複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

このプロトコルは、グリアが地域的に不均一、形態学的、機能的、遺伝的に不均一であることを学んでいるため、重要です。この手法の主な利点は、中枢神経系の4つの異なる領域から3つの別々のグリアサブセットを研究できることです。この手順を実演するのは、私自身と、私の研究室の大学院生であるレイチェル・ティンキーです。

細いハサミを使用して、子犬の頭の正中線に沿って皮膚層を切り取り、尾側から始まり、鼻に達するまで吻側を動かします。組織の損傷を防ぐために、頭蓋骨に深く切り込むことは避けてください。頭を下に傾けて、皮膚層を頭蓋骨の両側に引っ張り、スプリングハサミを使用して、大孔から始めて頭蓋骨の正中線に沿って切開を行います。

皮質、小脳、脳幹を露出させる細い先端の鉗子で頭蓋骨の半分を引き離します。露出したら、脳を頭蓋骨からそっと持ち上げ、10ミリリットルのPBSと抗生物質溶液を入れた10センチメートルのシャーレに入れます。後脳が付着した状態で脳が損傷を受けていないことを確認します。

細かく湾曲した先端の鉗子で小脳をつまみます。氷の上の指定された15ミリリットルの円錐形チューブに入れます。中脳を皮質から分離します。

皮質髄膜を取り外し、指定された円錐管に入れます。髄膜が完全に除去されることを確認するために、組織を注意深く検査する必要があります。髄膜細胞が培養物に残っていると、グリア細胞の増殖に悪影響を及ぼす可能性があります。

脊髄を解剖するには、脊髄を腹側を上にして置き、細いスプリングハサミを使用して椎骨を切断し、脊髄組織が露出するまで左右を交互に繰り返します。脊髄と髄膜をそっと取り除き、氷の上の指定された円錐形のチューブに入れます。0.05%トリプシンと0.53ミリモルEDTAの1ミリリットルをティッシュのある各チューブに加えます。.

10ミリリットルのピペットで混合物を約20回粉砕します。次に、細胞懸濁液を空の50ミリリットルの円錐管に移します。溶液を摂氏37度、二酸化炭素5%で15分間インキュベートします。

8分後にライセートを穏やかに撹拌します。インキュベーション後、5ミリリットルのMGMと200マイクロリットルのDNase Iを各チューブに1つずつ加えて、最終濃度を1ミリリットルあたり50マイクログラムにします。10ミリリットルのピペットで各ライセートを10回粉砕します。

次に、細胞懸濁液を室温で3分間放置し、解離していない組織がチューブの底に沈殿するのを待ちます。細胞懸濁液を新しい50ミリリットルの円錐管に移し、解離していない組織を残します。遠心分離後、細胞ペレットを5ミリリットルのMGMに再懸濁し、それを20回粉砕し、コーティングされたT25フラスコに細胞懸濁液をプレートし、細胞を摂氏37度および5%二酸化炭素でインキュベー

24時間後に培地を交換して、細胞の破片を取り除きます。オリゴデンドロサイト前駆細胞の単離を行うには、細胞を15時間振とうした後、フラスコから上清を取り除き、滅菌シャーレにプレートします。上清を摂氏37度と二酸化炭素5%で30分間インキュベートします。

15分後に渦を巻いて、残っているミクログリアを取り除きます。非接着性の細胞上清を除去し、細胞をカウントし、Poly-D-Lysineコーティングされた表面に所望の濃度でプレートします。細胞をインキュベーターに少なくとも1時間戻します。

次に、培地の95%を静かに吸引し、温かいOPC培地をゆっくりと加え、OPCの混乱を最小限に抑えるためにウェルの壁にピペットで貼り付けます。この方法を使用して、インターフェロンガンマシグナル伝達がOPCの分化と成熟に影響を与えることを実証しました。インターフェロンガンマ受容体がなければ、皮質OPCは成熟した有髄性オリゴデンドロサイトに分化しないと容易に述べており、これはMBP染色の欠如によって証明されています。

GFAPの発現も解析した。インターフェロンガンマ欠損細胞はGFAPを強く発現しており、アストロサイト表現型を採用している可能性が示唆されています。CNS細胞の局所的な不均一性は、皮質、小脳、脳幹、脊髄の星状細胞の形態が異なることによって証明されています。

同じ領域のアストロサイトも形態学的不均一性を示す可能性があり、このグリアサブタイプが非常に動的であるという考えを裏付けています。異なるサイトカイン刺激に対するOPCの局所応答も調査されました。サイトカインシグナル伝達は、幹細胞や免疫細胞の挙動に大きく影響し、OPCが成熟した有髄オリゴデンドロサイトに分化する方法に影響を与える可能性があります。

その後、局所グリア細胞単離細胞は、免疫組織化学、定量的リアルタイムPCR、ウェスタンブロッティングなどのいくつかの技術を用いて、さまざまな実験条件や酸で使用できます。