組み合わせ前駆体等位同位体ラベリングとアイソバリックタギング(cPILOT)を使用した自動サンプル多重化

自動化されたcPILOTプロトコルにより、研究者は高スループットの方法でサンプルを分析することが容易になります。これは、病気や異なる状態に関する生物学的情報をはるかに迅速に取得することができるので、重要です。この手法の主な利点は、複数のサンプルを並列に処理し、高スループットのサンプルを使用しながら、実行可能なエラーを削減できることです。

当研究室は、加齢やアルツハイマー病に関する応用に関心を持っています。しかし、この技術は、生物学的組織が関与している場所に対するあらゆる病気や課題を研究するためにも使用できます。まず、陽圧装置、加熱冷却装置、真空ポンプをオンにします。

すべてのアクセサリを液体ハンドラと接続し、コンピュータに接続して動作する準備ができたら青色の光が表示されます。アリコート300マイクロリットルの肝臓は500マイクロリットルのチューブにホモジュネイトし、2ミリリットルの深いウェルプレートに置く。プロトコルの開始まで、サンプルを摂氏 4 度で保存します。

ソフトウェアでメソッドを開き、必要なヒントとラボウェアをその位置に配置します。次に、最終的なデッキレイアウトをクロスチェックし、[次へ]をクリックしてプロトコルを続行します。230マイクロリットルの先端をロードし、貯蔵所から8大臼歯の90マイクロリットルを吸引する。

その後、黒い2ミリリットルの深い井戸プレートの1つを漕ぐためにそれを分配します。TL1の先端をアンロードし、尿素がすべてのウェルに追加されるまで、このステップを繰り返します。変性バッファーを追加した後、90マイクロリットルのチップを使用して、10マイクロリットルのマウス肝臓ホモジネートを深いウェルプレートに移します。

先端をアンロードし、90マイクロリットルの先端の1列をロードし、試薬プレート1からDTTの3マイクロリットルを吸引します。深い井戸の版の1および2行にDTTを分配する。サンプルプレートをアルミホイルで密封し、300RPMで回転しながら摂氏37度で600秒間インキュベートします。

インキュベーションの後、90マイクロリットルの先端の1列をロードし、3行目に1行目の試薬プレートから6マイクロリットルのIAMを吸引し、サンプルプレートの1つを行に分配します。サンプルプレートを密封し、冷却装置で300RPMで回転しながら30分間摂氏4度でインキュベートします。その後、サンプルプレートをアンシールし、90マイクロリットルの先端の1行をロードします。

2行目の試薬プレート1から5マイクロリットルのシスチンを吸引し、サンプルプレートの1列目と2列に分配する。プレートを室温で30分間インキュベートします。インキュベーションの後、1800 RPMの時振を30分間行う。

その後、サンプルプレート上の各ウェルに塩化カルシウム10ミリモルを含む20ミリモルトリスバッファーの800マイクロリットルを加え、尿素濃度を2モルに希釈します。96ウェルプレートの最初の行にトリプシンの20マイクロリットルを追加し、デッキ上の指定された位置にプレートを配置します。サンプルプレートにトリプシンを加えた後、密封し、冷暖房装置で摂氏37度で15時間、600RPMでインキュベートします。

ギ酸プレートの3行目から5%ギ酸の150マイクロリットルを吸い出し、1行目と2行目のサンプルプレートに分配して消化を止めます。ペプチドを脱塩するに進みます。アセトニトリルの600マイクロリットルを吸引するために1070マイクロリットルの先端を使用してください。

次に、固相抽出の行1と2、またはSPEプレートでそれを分配し、C-18を活性化する。次に、消化したサンプルをSPEプレートに2つのパスでロードします。2列のチップを、消化したサンプルの534マイクロリットルを吸引し、SPEプレートの1行と2行に分配します。

プレートに圧力をかけ、すべてのサンプルがロードされるまでこのステップを繰り返します。水で洗浄してペプチドを洗浄し、0.1%のギ酸で60〜40アセトニトリルでペプチドを希釈します。次に、プレートを回収プレートの上に置き、正圧装置を用いてペプチドを溶出させます。

フロースルーを描き、ソフトウェアに必要なヒントとラボウェアを設定し、デッキレイアウトとクロスチェックし、[次へ]をクリックしてジメチル化のプロトコルを続行します。ペプチドを1%酢酸で再構成する。ジメチル化標識を行うために、試薬プレート2の2列目から90マイクロリットルの先端をロードし、60ミリモル光ホルムアルデヒドの16マイクロリットルを吸引する。

サンプルプレートの1つを行に分配し、先端をアンロードします。90マイクロリットルの先端の1列をロードし、試薬プレート2の行3から60ミリモル重ホルムアルデヒドの16マイクロリットルを吸引します。サンプルプレートの2列目をディスペンスし、先端をアンロードします。

90マイクロリットルの先端を2列積み込み、16マイクロリットルのシアンホロヒドナトリウムと24ミリモルナトリウムシアノボロデテライドを試薬プレート3の行1と2から24ミリモルモルナトリウムを吸い込み、サンプルプレートの1行と2行に試薬を分配してジメチル化反応を開始します。先端をアンロードし、軌道シェーカーを使用して1800 RPMで15分間タイミングを合わせた振りを実行します。その後、90マイクロリットルの先端の2行をロードし、試薬プレート3の行3と4から1%アンモニアの32マイクロリットルを吸引します。

反応を停止するために、サンプルプレート2の行1と2にそれを分配します。脱塩のための新しい2ミリリットルの深い井戸プレートに等しい量の軽い、重いジメチル化されたペプチドを組み合わせる。軽いペプチドと重いペプチドを組み合わせた脱塩後、ペプチドを乾燥させて、等圧タグ付けを行います。

軌道シェーカー上の100ミリモルトリエチルモニウム重炭酸緩衝液の100マイクロリットルでペプチドを再構成する。次に、90マイクロリットルのチップを使用して、結合されたジメチル化ペプチドの25マイクロリットルを吸引し、TMT処理プレートの最初の行に分配します。TMTの90マイクロリットルの先端および吸引10マイクロリットルの1列をロードする。

TMT処理プレートの最初の行にそれを分配し、先端をアンロードし、1800 RPMで1時間の時刻みを行います。TEABプレートの2列目から8マイクロリットルのヒドロキシラミンを吸引し、TMT加工プレートの1つを行に分配します。1800 RPMで15分間振った後、TMT標識ペプチドの30.5マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移します。

次に、原稿の指示に従ってデータ取得と分析を進めます。22 Plex結合前駆体同位体標識および同等圧タグ付け実験から全22レポーターイオンチャネルで同定されたペプチドの代表的なMSデータを示す。ペプチドの配列は、ベタインホモシステインS-メチルトランスファーゼに相当する。

軽いジメチル化ピークと重いジメチル化ピークの両方に対する最も強烈なフラグメントイオンは、MS3断片化のためにさらに単離された。レポーターイオン強度は、サンプル中のペプチドの存在量に直接比例する。全体として、この前駆体同位体標識と同等圧タグ付け実験を組み合わせることで、サンプル処理時間が短縮され、複数のチャネルまたは条件にわたってタンパク質発現を可視化することが可能になりました。

すべての22チャンネルにわたるログ10の豊富さと総レポーターイオン強度の箱ひげ図は、ウェル間またはサンプル間の変動性が低い。全自動化の評価は、22個のサンプル中の各タンパク質におけるレポーターイオン量の誤差を調べることによって行われた。ロボットプラットフォームによるサンプル処理は、変動係数が非常に低い結果を招いた。

3098ペプチドでは、光と重いジメチル化ペプチドの場合、レポーターイオンの量の平均変動係数は12.36%と15.03%であった。このプロトコルを試す場合、同位体レベルと同位体レベルは単一の実験で使用されることを覚えておいてください。したがって、実験で使用するタグを使用して各サンプルを指定するために、慎重な計画を行う必要があります。

この方法は、他のロボットシステムに容易に統合することができ、組織や細胞のライセートおよび他の生体液のような様々な組織に適用することができる。