B)フィブロネクチンに染色されたマウス創傷である。細長いスピンドル形のコラーゲンI陽性細胞に強い赤い染色に注意してください。なお、7日目の創傷の真皮におけるフィブロネクチン陽性細胞における褐色染色。スケールバー= すべての画像で50 μm。(A)と(B)では表皮を示し、dは真皮を示す。(C)コラーゲン繊維の可視化とコラーゲン沈着の組織学的評価(D) TPEF/SHGコラーゲンの7日目のマウス創傷の画像を代表する。同時に、円形偏光とSHG信号を用いたTPEF/SHG取得は、閾値を適用した後にSHGのバイナリ分布を得るために選択的に処理した。TPEF画像(緑色)とSHG画像(白)は擬似色で重ね合ったものでした。スケールバー= 50 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

本研究の目的は、火傷治癒のマウスモデルを開発することであった。熱熱熱は、予熱された真鍮テンプレートを使用してマウスの後部皮膚に誘発された。焼失した組織は、遺伝的に類似したドナーマウスの尾から採取した皮膚移植片で破片化され、重ね合わせた。

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

この手順の全体的な目標は、アレルギー性皮膚移植片で再建された完全な厚さの火傷の再現性のあるマウスモデルを作成することです。皮膚は表皮と真皮の2つの成分に分けられる。真皮の下には皮下脂肪があり、骨、腱、鼻隠しを覆う。火傷の厚さの分類は、多くの場合、火傷の深さの程度を定義するために使用されます。表面的な火傷は表皮のみを伴い、表面的な部分的な厚さの火傷は表皮を伴い、ピローリーまたは上真皮のみを含む。深真皮部分厚い火傷は、表皮および真皮、血管、毛包、油および汗腺を含む網状真皮を含む。完全な厚さの火傷は、皮膚の全体の厚さとおそらく皮下組織の関与を明らかにすることによって特徴付けられます。このタイプの創傷は、収縮または皮膚移植によってのみ治癒することができる。この手順の全体的な目標は、完全な厚さの火傷を作成し、完全な厚さの皮膚移植片で再構築することであった。これは、80°Cに予熱された円形の真鍮ブロックを入れて、20秒間口の皮膚に塗布することによって達成された。壊死組織は、火傷の24時間後に外科的に切除された。ドナーマウスの尾から採取した完全な厚さの皮膚移植片を切除された火傷の上に置いた。移植片は外科用接着剤で固定されます。ドナーとレシピエントの両方の動物は、マウスの同じ近親交配株から来る。生検マウスは、研究の過程で使用されます.しかし、マウスの菌株も使用してもよい。これには、特に創傷治癒研究に有用である免疫担当無毛マウスが含まれる。毛の除去および関連する炎症として、ホボおよび毛髪の再成長は、領域測定および他のタイプの顕微鏡創傷評価時に、デジタル画像分析を妨げない。これは、私たちのバイオ生物と細菌の懸濁液が創傷のあなたの顔に適用され、生物生物シグナルが細菌の成長率を示すために測定される感染のモデルで特に当てはまります。熱熱傷害装置は80°Cに予熱された直径10ミリメートルを測定するカスタムメイドの円形の真鍮のブロックから成っている。真鍮ブロックの温度は赤外線熱画像カメラを使用して確認されます。完全な厚さの火傷を作成するために、真鍮ブロックはデジタル圧力計によって監視される0.15ニュートンの一定の圧力を使用して20秒間適用される。マルチモーダル鎮痛は、侵襲的な動物研究手順における疼痛管理のベストプラクティスです。鎮痛の理想的な投与体制には、先制または手続き前の鎮痛投与が含まれる。1食あたり3ミリグラムのパラセタモールを飲料水に加え、処置の前と72時間前に供給した。1グラム当たり0.05マイクログラムでブプレノルフィンを、処置の30分前に皮下投与し、処置後最初の72時間に対して6時間毎に投与した。1キログラム当たり5ミリグラムのリドカインを、処置の15分前に各マウスのドーサムの周りに皮下投与し、術前に5%デキストロースで200マイクロリットルのラクチンゲル溶液を全量注入し、脱水を予防する処置の6時間後に投与した。マウスは、1キログラムあたり10ミリグラムでキシラジンの腹腔内注射を使用してニセルチドを、1キログラムあたり100ミリグラムでケタミンを使用した。麻酔深さはつま先ピンチで評価できます。麻酔は、瞬き反射を廃止し、角膜水和及び連続的に空気に曝露される眼の維持に必要な涙液膜のリフレッシュを防止し、角膜の水分補給を維持するために眼に潤滑剤を塗布した。各マウスのドーサムを切り取り、脱毛クリームを1分間塗布して髪を取り除きます。ニセルチド動物は平らなテーブルの上に置かれやすく、熱熱熱は20秒間摂氏80度に予熱された円形の真鍮ブロックを適用することによって作成される。マウスは、加熱パッドに戻され、それを暖かく保ち、低体温症を防ぐために、麻酔薬の頻繁な副作用である。麻酔から回復したら、マウスを個々のケージに入れてもよい。火傷の誘発から24時間後。壊死組織は外科的に興奮する。4つの病気の皮膚移植片は、安楽死させたドナーマウス尾から採取される。反対側は尾の下にあるので、マウスモデルを使用している可能性もありますが。したがって、ヒトの応答の程度は、ドナー皮膚移植片の起源によって異なる場合がある。例えば、耳と後ろの皮膚は、尾の皮膚と比較して販売されなくなり、より堅牢な人間の反応を引き起こし、移植片の拒絶につながる可能性があります。皮膚移植片の厚さは、皮膚移植片の着付けに成功した決定因子を果たす可能性があるため、考慮され得る。背中からのような安全な皮膚は、組織の代謝要求が高いために失敗する可能性が高い。その結果、報告された背中の皮膚移植片の発着の成功は、尾部皮膚移植片に対する報告された成功よりも低い。麻酔は、1分間に4リットルの流量で100%酸素中の5%イロフルランを吸入し、手術中の維持のために1分あたり2リットルで2%イオブルランを使用して麻酔を維持することによって誘発された。ブプレノルフィンは術後鎮痛を提供する手順の開始時に投与された。火傷はポビドネヨウ素で準備され、続いて70%のアルコールが続いた。壊死性バーンは、円形の完全な厚さの皮膚欠損を取り除くためにはさみで切除され、皮下のパンニクルカルノーサス層が除去され、安定な皮膚移植片レシピエントベッドを作り出すために、いくつかの著者は、移植片の再血管化に必要であると考えられるように、皮下のパンヌカルヌスカルノーサス層を保存することを示唆している。しかし、この場合、この層の移動性と、移植片とレシピエントベッドの間の潜在的なせん断力が問題になることがあります。パンニクルカルノーサス層の除去は、移植手順の成功に悪影響を及ぼさなかった。完全な厚さの移植片は、安楽死させたドナーマウスの尾から収穫される。尾部は縦方向に切開され、皮膚を下層の軟部組織から分離することができる。尾の皮は、滅菌、通常の生理食い物で満たされたペトリ皿に広がり、定規を使用して円形のパッチにカットされます。その後、移植片は通常の生理食前に浸した滅菌ガーゼを持つペトリ皿に移され、移植の準備ができるまで4度を保つ。移植片は外科用の接着剤で受け取り側のベッドに固定される。ドナー皮膚移植片とレシピエント創傷床の間の隙間は、皮膚の縁を揃えるために静かに押す。傷は不活性パラフィンガーゼおよび粘着性二次ドレッシングの中で服を着ている。移植された創傷のデジタル写真は、火傷後1、3、7日で撮影された。死後、背びれ傷は筋膜に外科的に切除され、創傷は10%緩衝ホルマリンに半分固定され、占星術および免疫検査のために処理された。皮膚移植片は細胞の移動のための足場システムを提供する。正常な移植片の統合は、効率的な線維芽細胞およびレシピエント入札からドナー移植片への移動を行い、細胞外マトリックスを産生できる細胞に置換する。大量創傷の組織学的部分は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を行った。ヘマトキシリンおよびエオシン染色された創傷の切片の代表的な画像は、黄色で強調された表皮付近の長さが7日目に有意に増加することを示し、火傷後3日目と比較した。再表皮化率を推定するために、表皮近くで覆われた創傷の領域を創傷全体の割合として表した。細胞外マトリックスは、皮膚の非細胞成分であり、細胞成分の足場を提供する。細胞外マトリックスは、コラーゲンおよびフィブロネクチンなどの繊維状タンパク質で構成されています。これらの分子は、創傷の成熟を高め、コラーゲンタイプ1の皮膚半定量的免疫組織化学の構造的完全性を維持し、メイソンのトリクロムのような組織学的染色は、フォト顕微鏡写真から細胞外マトリックスの完全性を助けるために使用され得る。第二ハーモニック生成顕微鏡のようなより高度な方法は、コラーゲン構造の定量分析のための強力なツールとして登場しています。マウスの皮膚移植は、レシピエント側へのグラフの統合を調査する優れた潜在的な前臨床モデルを提供する。本研究は、マウスモデルにおける皮膚移植を正常に行う信頼性の高い方法と、治癒創傷の組織学的評価を実証した。

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デジタル加熱装置を使用してマウスの熱傷創傷治癒モデルを確立するための合理化されたプロトコルが提示されます。皮膚上に作成されたチェス盤のような実験部位は、創傷治癒アッセイのためのさらなる機能分析を容易にします。...

デジタル加熱装置に基づくマウスのチェス盤状火傷創傷治癒モデル

学ぶ マウスモデルによる全層熱傷の皮膚移植再建法。同系統マウスを用いた移植片の固定と創傷治癒評価により、創傷治癒メカニズムの解明に貢献する再現性の高い実験系を構築します。

同種異系皮膚移植片で再建された火傷のマウスモデル

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