新生児マウスにおける低酸素虚血期における連続映像脳波

低酸素性虚血性脳症は、新生児発作の最も一般的な原因です。この低酸素性虚血発作のマウスモデルと連続ビデオ脳波計(EEG)は、新生児発作の理解と特性評価をさらに進めるのに役立ちます。この技術は、新生児損傷モデルでの高品質のビデオ脳波記録の取得を容易にし、新生児の発作のメカニズム、転帰、および治療的検査の将来の研究に役立ちます。

手順を実演するのはPravin Wagleyです。私の研究室のラボスペシャリストです。電極埋め込み手術用。

麻酔をかけた出生後9日目のマウスで疼痛反射に対する反応の欠如を確認した後、マウスをノーズコーンのある定位固定装置ステージに置き、イヤーバーの裏側を使用して頭を安定させます。頭蓋骨の切開部を3つの交互のベタインスクラブと70%エタノールスクラブで滅菌し、切開部が見えるようにしながらマウスを覆うために穴あきドレープを使用します。頭皮を目の少し上から前方に開き、皮膚の約半センチメートルを引っ込めます。

頭を脳定位固定装置ステージに再配置して、皮膚が外側に引っ張られて頭蓋骨が露出するようにし、綿棒を使用して過酸化水素を塗布します。メスの刃を使って、頭蓋骨を丁寧にきれいにこすり落とします。そして、約50マイクロリットルの接着剤を骨に塗ります。

アプリケーターを使用して接着剤を頭蓋骨に広げ、接着剤を紫外線の下に40秒間置きます。接着剤が固まったら、露出したブレグマを基準にして座標を測定します。また、32ゲージの針を使用して、海馬のCA1領域に両側に、頭頂葉と小脳に両側に電極穴を作成します。

頭蓋骨の表面から血液をきれいにし、固定アームを使用して、メスソケットコネクタに取り付けられた電極を脳に下げます。各電極を脳に埋め込み、電極を歯科用アクリルで所定の位置に固定します。ヘッドセットを頭蓋骨に追加の歯科用アクリルで接着します。

ケトプロフェンのキログラムあたり5ミリグラムを各子犬に皮下注射します。すべての電極が同腹仔の少なくとも半分に固定されたら、子犬を母親に戻します。電極の移植から24時間後、各動物をEEG記録用の摂氏37度のカスタムメイドのプレキシガラスチャンバーに入れ、柔軟なカスタムメイドのオペアンプケーブルを使用して子犬をビデオEEGモニタリングシステムに接続します。

マルチチャンネル差動増幅器を使用して、1000ヘルツの脳波データを1キロのゲインでデジタル化し、適切な解析ソフトウェアで脳波信号を確認します。次に、頸動脈訴訟手続きのために動物を切断する前に、損傷前のベースラインEEGを30分間記録します。ベースラインの脳波データを記録した後、示されているように、下顎骨と首の左側の鎖骨の間の皮膚をベタインとエタノールで滅菌します。

そして、首の左側に約1センチの切開をします。子犬を解剖顕微鏡の下に置き、皮下組織と皮膚を慎重に引っ込めて頸動脈を露出させます。動脈の下に5センチメートルの滅菌シルク縫合糸を置きます。

迷走神経を特定し、動脈から神経を繊細に分離して引っ込めます。縫合糸が動脈の下にのみくるように縫合糸を操作します。迷走神経を特定した後、神経を動脈から繊細に分離して引っ込め、マイクロ鉗子を使用して動脈の下に5センチメートルの滅菌シルク縫合糸を通します。

動脈の周りに二重結線の縫合糸を結び、流れを閉塞し、余分な縫合糸を切断します。露出した動脈の上の皮下組織と皮膚を置き換え、Vetbondを使用して切開部をシールします。次に、動物を温暖マットレスの上に置かれた室温のチャンバー内の連続EEGモニタリングに戻し、チャンバーが開かないように子犬のコア温度のスポット赤外線温度チェックを行います。

吸気酸素モニタリングの連続的な画分で子犬を1時間回復させた後、100%窒素の毎分60リットルと100%酸素の毎分0.415リットルでチャンバーを洗い流します。チャンバー内の酸素飽和度が12%に達すると、酸素流量は変わらず、窒素流量を毎分10リットルに減少させます。必要に応じて微調整を行い、吸気酸素の割合を8%に45分間維持します。

45分間の低酸素曝露後、吸気酸素の割合を21%に戻し、子犬がEEGモニタリングでチャンバー内で2時間回復するのを待ちます。記録期間の終了時に、マウスをEEGシステムから切断し、子犬を母親に戻します。ビデオ脳波記録により、電子写真所見をビデオ上の行動と関連付けることができます。

このモデルで観察されるイベントの大部分は、局所的な片側性または混合行動に関係しています。低酸素期間中、マウスのサブセットは通常、非強迫性発作活動を示し、その間、子犬は脳波で持続的な発作活動で動けなくなります。この解析では、ベースライン活性は、P 10マウスの子犬における前述の背景と同様であった。

訴訟後、低酸素症の開始前に、マウスのサブセットがけいれん発作を示しました。低酸素誘導後、EEGのバックグラウンド振幅は減少しました。また、スパイク波放電の断続的なバーストが示され、続いて抑制が見られました。

マウスは、抑制された背景からリズミカルなスパイク波の放電として現れる電子写真発作を示し、それがポリススパイク波でより複雑で頻繁に進行しました。低酸素症では、パワースペクトログラム分析では、虚血性半球と対側半球の間の非対称性が注目に値します。虚血性半球はバースト抑制パターンを示し、反対側の半球は抑制された背景を示します。

再酸素化と回復の間、マウスのサブセットは、記録期間の残りの期間にわたって発作を起こし続けます。EEGバックグラウンドは、低酸素症後のベースラインと比較して抑制され、低酸素症後の記録期間中に徐々に回復が観察されます。新生児の子犬を扱うときは、精度が重要です。

さらに、外科的処置の後、子犬を母親と一緒にグループに戻すために特別な注意を払う必要があります。ビデオ脳波計は、新生児の子犬に組織病理学、画像診断、行動と組み合わせて使用 し、新生児の発作が負傷手術や行動結果に与える影響を調べることができます。