Name: 組み合わせ前駆体等位同位体ラベリングとアイソバリックタギング(cPILOT)を使用した自動サンプル多重化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶcPILOT法による自動サンプル多重化技術。ロボットプラットフォームを用いた前駆体等位同位体ラベリングとアイソバリックタギングにより、スループットと再現性を向上させ、複数サンプルの並列処理を実現します。

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著者らは、RASRにヴァンダービルト大学スタートアップファンドとNIH賞(R01GM117191)を認めている。

<ol><li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+as+a+diagnostic+and+a+cancer+biomarker+discovery+tool%3A+opportunities+and+potential+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations.</a> Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li>
<li>Qian, W. -J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+liquid+chromatography-mass+spectrometry-based+proteomics+profiling+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).</li>
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<li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays%3A+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li>
<li>Shiio, Y., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteome+analysis+using+isotope-coded+affinity+tags+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry.</a> Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).</li>
<li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMTpro%3A+Design%2C+Synthesis%2C+and+Initial+Evaluation+of+a+Proline-Based+Isobaric+16-Plex+Tandem+Mass+Tag+Reagent+Set%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).</li>
<li>Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((21-plex+DiLue+Isobaric+Tags+for+High-Throughput+Quantitative+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).</li>
<li>Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+%28cPILOT%29+approach+with+selective+MS%283%29+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li>
<li>Robinson, R. A., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sample+multiplexing+for+nitrotyrosine-modified+proteins+using+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li>
<li>King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Sample+Multiplexing+of+Tissues+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+%28cPILOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT).</a> Journal of Visual Experiments. (123), e55406(2017).</li>
<li>King, C. D., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Performance+on+Orbitraps+To+Study+the+Peripheral+Proteome+of+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease.</a> Analytical Chemistry. , (2020).</li>
<li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cPILOT+analysis+of+the+APP%2FPS-1+mouse+liver+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+%26+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> Proteomics & Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li>
<li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+multiplexing+with+cysteine-selective+approaches%3A+cysDML+and+cPILOT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometer%22%5BJournal%5D)">Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).</li>
<li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li>
<li>Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+N%2CN-Dimethyl+Leucine+Isobaric+Tag+Multiplexing+by+a+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).</li>
<li>Gu, L., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer%27s+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li>
<li>Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+to+study+aging+in+rabbit+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227(2020).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

cPILOT は、1 回の実験で最大 24 個のサンプルを分析できる、拡張多重化戦略です。多重化容量は、使用可能な同位体および同位体のタグ付けの組み合わせの数によって異なります。TMTpro7の導入は、1回の実験で16個のサンプルをタグ付けすることができるが、cPILOTの限界を32-plexに押し上げることができる。cPILOTは複数のピペットステップで構成され、サンプル調製を行うために広範な注意とユーザーのスキルを必要とします。エキスパートユーザーでも、手動エラーは避けられず、ロボットプラットフォームを使用してcPILOT戦略のサンプルを処理します。cPILOTはペプチドのpH依存的なタグ付けを利用するので、pHは光および重いジメチル化されたサンプルのセットのために維持される必要がある。軽度の酸性塩基性pHは、N末分およびリジン残基の両方のジメチル化をもたらすことができます。cPILOTの利点は、ペプチドN末端がジメチル基で占められるため、イソバリックタグの半分しか必要としないためです。これにより、より多くのサンプルを半分のコストでラベル付けできます。より大きなサンプル数を処理するには、試薬の暴露時間がバッチ内の最初のサンプルと最後のサンプルに対して類似している必要があります。最大32個のサンプルを並列に収容できるピペットディスペンサーは、ロボット液体ハンドリングデバイスを使用することで最適に達成できます。
cPILOTで複数のサンプルを処理するために、手動ワークフローは自動化を組み込むために修正されました。この研究で使用されるロボット液体ハンドラは、96チャンネルと8チャンネルピペット能力を持つ2つのポッドを備えており、グリッパーは利用可能な28デッキの場所にプレートを配置します。液体ハンドラは、陽圧装置、軌道シェーカー、および96ウェルプレートのサンプルを加熱/冷却する装置と統合されています。正圧装置は、クリーンアップ中にSPEプレートでのバッファ交換を補助し、軌道シェーカーはサンプルの渦/混合に役立ちます。ロボットプラットフォームは、バッファとサンプルを96ウェルプレート、インキュベート、渦サンプル、および転写プレートに吸引し、分配するようにプログラムされました。アセトニトリルや水など、粘度が異なる液体は、この方法にプログラムすることもできる特定のピペット処理の考慮事項を必要とします。
cPILOTワークフローは、BCAによるタンパク質定量から、ペプチドをアイソバリックタグ(すなわちTMT)で標識することまで、液体ハンドラシステム上で行った。完全なプロトコルは、ウェルあたり2 mLを保持できる96の深い井戸プレートを使用するようにスケーリングされました。実験開始前にバッファーを用意し、並列サンプル処理を可能にするように96ウェルプレートに添加した。本研究では、マウス肝臓ホモジネートの22のワークフロー複製を深いウェルプレートに添加し、cPILOTプロトコルを介して取られた。最後に、22-plex等量マウス肝臓タグ付きペプチドからなる単一サンプルを質量分析計に注入した。サンプル中のペプチドの存在量に対応するレポーターイオン強度は、液体ハンドラで処理されたサンプルが手動プロトコル(図示されていないデータ)よりも低いCVを有することを示した。ロボットプラットフォームもサンプル処理の再現性を大幅に向上させました。再現性と堅牢性は、多数のサンプルを処理しながら非常に重要な要素です。ピペットエラーはデータの完全な誤解釈につながる可能性があり、ここではロボットプラットフォームが低いサンプル間変動を提供しました。また、ロボットプラットフォームを使用してcPILOTを行い、サンプルの準備に必要な時間を短縮しました。例えば、自動化された方法を開発した後、手動cPILOTの場合は7.5hと比較して22サンプルを処理するために2.5時間が必要でした。本マニュアルと自動のcPILOTワークフローの比較をさらに評価するための実験が当研究室で行われています。当研究室からの以前の報告に基づいて、手動cPILOTのタンパク質レポーターイオン強度のCV%は平均20%であり、外れ値がこの値12を超えた。
cPILOTは、細胞、組織、体液などの任意のサンプルタイプに使用することができるペプチドレベルでの化学的誘導体化戦略です。cPILOTは、サンプル多重化を強化し、自動化を組み込むことで、プロテオミクスにおけるハイスループットサンプル多重化を容易にします。このスループットは、さらに疾患と生物学的理解とバイオマーカー発見を進めるために必要です。

質量分析(MS)ベースのプロテオミクスは、疾患特有のバイオマーカーの同定、疾患進行の理解、治療開発のリードの創出に欠かせない研究ツールです。これは、血清/血漿、近位体液、および組織1、2などの疾患関連の臨床サンプルの範囲から達成することができる。プロテオミクスバイオマーカーの発見と検証は、サンプル多重化戦略3,4のパワーのために最近大きな検討を得ています。サンプル多重法は、単一のMSインジェクション5,6内で2つ以上のサンプル条件を同時に比較および定量できる技術である。サンプル多重化は、化学、酵素、または代謝タグを含む複数のサンプルからペプチドまたはタンパク質をバーコード化し、1回のMSまたはMS/MS実験ですべてのサンプルからMS情報を取得することによって達成されます。利用可能なアイソバリックタグの中には、イソバリックタグ付け試薬(iTRAQ)、市販のタンデム質量タグ(TMT)、および16-plex7および21-plex8までの機能を持つ家庭用合成イソバリックN、N-ジメチルロイシン(DiLeu)試薬があります。
前駆体同位体標識と同等圧タグ付け(cPILOT)は、多重化技術の強化されたサンプルです。cPILOTは、TMTを使用した後の高pH(8.5)同等体標識に使用できるリジン残基を維持する低pH(〜2.5)のペプチドN末語の同位体標識を光[−(CH3)2]および重い[−−13C2H3)2]に結合する。 DiLeu、またはiTRAQタグ3、9、10、11、12、13、14。cPILOT戦略の二重標識スキームは、例えばペプチドを用いた2つのサンプルを用いた補足図1に描かれている。MS2レベルでのTMTベース定量の精度と精度は、干渉効果15と呼ばれる汚染共分離および共断片化されたイオンの存在により損なわれる可能性がある。不正確なレポーターイオン比のこの制限は、トリブリッドオービトラップ質量分析計の助けを借りて克服することができます。例えば、干渉効果は、質量分析計でMS1レベルのジメチル化対でピークを単離し、直線イオントラップでMS2断片化に光または重いピークを施し、HCD-MS3に最も強いMS2断片を施して定量的情報を得ることによって克服することができる。レポーターイオンを生成するために利用できるリジンアミンを使用せずにペプチドを選択する機会を増やすために、y-1フラグメントに基づく選択的MS3取得も使用でき、cPILOT9で定量可能なペプチドの割合が高くなるアプローチである。軽いラベルと重いラベリングの組み合わせは、個々のアイソバリックタグで達成される2倍の倍率でサンプル多重化能力を増加させます。我々は最近、diLeu試薬16との単一の実験で最大24のサンプルを組み合わせるためにcPILOTを使用しました。さらにcPILOTは、タンパク質ニトレーション17を含む酸化的翻訳後修飾14、他のグローバルプロテオーム9を研究するために使用され、アルツハイマー病マウスモデル11における複数の組織サンプルにわたる応用を実証している。
堅牢なサンプル調製は、cPILOT実験の重要なステップであり、時間がかかり、手間がかかり、広範囲に及ぶ可能性があります。強化されたサンプル多重化には、広範なピペット処理と高度に熟練した研究室の人員が必要であり、実験の再現性に大きく影響する要因がいくつかあります。例えば、サンプルの慎重な取り扱いは、すべてのサンプルに対して同様の反応時間を確保し、軽く、重いジメチル化されたサンプルのための適切な緩衝液pHを維持するために必要である。さらに、数十から数百のサンプルの手動調製は、高い実験誤差を導入することができます。そこで、サンプル調製のばらつきを低減し、定量的精度を向上させ、実験スループットを向上させるため、自動化されたcPILOTワークフローを開発しました。自動化は、ワークフローの多くの側面を完了できるロボット液体ハンドリング装置を使用して達成される(図1)。タンパク質定量からペプチド標識までのサンプル調製を、自動液体ハンドラ上で行った。自動液体ハンドラは、固相抽出(SPE)プレート、軌道シェーカー、および冷暖房装置との間のバッファ交換用の正圧装置(PPA)と統合されています。ロボットプラットフォームは、プレートとバッファに対応する28のデッキ位置を含みます。デッキの位置の版を移すグリッパーが付いている2つのポッドがある:96チャネル固定容積のピペットリングヘッド(5-1100 μL)および8チャネル可変容積の調査(1-1000 μL)。ロボットプラットフォームはソフトウェアを使用して制御されます。ロボット液体ハンドラを使用する前に、ユーザーは専門的に訓練を受ける必要があります。本研究では、1つのバッチで12以上のサンプルを処理するために労力を要する手動cPILOTワークフローを自動化することに焦点を当てています。cPILOTアプローチ11のスループットを向上させるために、cPILOTプロトコルをロボット液体ハンドラに移し、10以上のサンプルを並列に処理した。また、この自動化により、サンプル調製プロセスのさまざまなステップで各サンプルに対して同様の反応が可能となり、高度な訓練を受けたユーザーは手動のcPILOT中に達成する必要がありました。このプロトコルは、cPILOTを実行する自動液体処理装置の実装に焦点を当てています。本研究では、この自動化システムを使用するためのプロトコルを説明し、マウス肝ホモジナートの22プレックス「概念実証」分析を使用してその性能を実証する。

<table><tbody><tr><td>0.6 mL エッペンドルフ チューブ、500 パック</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>05-408-120</td><td>0.6 mL エッペンドルフ チューブの任意のブランドで十分です</td></tr><tr><td>0.65 & マイクロ;m Ultrafree MC DV 遠心フィルターユニット</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30DV00</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL エッペンドルフチューブ、500 個入り</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-408-129</td><td>1.5 mL エッペンドルフチューブのどのブランドでも十分です</td></tr><tr><td>2 ml ブラックディープウェルプレート</td><td>Analytical Sales and Services, Inc.</td><td>59623-23BKGC</td><td>黒の96ウェルプレートの任意のブランドで十分です</td></tr><tr><td>2 mlの透明な深いウェルプレート</td><td>VWR</td><td>75870-796</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>J.T. ベイカー</td><td>9508-01</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル - MS グレード</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>A955-4</td><td>4 L 量は必要ありません</td></tr><tr><td>アジレント 500&micro;Lプレート</td><td>Agilent</td><td>203942-100</td><td>バッファー添加用試薬プレート</td></tr><tr><td>ギ酸アンモニウム</td><td>Acros Organics</td><td>208-753-9</td><td></td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム溶液 (28 - 30%)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>320145-500ML</td><td></td></tr><tr><td>分析天秤</td><td>メトラー・トレド</td><td>AL54</td><td></td></tr><tr><td>BCA タンパク質アッセイキット</td><td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Biomek i7 hybrid</td><td>Beckmann</td><td></td><td>サンプルの正圧、加熱/冷却、ボルテックスを使用する能力を持つ液体処理装置。</td></tr><tr><td>C18 梱包材 (2.5 &micro;メートル、100 &Aring;)</td><td>Bruker</td><td></td><td>この商品はBrukerからの取り扱いは終了しました。記載されている仕様の代替梱包材で十分です</td></tr><tr><td>プレートローター付き遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>69720</td><td></td></tr><tr><td>Micro 21R Centrifuge</td><td>Sorval</td><td>5437</td><td></td></tr><tr><td>Dionex 3000 UHPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>このモデルは販売終了しました。オートサンプラーを備えたnano LCであれば十分です。</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド (13CD2O) 溶液; 20 wt % D2O, 98 原子 % D, 99 原子 % 13C</td><td>Sigma Aldrich, Chemistry</td><td>596388-1G</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド (CH2O) 溶液; 36.5 - 38% H2O</td><td>Sigma Aldrich, Life Science</td><td>F8775-25ML</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Fluka Analytical</td><td>94318-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Fusion Lumos Mass分光計</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>このモデルは現在販売しておりません。他の高分解能装置(Orbitrap Elite、Orbitrap Fusion、Orbitrap Fusion Lumosなど)も使用できます。</td></tr><tr><td>ヒドロキシルアミン塩酸塩</td><td>Sigma Aldrich, Chemistry</td><td>255580-100G</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセアミド (IAM)</td><td>Acros Organics</td><td>144-48-9</td><td></td></tr><tr><td>Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>90061</td><td></td></tr><tr><td>L-1-トシルアミド-2 フェニルエチル cholormethyl ketone (TPCK) 処理 ウシ膵臓由来のトリプシン</td><td>Sigma Aldrich, Life Science</td><td>T1426-100MG</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Aldrich, Chemistry</td><td>168149-25G</td><td></td></tr><tr><td>メカニカルホモジナイザー (FastPrep-24 5G)</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>pH 10 バッファー</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-261</td><td>任意のブランドの pH バッファー 10 で十分</td></tr><tr><td>pH 7 バッファー</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-260</td><td>任意のブランドの pH バッファー 7 で十分な</td></tr><tr><td>pH メーター (TrisFisher</td> <td>Scientific (Accumet)</td><td>13-620-183</td><td>どのブランドのpHメーターでも十分</td></tr><tr><td>タンパク質ソフトウェア (例: Proteome Discoverer)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reservior plate 200ml</td><td>Agilent</td><td>204017-100</td><td></td></tr><tr><td>シアノボロデウテリドナトリウム; 96 atom % D, 98%</td><td>CP Sigma Aldrich, Chemistry</td><td>190020-1G</td><td></td></tr><tr><td>シアノボロ水素化ナトリウム; 試薬グレード、95%</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>156159-10G</td><td></td></tr><tr><td>Speed-vac</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>SPD1010</td><td>ディープウェルプレートを収容できるスピードバックの任意のブランドで十分です</td></tr><tr><td>攪拌プレート</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>攪拌プレートの任意のブランドで十分です</td></tr><tr><td>タルガ 20 mg SPE プレート</td><td>ネスト グループ、Inc.</td><td>HNS S18V</td><td>これらはC18カートリッジです</td></tr><tr><td>トリエチルアンモニウム重炭酸塩(TEAB)バッファー</td><td>シグマアルドリッチ、ライフサイエンス</td><td>T7408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>バイオラッド</td><td>161-0716</td><td></td></tr><tr><td>バイオメック 24 プレース チューブ ラック ホルダー</td><td>ベックマン</td><td>373661</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>バイオラッド</td><td>161-0731</td><td></td></tr><tr><td>水 - MS グレード</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>W6-4</td><td>4 L量は不要</td></tr></tbody></table>

組み合わせ前駆体等位同位体ラベリングとアイソバリックタギング(cpilot)を使用した自動サンプル多重化

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

我々は、高スループット定量プロテオミクスワークフローを導入し、タンデム質量タグまたは等圧N、N-ジメチルロイシン等圧タグをそれぞれ有する最大22または24サンプルの多重化が可能な前駆体同位体標識および同等圧タグ(cPILOT)を組み合わせた。この強化されたサンプル多重化は質量分析の獲得時間をかなり減らし、高価な商業イソバリック試薬の有用性を高める。ただし、この戦略のサンプル処理とピペッティング手順の手動プロセスは、労力を要し、時間がかかり、サンプルロスと定量誤差を発生させる可能性があります。これらの制限は、自動化の組み込みによって克服することができます。ここでは、手動cPILOTプロトコルを、大量のサンプル数(すなわち96サンプル)を並列に調製できる自動液体処理装置に移しました。全体的に、自動化はcPILOTの実現可能性および再現性を高め、同等のオートメーション装置を有する他の研究者による広い使用法を可能にする。

図2は、ワークフロー複製を含む22-plex cPILOT実験から22個のレポーターイオンチャネルすべてで同定されたペプチドの代表的なMSデータを示す。図2(上)は、ペプチドに組み込まれた単一のジメチル基を示す4Da m/z間隔で分離された二重に荷電したピーク対を示す。軽くかつ重いジメチル化されたピークペアを分離し、独立して断片化してペプチドの配列を得た。ペプチドの配列はG(ジメチル)AAELMQQK(TMT-11plex)であり、タンパク質ベタインホモシステインS-メチルトランスレポナーゼに相当する。軽いジメチル化ピークと重いジメチル化ピーク(図示せず)の両方に対する最も強烈なフラグメントイオンは、MS3断片化のためにさらに単離され、レポーターイオン(m/z 126-131)が図2(下)に示されている。レポーターイオン強度は、サンプル中のペプチドの存在量に直接比例する。サンプルのペプチドの豊富さは、ロボットプラットフォームのピペット能力が22のサンプルにわたってかなり均一であることを意味します。全体として、この22-plex cPILOT実験は、3098(6137光/5872重)ペプチドから生じた1326(1209-light/1181-ヘビー)タンパク質同定をもたらした(表4)。図3は、全22チャンネルのlog10の豊富さと総レポーターイオン強度の箱ひげ図を示し、より少ないウェル/サンプル間変動性を示しています。全自動化の評価は、22個のサンプル中の各タンパク質におけるレポーターイオン量の誤差を調べることによって行われた。図 4は、ロボット プラットフォームでのサンプル処理の結果、CV 値が非常に低い結果となったことを示しています。具体的には、レポーターイオンの量の平均CVを同定した3098ペプチドは、それぞれ軽いジメチル化ペプチドと重いジメチル化ペプチドに対して12.36%と15.03%であった。これらのペプチドのうち2032個のペプチドは、レポーターイオンシグナルが最小閾値を超えており、定量可能と見なされた。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig1.jpg"> 図 1.自動化されたcPILOTプロトコルと並行して22サンプルを処理する実験的なワークフロー。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig2.jpg"> 図 2.22サンプルにわたるペプチドの定量化。 例えば、ペプチドG(ジメチル)AAELMQQK(TMT-11plex)のサンプルMS(上)およびMS3( 下段)スペクトルは、22プレックスの自動cPILOT実験で、軽二メチル化(左下)および重ジメチル化(右下)ピークに対する定量化した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig3.jpg"> 図 3.プロテオーム発見器2.3を用いた22サンプルの総レポーターイオン強度対log10の豊富さの箱ひげ図。 RAWファイルは、軽くて重いペプチド、動的修飾としてTMTと別々にタンパク質ID、光(+28.031 Da)および重い(+36.076&amp;+35.069 Da)のジメチル化を静的修飾として2回検索した。上記の全ての修飾との組み合わせ検索を、Proteome Discover 2.3を使用して、すべてのチャネルにわたって10個のペプチド強度のログを得るために実行しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig4.jpg"> 図 4.チャンネル全体のレポーターイオン強度の合計からペプチドの豊富さの変化の共効率のバイオリンプロット 126-131 m/z. このペプチドは、光(2373)および重い(2533)定量可能なペプチドに対して12.36および15.03の平均CV値で定量化した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図 1.単一のペプチドを有するcPILOTの図示。TMT126を用いた2つの異なるサンプルと同一体型タグ付けの同位体標識を示し、得られた混合物をLC-MS3用のMSに注入した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342supfig1large.jpg" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>変数名</td>
			<td>値</td>
			<td>説明</td>
		</tr>
<tr>
<td>デソルトサンプ1</td>
			<td>1065</td>
			<td>デソルトの手順 1 に使用するボリューム</td>
		</tr>
<tr>
<td>デソルトサンプ2</td>
			<td>392</td>
			<td>デソルト・ステップ 2 に使用するボリューム</td>
		</tr>
<tr>
<td>デソルトサンプ3</td>
			<td>100</td>
			<td>デソルトの手順 3 に使用するボリューム</td>
		</tr>
<tr>
<td>Devmode</td>
			<td>False</td>
			<td>False はインキュベーション時間を 30 秒に短縮します- True はプロトコルのインキュベーションタイミングに従います。</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTTVol</td>
			<td>3</td>
			<td>DTT の体積</td>
		</tr>
<tr>
<td>フィルタープレート</td>
			<td>タルガ</td>
			<td>脱塩に使用されるプレート</td>
		</tr>
<tr>
<td>フィルタープレートボル</td>
			<td>600</td>
			<td>脱塩量</td>
		</tr>
<tr>
<td>ハウォーターワッシュ</td>
			<td>False</td>
			<td>SPEプレートの水の水の打ち上げられる回数</td>
		</tr>
<tr>
<td>イマサイアボル</td>
			<td>2</td>
			<td>ヨウドアセアセタミドの体積</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペプチドTMTVol</td>
			<td>12.5</td>
			<td>TMTラベリング用ペプチドの体積</td>
		</tr>
<tr>
<td>圧力</td>
			<td>100</td>
			<td>PPAでのmbar圧力</td>
		</tr>
<tr>
<td>一時オフセット</td>
			<td>1</td>
			<td>温度変化</td>
		</tr>
<tr>
<td>TMTVol</td>
			<td>10</td>
			<td>追加するアイソバリックタグボリューム</td>
		</tr>
<tr>
<td>トリスボル</td>
			<td>800</td>
			<td>消化前にサンプルを希釈する量</td>
		</tr>
<tr>
<td>トリプシンボル</td>
			<td>2</td>
			<td>トリプシンの体積</td>
		</tr>
<tr>
<td>使用ポタイマー</td>
			<td>True</td>
			<td>True は、必要に応じてプレートに圧力を適用するオプションを表示します。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1.自動化された cPILOT プロトコルで使用される変数のリスト。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>ディルソース</td>
			<td>ディルウェル</td>
			<td>Dest</td>
			<td>デストウェル</td>
			<td>ディルボリューム</td>
			<td>ストックソース</td>
			<td>ストックウェル</td>
			<td>サンプルボル</td>
			<td>サンプル ID</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>A1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>A2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>A3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>A4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>A5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>A6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>A7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>A8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>A9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>A10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>A11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>A12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>B1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>B2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>B3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>B4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>B5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>B6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>B7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>B8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>B9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>21</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>B10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>22</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>B11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>23</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>B12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>24</td>
		</tr></tbody></table>表 2.マウス肝ホモジネートおよび8 M尿素の体積。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>ソースウェル</td>
			<td>ソースウェル2</td>
			<td>レポーターイオン</td>
			<td>デストウェル1</td>
			<td>デストウェル2</td>
			<td>ボリューム</td>
			<td>サンプル ID</td>
		</tr>
<tr>
<td>A1</td>
			<td>C1</td>
			<td>126</td>
			<td>A1</td>
			<td>E1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>A3</td>
			<td>C3</td>
			<td>127N</td>
			<td>A2</td>
			<td>E2</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>A5</td>
			<td>C5</td>
			<td>127C</td>
			<td>A3</td>
			<td>E3</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>A7</td>
			<td>C7</td>
			<td>128N</td>
			<td>A4</td>
			<td>E4</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>A9</td>
			<td>C9</td>
			<td>128C</td>
			<td>A5</td>
			<td>E5</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>A11</td>
			<td>C11</td>
			<td>129N</td>
			<td>A6</td>
			<td>E6</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2</td>
			<td>D2</td>
			<td>129C</td>
			<td>A7</td>
			<td>E7</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>B4</td>
			<td>D4</td>
			<td>130N</td>
			<td>A8</td>
			<td>E8</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>B6</td>
			<td>D6</td>
			<td>130C</td>
			<td>A9</td>
			<td>E9</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>B8</td>
			<td>D8</td>
			<td>131N</td>
			<td>A10</td>
			<td>E10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B10</td>
			<td>D10</td>
			<td>131C</td>
			<td>A11</td>
			<td>E11</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3.ペプチド、タンパク質、ペプチドスペクトルマッチ(PSM)の総数。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">自動cPILOT</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>光</td>
			<td>重い</td>
		</tr>
<tr>
<td>タンパク質</td>
			<td>1209</td>
			<td>1181</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペプチド</td>
			<td>6137</td>
			<td>5872</td>
		</tr>
<tr>
<td>PSM</td>
			<td>14948</td>
			<td>16762</td>
		</tr>
</tbody></table>表 4.軽くて重いラベル付きサンプルを使用して、アイソバリックタグをバーコード化します。

前駆体同位体標識とアイソバリックタグ(cPILOT)は、利用可能なアイソバリックタグで同時に分析できるサンプル数を増やすことができる、強化されたサンプル多重化戦略です。ロボットプラットフォームの組み込みにより、実験のスループット、再現性、定量的精度が大幅に向上しました。

組み合わせ前駆体等位同位体ラベリングとアイソバリックタギング(cPILOT)を使用した自動サンプル多重化

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

自動化されたcPILOTプロトコルにより、研究者は高スループットの方法でサンプルを分析することが容易になります。これは、病気や異なる状態に関する生物学的情報をはるかに迅速に取得することができるので、重要です。この手法の主な利点は、複数のサンプルを並列に処理し、高スループットのサンプルを使用しながら、実行可能なエラーを削減できることです。当研究室は、加齢やアルツハイマー病に関する応用に関心を持っています。しかし、この技術は、生物学的組織が関与している場所に対するあらゆる病気や課題を研究するためにも使用できます。まず、陽圧装置、加熱冷却装置、真空ポンプをオンにします。すべてのアクセサリを液体ハンドラと接続し、コンピュータに接続して動作する準備ができたら青色の光が表示されます。アリコート300マイクロリットルの肝臓は500マイクロリットルのチューブにホモジュネイトし、2ミリリットルの深いウェルプレートに置く。プロトコルの開始まで、サンプルを摂氏 4 度で保存します。ソフトウェアでメソッドを開き、必要なヒントとラボウェアをその位置に配置します。次に、最終的なデッキレイアウトをクロスチェックし、[次へ]をクリックしてプロトコルを続行します。230マイクロリットルの先端をロードし、貯蔵所から8大臼歯の90マイクロリットルを吸引する。その後、黒い2ミリリットルの深い井戸プレートの1つを漕ぐためにそれを分配します。TL1の先端をアンロードし、尿素がすべてのウェルに追加されるまで、このステップを繰り返します。変性バッファーを追加した後、90マイクロリットルのチップを使用して、10マイクロリットルのマウス肝臓ホモジネートを深いウェルプレートに移します。先端をアンロードし、90マイクロリットルの先端の1列をロードし、試薬プレート1からDTTの3マイクロリットルを吸引します。深い井戸の版の1および2行にDTTを分配する。サンプルプレートをアルミホイルで密封し、300RPMで回転しながら摂氏37度で600秒間インキュベートします。インキュベーションの後、90マイクロリットルの先端の1列をロードし、3行目に1行目の試薬プレートから6マイクロリットルのIAMを吸引し、サンプルプレートの1つを行に分配します。サンプルプレートを密封し、冷却装置で300RPMで回転しながら30分間摂氏4度でインキュベートします。その後、サンプルプレートをアンシールし、90マイクロリットルの先端の1行をロードします。2行目の試薬プレート1から5マイクロリットルのシスチンを吸引し、サンプルプレートの1列目と2列に分配する。プレートを室温で30分間インキュベートします。インキュベーションの後、1800 RPMの時振を30分間行う。その後、サンプルプレート上の各ウェルに塩化カルシウム10ミリモルを含む20ミリモルトリスバッファーの800マイクロリットルを加え、尿素濃度を2モルに希釈します。96ウェルプレートの最初の行にトリプシンの20マイクロリットルを追加し、デッキ上の指定された位置にプレートを配置します。サンプルプレートにトリプシンを加えた後、密封し、冷暖房装置で摂氏37度で15時間、600RPMでインキュベートします。ギ酸プレートの3行目から5%ギ酸の150マイクロリットルを吸い出し、1行目と2行目のサンプルプレートに分配して消化を止めます。ペプチドを脱塩するに進みます。アセトニトリルの600マイクロリットルを吸引するために1070マイクロリットルの先端を使用してください。次に、固相抽出の行1と2、またはSPEプレートでそれを分配し、C-18を活性化する。次に、消化したサンプルをSPEプレートに2つのパスでロードします。2列のチップを、消化したサンプルの534マイクロリットルを吸引し、SPEプレートの1行と2行に分配します。プレートに圧力をかけ、すべてのサンプルがロードされるまでこのステップを繰り返します。水で洗浄してペプチドを洗浄し、0.1%のギ酸で60〜40アセトニトリルでペプチドを希釈します。次に、プレートを回収プレートの上に置き、正圧装置を用いてペプチドを溶出させます。フロースルーを描き、ソフトウェアに必要なヒントとラボウェアを設定し、デッキレイアウトとクロスチェックし、[次へ]をクリックしてジメチル化のプロトコルを続行します。ペプチドを1%酢酸で再構成する。ジメチル化標識を行うために、試薬プレート2の2列目から90マイクロリットルの先端をロードし、60ミリモル光ホルムアルデヒドの16マイクロリットルを吸引する。サンプルプレートの1つを行に分配し、先端をアンロードします。90マイクロリットルの先端の1列をロードし、試薬プレート2の行3から60ミリモル重ホルムアルデヒドの16マイクロリットルを吸引します。サンプルプレートの2列目をディスペンスし、先端をアンロードします。90マイクロリットルの先端を2列積み込み、16マイクロリットルのシアンホロヒドナトリウムと24ミリモルナトリウムシアノボロデテライドを試薬プレート3の行1と2から24ミリモルモルナトリウムを吸い込み、サンプルプレートの1行と2行に試薬を分配してジメチル化反応を開始します。先端をアンロードし、軌道シェーカーを使用して1800 RPMで15分間タイミングを合わせた振りを実行します。その後、90マイクロリットルの先端の2行をロードし、試薬プレート3の行3と4から1%アンモニアの32マイクロリットルを吸引します。反応を停止するために、サンプルプレート2の行1と2にそれを分配します。脱塩のための新しい2ミリリットルの深い井戸プレートに等しい量の軽い、重いジメチル化されたペプチドを組み合わせる。軽いペプチドと重いペプチドを組み合わせた脱塩後、ペプチドを乾燥させて、等圧タグ付けを行います。軌道シェーカー上の100ミリモルトリエチルモニウム重炭酸緩衝液の100マイクロリットルでペプチドを再構成する。次に、90マイクロリットルのチップを使用して、結合されたジメチル化ペプチドの25マイクロリットルを吸引し、TMT処理プレートの最初の行に分配します。TMTの90マイクロリットルの先端および吸引10マイクロリットルの1列をロードする。TMT処理プレートの最初の行にそれを分配し、先端をアンロードし、1800 RPMで1時間の時刻みを行います。TEABプレートの2列目から8マイクロリットルのヒドロキシラミンを吸引し、TMT加工プレートの1つを行に分配します。1800 RPMで15分間振った後、TMT標識ペプチドの30.5マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、原稿の指示に従ってデータ取得と分析を進めます。22 Plex結合前駆体同位体標識および同等圧タグ付け実験から全22レポーターイオンチャネルで同定されたペプチドの代表的なMSデータを示す。ペプチドの配列は、ベタインホモシステインS-メチルトランスファーゼに相当する。軽いジメチル化ピークと重いジメチル化ピークの両方に対する最も強烈なフラグメントイオンは、MS3断片化のためにさらに単離された。レポーターイオン強度は、サンプル中のペプチドの存在量に直接比例する。全体として、この前駆体同位体標識と同等圧タグ付け実験を組み合わせることで、サンプル処理時間が短縮され、複数のチャネルまたは条件にわたってタンパク質発現を可視化することが可能になりました。すべての22チャンネルにわたるログ10の豊富さと総レポーターイオン強度の箱ひげ図は、ウェル間またはサンプル間の変動性が低い。全自動化の評価は、22個のサンプル中の各タンパク質におけるレポーターイオン量の誤差を調べることによって行われた。ロボットプラットフォームによるサンプル処理は、変動係数が非常に低い結果を招いた。3098ペプチドでは、光と重いジメチル化ペプチドの場合、レポーターイオンの量の平均変動係数は12.36%と15.03%であった。このプロトコルを試す場合、同位体レベルと同位体レベルは単一の実験で使用されることを覚えておいてください。したがって、実験で使用するタグを使用して各サンプルを指定するために、慎重な計画を行う必要があります。この方法は、他のロボットシステムに容易に統合することができ、組織や細胞のライセートおよび他の生体液のような様々な組織に適用することができる。

automated-sample-multiplexing-using-combined-precursor-isotopic

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析（UPLC-MS）による血清中の大規模非標的メタボロームプロファイリング

組み合わせ前駆同位体標識およびアイソバリックタグ（cPILOT）は、アイソバリックタグのサンプル多重化機能を強化し、定量プロテオミクス戦略です。このプロトコルは、アルツハイマー病のモデルマウスと野生型対照からの組織へのcPILOTの適用を説明しています。...

拡張サンプル複合前駆同位体標識と同重体タグ付けを使用して組織の多重化（cPILOT）

このプロトコルでは、定量的かつ包括的に複数の栄養源の代謝を調査する実験手順について説明します。このワークフローは、同位体トレーサー実験と分析手順の組み合わせに基づいて決定する微生物による消費された栄養素の運命と分子 synthetized...

複数の栄養源の微生物代謝を調査するため同位体トレーサー実験の組み合わせに基づいてワークフロー

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