Name: 新生児マウスにおける低酸素虚血期における連続映像脳波 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学ぶ新生児マウスの低酸素虚血期における連続映像脳波記録法。深部電極を用いててんかん発作の電気的活動と行動を関連付け、新生児脳症の治療戦略開発に貢献する神経発達メカニズムの理解を深めます。

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我々は、次の資金源を認める: NIH NINDS – K08NS101122 (JB), R01NS040337 (JK), R01NS044370 (JK), バージニア大学医学部 (JB).

すべての動物研究は、バージニア大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. 電極建物/ケーブルビルディング
<ol><li>単極絶縁ステンレス鋼線(0.005"裸径0.008"被覆)を使用して、メスソケットコネクタ(メスレセプタクルコネクタ0.079)で接続された電極を作ります。</li>
	<li>特別なカスタムケーブルを使用して、動物をアンプに接続します。<ol>
<li>オスの4ピンコネクタ(オスコネクタ0.079")を4チャンネルユニティゲインインピーダンスマッチングオペアンプ(op-amp)に取り付けます。9 V バッテリに接続するワイヤに 10K の抵抗を接続します。オペアンプに接続されていないアース線は、バッテリーの中点として機能します。</li>
		<li>ケーブルの一方の端(AWG、0.012"OD)をop-ampに接続し、ケーブルのもう一方の端をアンプに接続します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 電極注入手術
<ol><li>下向きのフローフードで4-5%のイオブルランで子犬(出生後9日目)を麻酔します。手順の開始前に、ブピバカイン(0.02-0.05 mL、0.25%皮下局所浸潤)で子犬を注入する。</li>
	<li>動物が不動になったら、鼻コーンで立体的な段階に移します。耳をしっかり止めるには柔らかいので、イヤーバーの裏側を使用します。この年齢では、子犬は耳棒の尖った端を使用するために完全に発達した耳を持っていません。</li>
	<li>イオフルランの流れを下げ、2.5~3%に維持します。手術を通して子犬の安定した呼吸に目を光らせる。尾をつまんで痛みの反応を確認し、切開に進みます。</li>
	<li>頭蓋骨の切開領域をベタジンとアルコール(ヨウ素と70%エタノールの3サイクル交互)で殺菌する。切開領域が見えるように周囲の身体部分をドレープする。</li>
	<li>目の上から頭皮前部後部を開き、約0.5cmの皮膚を引き込みます。皮膚が頭蓋骨を露出して外側に引っ張るように、ステレオタックスステージ上でマウスの頭を再配置します。</li>
	<li>綿棒を使用して頭蓋骨に過酸化水素を塗布し、メスの刃を使用して頭蓋骨をきれいに削ります。頭蓋骨は非常に柔らかいです。擦り傷をしながら注意を払ってください。</li>
	<li>接着剤を1滴(約50μL)塗布し、そのアプリケータを使用して露出した頭蓋骨領域の周りに広げます。40sの紫外線に露出して接着剤をセットします。</li>
	<li>参照として、露出したブレグマを使用して座標を測定します。海馬のCA1領域に両側電極を移植する [-3.5 mm側側腹孔(DV),±2mm内側側面(ML)、-1.75mm深部(D)、頭頂皮質内の両側[-1.22mm DV、±0.5mm D]および小脳内の参照電極。32G針を使用して、マークされた領域に穴を開けます。</li>
	<li>頭蓋骨の表面から血液をきれいにします。立体的な腕の助けを借りて脳に女性のソケットコネクタに取り付けられた下の電極と歯科アクリルで所定の位置に固定します。脳に電極を埋め込む。ソケットコネクタヘッドセットは、歯科アクリルで接着頭蓋骨の上に座っています。</li>
	<li>電極が固定されたら、ケトプロフェン(5mg/kg)を皮間領域に皮下に注入します。子犬を母親と一緒に戻します。 注:一度に1つずつ導入するのではなく、一度にヘッドセットでゴミの半分を導入してください。これは、母親が子犬のヘッドセットを損傷するのを防ぎます。</li>
</ol>3. EEGのセットアップと記録(ベースライン/プレ傷害)
<ol><li>電極注入後24時間の回収後、各動物をEEG記録用の加熱(37°C)カスタムメイドのプレキシグラスチャンバーに入れます。このチャンバーは低酸素室としても機能します。</li>
	<li>柔軟なケーブル(カスタムメイドのオペアンプケーブル)を介してビデオ-EEG監視システムにチャンバー内の子犬を接続します。 メモ:ヘッドセットを設置すると、マウスは自由に移動可能で、動作に違いはありません。電極ワイヤーに取り付けられたら、ワイヤーは、子犬がチャンバー全体を自由に移動できるように、適切な量の緩みを提供するためにチャンバーテザー内で調整する必要があります。</li>
	<li>草のアンプを使用して1Kゲインで1000 HzでEEGデータをデジタル化します。ソフトウェア(例えば、LabChart Pro)を使用して、後でEEG信号(3〜70 Hzの間のバンドパスフィルタ)を確認してください。</li>
	<li>頸動脈結紮術のために動物を切断する前に、傷害前のベースラインEEGを30分間記録する。</li>
</ol>4. 左頸動脈結紮
<ol><li>下向きのフローフードで4-5%のイオブルランで子犬(出生後10日目)を麻酔し、ウォーターバスパッドに特別に配置されたセットアップに置きます。動物のスピージンを配置し、紙テープで前肢を固定します。<ol>
<li>イオブルランの流れを2~3%に下げる。痛みの反応のために尾をつまみ、手順全体の呼吸を監視します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ベタジンとアルコール(ヨウ素と70%エタノールの3サイクル)で首の左側の切開領域(下顎骨と鎖骨の間)を殺菌します。</li>
	<li>マイクロシザーを使用して、首の左側に約1cmの長さの切開を行います。解剖顕微鏡を用いて、皮下組織と皮膚を慎重に引き込み、頸動脈を露出させる。迷走神経(動脈に横向きに走る)を特定し、動脈から繊細に分離して引き込むのに注意してください。</li>
	<li>マイクロ鉗子を使用して動脈の下に長さ5cmの無菌シルク縫合糸を通す。動脈の周りに二重結び目の縫合糸を結んで、閉塞流れにします。</li>
	<li>余分な縫合糸をカットし、皮下組織と皮膚を引き戻すことによって露出した動脈を閉じます.切開を密封するために獣医の結合を使用してください。</li>
	<li>動物を温かいマットレスの上に置かれる室温の部屋の連続的なEEGの監視に戻す。チャンバーを開けないように、子犬のコア温度のスポット赤外線温度チェックを取ります。動物が低酸素症の前に1時間回復することを許可します。</li>
</ol>5. EEGと低酸素症
<ol><li>酸素モニターを介してチャンバー内のFiO2 (インスパイアされた酸素の一部)を継続的に監視します。</li>
	<li>100%N2 の60 L/minと100%O2のための0.415 L /分でチャンバーを洗い流す。チャンバーの酸素飽和度が12%に達したら、O2の流れを変えずにN2 の流れを10 L/分に減らします。小さな調整で、45分間8%でFiO2 を維持します。</li>
	<li>低酸素暴露の45分後、21%にFiO2 を戻す。</li>
	<li>子犬はチャンバーで回復し、2時間ポスト低酸素症のEEG上で監視しています。</li>
	<li>記録期間終了後、マウスをEEG記録から切り離し、母親に戻します。</li>
</ol>6. EEG分析
<ol><li>ラボチャートプロのビデオでEEGファイルを分析します。目の不自由な研究者に発作と背景パターンのEEGをマークしてもらいます17。発作は、高周波のリズミカルな鋭波放電(≥3xベースライン)を持つ10秒以上続く電写イベントと定義され、明確な進化17を有する。</li>
	<li>2番目の盲目の研究者レビューは、合意のためにランダムにマークされたイベントを持っています。</li>
	<li>マークされた各電気イベントの関連ビデオをレビューし、新生児げっ歯類行動発作スコア16に従って分析する。簡単に言えば、このスコアは0-6(不動から重度の強壮性クロニック挙動)の範囲です。発作セミオロジーをさらに特徴付けるには、横性(多焦点/二国間運動対焦点/一方的な混合)の行動を分析する。</li>
	<li>パワースペクトログラムを作成します。1024 データ ポイントのサイズを持つコサイン ベル データ ウィンドウを使用して高速フーリエ変換を使用します。87.5%のウィンドウオーバーラップの助けを借りてスペクトログラムに滑らかなX軸を作成します。電源をμV218として表現します。</li>
</ol>

<ol><li>Vasudevan, C., Levene, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+aetiology+of+neonatal+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Fetal+%26+Neonatal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and aetiology of neonatal seizures.</a> Seminars in Fetal & Neonatal Medicine. , (2013).</li>
<li>Volpe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Volpe%27s+Neurology+of+the+Newborn%22%5BJournal%5D)">Neonatal Seizures.</a> Volpe's Neurology of the Newborn. , Elsevier. 275-321 (2018).</li>
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<li>Wu, D., Martin, L. J., Northington, F. J., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillating+gradient+diffusion+MRI+reveals+unique+microstructural+information+in+normal+and+hypoxia-ischemia+injured+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oscillating gradient diffusion MRI reveals unique microstructural information in normal and hypoxia-ischemia injured mouse brains.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 72 (5), 1366-1374 (2014).</li>
</ol>

我々は、低酸素虚血発作の間に新生児マウスにおける連続的なビデオ-脳細胞モニタリングのためのモデルを提示した。EEGと連動したビデオ分析により、発作セミロジーの特徴付けが可能になります。EEGの分析は、パワースペクトログラムの抽出とバックグラウンド振幅分析を可能にします。
電極の配置中または不正確な配置時の損傷は結果に大きな影響を与える可能性がありますので、電極の正しく、慎重な配置は、このプロトコルで重要です。損傷前の正常なベースライン脳G活性の評価は、電極配置中の出血または傷害として最も重要であるが、まれに起こり得る。第二に、正しい電極配置を確認するために、脳を適切な配置で電極トラックについて切り離し、検査することができる。さらに、グループ(個別)で母親に子犬を返さないと、電極ヘッドセットが損傷したり、母親によって子犬が殺されたり無視されたりする可能性があります。
この方法の1つの制限は、小さな新生児脳における深度電極記録の空間的局在化の限界である。これは、EEGの記録に特定の発作病巣を局的にする能力を制限します。低酸素虚血の...

低酸素性虚血性脳症(HIE)は、新生児1000人に1.5人の新生児に影響を及ぼし、新生児発作の最も一般的な原因である1,2である。生き残った乳児は、脳性麻痺、知的障害、てんかん3,4,5などの様々な神経障害の危険にさらされています。
動物モデルは、低酸素虚血および新生児発作の病態生理を理解し、調査する上で重要な役割を果たす6,7。修飾されたヴァンヌッチモデルは、出生後10日目(p10)7,8に低酸素虚血(HI)を誘導するために使用される。この年齢のマウスの子犬は、人間の新生児の完全な用語に神経学的に大まかに変換します 9.
この傷害モデルと組み合わせて使用される連続ビデオ脳波(EEG)モニタリングは、新生児低酸素虚血性発作のさらなる理解と特徴付けを可能にする。これまでの研究では、ビデオ録画、限られたEEG記録、テレメトリEEG記録10、11、12、13、14、15、16など、げっ歯類の新生児発作を分析するための様々な方法を使用してきました。以下の原稿では、低酸素虚血中のマウスの子犬に連続したビデオEEGを記録する過程について詳しく述べる。新生児マウスの子犬における連続的なビデオEEGモニタリングのためのこの技術は、様々な疾患および発作モデルに適用することができる。

<table><tbody><tr><td><ストロング>サージェリー</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ボールポイントアプリケーター</td><td>Metrex Research</td><td>8300-F</td><td>i-bond アプリケーター</td></tr><tr><td>クラニオププラスト(粉末/樹脂)</td><td>Coltene</td><td>H00383</td><td>Perm Reline/Power</td></tr><tr><td>I-Bond</td><td>Kulzer GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LOOK Silk Suture</td><td>Surgical Specialities Corporation</td><td>SP115</td><td>LOOK SP115 ブラック ブレイド シルク 非吸収性外科用縫合</td></tr>糸 <tr><td>RS-5168 Botvin 鉗子</td><td>Roboz 手術器具</td><td>RS5168</td><td>手術/結紮用鉗子</td></tr><tr><td>RS-5138 Graefe 鉗子</td><td>Roboz 手術</td>器具 <td>RS5138</td><td>手術/結紮用鉗子</td></tr><tr><td>I-Bond</td><td>Blast Lite 用 UVライト By First Media</td><td>BL778</td><td>I-bond</td></tr><tr><td>Vannas Microdisecting Scissor</td> <td>用 UV ライトRoboz 手術器具</td><td>RS5618</td><td>結紮用はさみ</td></tr><tr><td>Vet Bond</td><td>3M Vetbond</td><td>1469SB</td><td>Vet Glue</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HYPOXIA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypoxidial</td><td>Starr Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酸素センサー</td><td>Medical Products</td><td></td><td>MiniOxI- 低酸素リグ用酸素分析装置/センサー</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EEG RECORDING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メスレセプタクルコネクタ 0.079インチ</td><td>Mill-Max Manufacturing Corp</td><td>832-10-024-10-001000</td><td>Digikey</td></tr><tr><td>Grass Amplifier</td><td>Natus Neurology Incorporated</td><td></td><td>Grass Product</td></tr><tr><td>LabChart Pro</td><td>ADI Instruments</td><td></td><td>Softwareシステムを実行するには</td></tr><tr><td>オスソケットコネクタ 0.079インチ</td><td>Mill-Max Manufacturing Corp</td><td>833-43-024-20-001000</td><td>Digikey</td></tr><tr><td>Operational Amplifier</td><td>Texas Instruments, Dallas, TX, USA</td><td>TLC2274CD</td><td>TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to-Rail Operational Amplifier</td></tr><tr><td></td><td>Texas Instruments, Dallas, TX, USA</td><td>TLC2272ACDR</td><td>TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Railオペアンプ</td></tr><tr><td>ステンレス鋼線</td><td>AMシステム</td><td>791400</td><td>0.005 "裸/ 0.008 "コーティングされた100フィート</td></tr><tr><td>の超フレキシブルワイヤーMcMaster-Carr</td><td></td><td>9564T1</td><td>36 様々な色のガーゼワイヤー</td></tr></tbody></table>

新生児マウスにおける低酸素虚血期における連続映像脳波

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

低酸素虚血は新生児発作の最も一般的な原因である。動物モデルは、新生児発作や低酸素虚血の根底にあるメカニズムと生理学を理解するために重要です。本稿では、新生児マウスにおける連続的な脳波(脳波)モニタリングを行い、低酸素虚血中の脳波背景を解析する方法を説明する。ビデオとEEGを併用すると、発作のセミオロジーの記述と発作の確認が可能になります。この方法は、実験期間におけるパワースペクトログラムおよびEEG背景パターンの傾向を分析することも可能である。この低酸素虚血モデルでは、この方法は、損傷前のEEG記録が規範的ベースラインを得ることを可能にし、傷害および回復の間に。総モニタリング時間は、4時間以上母親から子犬を分離できないことによって制限されます。この原稿では低酸素虚血性発作のモデルを用いてきたが、新生児ビデオ脳Gモニタリングのこの方法は、げっ歯類の多様な疾患および発作モデルに適用することができる。

発作セミロジー
新生児低酸素-虚血曝露は、マウスの全身発作と焦点発作の両方をもたらす(図1A-C)。ビデオ脳波録画により、電解調査結果をビデオの動作と相関させます。これらの行動は、以前に公表された新生児げっ歯類行動発作スコア(BSS)16を用いて採点された。BSS に加えて、行動が焦点/一方的、二国間、または混合であるかに基づいてイベントを分類しました(図 1B)。
このモデルでは、マウスは一般的に3パターンの発作セミオロジーを示した:1)対側の四肢の延長を伴う結紮の側に繰り返し回る、2)身体屈曲と尾を結ぶ姿勢の喪失、または3)四肢の一方的または両側のパドリング(様々な重症度および長さ)で姿勢の喪失(様々な重症度および長さ)。観察されたイベントの大半は、焦点/一方的または混合行動を伴う(<strong clas...

本稿では、低酸素虚血を起こす新生児マウスにおける複数の深度電極を用いた連続的なビデオEEG記録の方法を説明する。

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...

低酸素性虚血性脳症は、新生児発作の最も一般的な原因です。この低酸素性虚血発作のマウスモデルと連続ビデオ脳波計(EEG)は、新生児発作の理解と特性評価をさらに進めるのに役立ちます。この技術は、新生児損傷モデルでの高品質のビデオ脳波記録の取得を容易にし、新生児の発作のメカニズム、転帰、および治療的検査の将来の研究に役立ちます。手順を実演するのはPravin Wagleyです。私の研究室のラボスペシャリストです。電極埋め込み手術用。麻酔をかけた出生後9日目のマウスで疼痛反射に対する反応の欠如を確認した後、マウスをノーズコーンのある定位固定装置ステージに置き、イヤーバーの裏側を使用して頭を安定させます。頭蓋骨の切開部を3つの交互のベタインスクラブと70%エタノールスクラブで滅菌し、切開部が見えるようにしながらマウスを覆うために穴あきドレープを使用します。頭皮を目の少し上から前方に開き、皮膚の約半センチメートルを引っ込めます。頭を脳定位固定装置ステージに再配置して、皮膚が外側に引っ張られて頭蓋骨が露出するようにし、綿棒を使用して過酸化水素を塗布します。メスの刃を使って、頭蓋骨を丁寧にきれいにこすり落とします。そして、約50マイクロリットルの接着剤を骨に塗ります。アプリケーターを使用して接着剤を頭蓋骨に広げ、接着剤を紫外線の下に40秒間置きます。接着剤が固まったら、露出したブレグマを基準にして座標を測定します。また、32ゲージの針を使用して、海馬のCA1領域に両側に、頭頂葉と小脳に両側に電極穴を作成します。頭蓋骨の表面から血液をきれいにし、固定アームを使用して、メスソケットコネクタに取り付けられた電極を脳に下げます。各電極を脳に埋め込み、電極を歯科用アクリルで所定の位置に固定します。ヘッドセットを頭蓋骨に追加の歯科用アクリルで接着します。ケトプロフェンのキログラムあたり5ミリグラムを各子犬に皮下注射します。すべての電極が同腹仔の少なくとも半分に固定されたら、子犬を母親に戻します。電極の移植から24時間後、各動物をEEG記録用の摂氏37度のカスタムメイドのプレキシガラスチャンバーに入れ、柔軟なカスタムメイドのオペアンプケーブルを使用して子犬をビデオEEGモニタリングシステムに接続します。マルチチャンネル差動増幅器を使用して、1000ヘルツの脳波データを1キロのゲインでデジタル化し、適切な解析ソフトウェアで脳波信号を確認します。次に、頸動脈訴訟手続きのために動物を切断する前に、損傷前のベースラインEEGを30分間記録します。ベースラインの脳波データを記録した後、示されているように、下顎骨と首の左側の鎖骨の間の皮膚をベタインとエタノールで滅菌します。そして、首の左側に約1センチの切開をします。子犬を解剖顕微鏡の下に置き、皮下組織と皮膚を慎重に引っ込めて頸動脈を露出させます。動脈の下に5センチメートルの滅菌シルク縫合糸を置きます。迷走神経を特定し、動脈から神経を繊細に分離して引っ込めます。縫合糸が動脈の下にのみくるように縫合糸を操作します。迷走神経を特定した後、神経を動脈から繊細に分離して引っ込め、マイクロ鉗子を使用して動脈の下に5センチメートルの滅菌シルク縫合糸を通します。動脈の周りに二重結線の縫合糸を結び、流れを閉塞し、余分な縫合糸を切断します。露出した動脈の上の皮下組織と皮膚を置き換え、Vetbondを使用して切開部をシールします。次に、動物を温暖マットレスの上に置かれた室温のチャンバー内の連続EEGモニタリングに戻し、チャンバーが開かないように子犬のコア温度のスポット赤外線温度チェックを行います。吸気酸素モニタリングの連続的な画分で子犬を1時間回復させた後、100%窒素の毎分60リットルと100%酸素の毎分0.415リットルでチャンバーを洗い流します。チャンバー内の酸素飽和度が12%に達すると、酸素流量は変わらず、窒素流量を毎分10リットルに減少させます。必要に応じて微調整を行い、吸気酸素の割合を8%に45分間維持します。45分間の低酸素曝露後、吸気酸素の割合を21%に戻し、子犬がEEGモニタリングでチャンバー内で2時間回復するのを待ちます。記録期間の終了時に、マウスをEEGシステムから切断し、子犬を母親に戻します。ビデオ脳波記録により、電子写真所見をビデオ上の行動と関連付けることができます。このモデルで観察されるイベントの大部分は、局所的な片側性または混合行動に関係しています。低酸素期間中、マウスのサブセットは通常、非強迫性発作活動を示し、その間、子犬は脳波で持続的な発作活動で動けなくなります。この解析では、ベースライン活性は、P 10マウスの子犬における前述の背景と同様であった。訴訟後、低酸素症の開始前に、マウスのサブセットがけいれん発作を示しました。低酸素誘導後、EEGのバックグラウンド振幅は減少しました。また、スパイク波放電の断続的なバーストが示され、続いて抑制が見られました。マウスは、抑制された背景からリズミカルなスパイク波の放電として現れる電子写真発作を示し、それがポリススパイク波でより複雑で頻繁に進行しました。低酸素症では、パワースペクトログラム分析では、虚血性半球と対側半球の間の非対称性が注目に値します。虚血性半球はバースト抑制パターンを示し、反対側の半球は抑制された背景を示します。再酸素化と回復の間、マウスのサブセットは、記録期間の残りの期間にわたって発作を起こし続けます。EEGバックグラウンドは、低酸素症後のベースラインと比較して抑制され、低酸素症後の記録期間中に徐々に回復が観察されます。新生児の子犬を扱うときは、精度が重要です。さらに、外科的処置の後、子犬を母親と一緒にグループに戻すために特別な注意を払う必要があります。ビデオ脳波計は、新生児の子犬に組織病理学、画像診断、行動と組み合わせて使用 し、新生児の発作が負傷手術や行動結果に与える影響を調べることができます。

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出典:Ouyang, Y., et al. マウス脳低酸素虚血中のPET/MRI同時イメージング。J. Vis. Exp.

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