Name: 単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学ぶマウス眼の単細胞懸濁液調製と多パラメータフローサイトメトリーによる単核食細胞解析法。マクロファージ、ミクログリア、樹状細胞の同定に適用でき、網膜疾患モデルでの免疫細胞動態研究に有用です。

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JALはNIH助成金K08EY030923によってサポートされました。CMCは、NIH国立関節炎・筋骨格疾患研究所のK01助成金(5K01AR060169)と、ルプス研究同盟の新しい研究助成金(637405)によって支援されました。

すべての手続きは、ノースウェスタン大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。C57BL/6マウスは、ノースウェスタン大学比較医学センター(イリノイ州シカゴ)のバリア施設に収容された。すべての動物は、食料と水への無料アクセスで12/12時間の明暗サイクルに収容されました。
1. 眼組織の採取
<ol><li>マウスが反応せず、もはや吸入しなくなるまで、二酸化炭素の調節された投与を使用して、いずれかの性別の10-12週齢のC57BL/ 6Jマウスを犠牲にする。頸部脱臼または他の承認された二次的方法を行い、安楽死を確実にする。 注:経心筋灌流は、眼組織にない循環性白血球を除去するために行うことができる。この実験では、全身灌流は、ミクログリア、単球、マクロファージ、またはレーザー処理された全眼で検出された樹状細胞の数を減らさない。したがって、これらの細胞タイプの大部分は眼組織に位置しており、このステップは任意である。</li>
	<li>目を引き起動させるには、ソケットの外に出ると、湾曲した鉗子を目の下にそっと置きながら、目のソケットの近くを押し下げます。実際の目を絞らずに目の下に閉じたピンチ鉗子。周囲の結膜から眼を取り除く(事前の出版物を参照してください)23.</li>
	<li>視神経が目を切り離す唯一の残りの接続になるまで、横に目を引きます。視神経はしばしば緊張で切断するが、視神経を切るために小さいはさみが必要な場合もある。1.7 mLマイクロ遠心分離チューブにカルシウムとマグネシウムを入れたコールド1xハンクの緩衝生理液(HBSS)に目を入れます。</li>
</ol>2. 眼組織の消化
<ol><li>0.1 mg/mL消化酵素と0.2 mg/mL DNaseを含む消化バッファーを冷たいHBSSで調製します。最初は滅菌水の2 mLで5mgの消化酵素を再構成する。HBSSで10mg/mL DNaseの初期希釈を準備します。消化バッファーの10 mL(3匹分の十分)ごとに、9.4mLの冷たいHBSSを0.4 mLの再構成消化酵素と希釈DNase Iを混ぜます。 注:これらの濃度は、細胞死を減らしながら、単一細胞の抗体染色の最適なレベルを提供するために、複数の実験で経験的に決定されました。コラゲナーゼDは、細胞生存率を低下させ、CD45+細胞を減少させた消化酵素の代替として試みた。消化を最適化するための反復プロセスの詳細については、議論を参照してください。</li>
	<li>全拡大率10倍の解剖顕微鏡の下で、冷たいHBSSで微細な鉗子とスプリングハサミを使用して残りの結膜と視神経を取り除きます。</li>
	<li>きれいな目を乾燥した解剖皿または小さな重量を量るボートに移しなさい。視覚軸を通して目に2つの穿ファリング創傷が作られ、消化バッファー出口のためのこの最初の創傷から90°離れた後、30 G針を取り付けた注射器を介して0.15-0.20 mL/目の消化バッファーを眼窩腔に注入します。</li>
	<li>0.5 mm x 0.5 mm 未満のすべての部分を持つスプリングハサミと細かい鉗子を使用して目全体をミンチ。後のステップでピペットの先端を詰まらせないように鉗子を介して鈍い機械的破壊とレンズティッシュを解体する。各サンプルに対して、0.75 mLの消化バッファーを小皿に洗い換えます。サンプルごとに新しい料理を使用します。</li>
	<li>ピペット移動で材料を失わないように注意してP1000ピペットを使用して氷上の解離チューブに皿の内容物を移します。さらに1.5 mLの消化バッファーで皿をリンスし、解離管の総容積を3.25〜3.50 mLにします。</li>
	<li>解離管を電子解離器に反転させ、サイクル「m_brain_03_01」を実行し、200rpmで1minの単方向回転を室温で構成し、プリロードプログラムです。すべての組織が消化バッファーとこれおよびすべての残りのステップのためのローターと接触している解離管の底にあることを確認してください。</li>
	<li>37°Cで200rpmで30分間揺れるインキュベーターに解離管を置きます。</li>
	<li>ステップ 2.6 と 2.7 を 1 回繰り返します。2回目の30分インキュベーションに続いて、ステップ2.6のように電子解離器を使用して1つの最終的な機械的消化を行う。</li>
	<li>10 mLのコールドフローバッファーを加えて反応を停止し、チューブを氷の上に置きます。</li>
</ol>3. 細胞懸濁液の調製
<ol><li>単一細胞懸濁液を作成するには、50 mL円錐形遠心分離管の上部に配置された40 μmフィルターを介して停止した眼の消化反応を注ぎます。2.5 mLの注射器からプランジャーを使用して、残りの未消化眼組織をフィルターに押し込みます。</li>
	<li>同じプランジャーを使用して再び未消化の眼組織片をフィルターに通す前に、フローバッファーとリンスフィルターの10 mLで解離チューブを洗浄します。</li>
	<li>5 mL のフローバッファを使用して、ステップ 3.2 を繰り返します。</li>
	<li>解離管を洗浄し、フローバッファーの最後の 10 mL でフィルターします。 注:消化およびフローバッファの総量は、各サンプルで約38〜40 mLです。</li>
	<li>円錐管を4°Cで10分間 400xg で遠心する。細胞ペレットを乱さずに上清をデカントする。</li>
	<li>滅菌水に10倍溶解溶液を加えて1x溶解液を調製します。別のチューブにチューブをフリックしてペレットを分割します。赤血球を溶解するには、室温(RT)で渦巻く30 sの1x溶解溶液の1mLを加える。</li>
	<li>20 mLのフローバッファで反応を停止します。</li>
	<li>円錐管を4°Cで10分間 400xg で遠心する。細胞ペレットを乱さずに上清をデカントする。</li>
	<li>別のチューブにチューブをフリックしてペレットを解化します。チューブあたり5 mLのコールド1x HBSSを追加します。</li>
	<li>遠心管 400xg で4°Cで10分間。吸気上清。</li>
</ol>4. 単核食細胞の細胞懸濁液の染色
<ol><li>冷たいHBSSでライブ/デッド染料1:500を希釈することにより、サンプルごとに0.5 mLのライブ/デッド染色を準備してください。</li>
	<li>P1000ピペットを使用して各サンプルにライブ/デッド染色を加え、ペレットを完全に解約してください。サンプルを1.2 mLマイクロ価器チューブに移します。</li>
	<li>小さなアリコート(10 μL)を取り、ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンター(4.4参照)を使用して細胞を数えます。暗闇の中で室温で15分間、ライブ/デッド染色でサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>Trypan ブルーを使用してセル数をカウントし、サンプルあたりのライブ セル数を決定します。 注:通常、10-12週齢のC57BL/6Jマウスの2つの目は、2 x 106個 の生細胞未満を含んでいます。</li>
	<li>400 μL のコールド フロー バッファを加えてサンプルを洗浄します。400 x g のマイクロ力器管ラック内の遠心管を4°Cで10分間用いた。細胞ペレットを乱さずに上清を吸引する。</li>
	<li>500 μL のコールド フロー バッファで細胞を完全に再懸濁します。400 x g のマイクロ力器管ラック内の遠心管を4°Cで10分間用いた。細胞ペレットを乱さずに上清を吸引する。</li>
	<li>Fcブロックの50 μL(精製ラット抗マウスCD16/CD32のコールドフローバッファーでの1:50希釈)で最大5 x 106の生細胞をブロックします。5 x 106個以上の細胞の場合は、ボリュームを適宜増やしてください。</li>
	<li>サンプルを完全に解体するようにペレットにFc ブロックを加えます。4°Cで20分間インキュベートします。</li>
	<li>50 μLの抗体染色溶液(溶液に含まれる各抗体の選択量については表1を参照)を、生細胞あたり5 x 106の細胞を直接Fcブロック内の細胞に加え、完全に混合します。4°Cで30分間インキュベートします。 注:抗体量はフローサイトメーターの構成に依存し、各ラボと機器に対して個別に滴定する必要があります。フィルターとミラーのインストゥルメント構成については、 表 2 を参照してください。抗体を評価するには、メーカーの推奨から始め、染色指数を計算します。様々な抗体濃度(メーカーの推奨値の上下)の試験実行を行い、染色指数が維持される抗体の最低濃度を選択します。また、単色コントロールよりも明るい正の染色を確認してください。負の染色されたセルがスケールで、1 x 102未満のピークを持つことを確認するために、染色されていないセルを使用します。正に染色された細胞を定義するには、蛍光から 1 つのコントロールを引いたものを使用します。</li>
	<li>700 μL のコールド フロー バッファを加えてサンプルを洗浄します。400 x g のマイクロ力器管ラック内の遠心管を4°Cで10分間用いた。細胞ペレットを乱さずに上清を吸引する。</li>
	<li>場合によっては、抗体染色後、フローバッファー内のパラホルムアルデヒドを500 μLの2%で固定できます。室温で15分間サンプルを固定します。次に、4.10に記載のとおり1回の洗浄を行う。4 °Cで固定サンプルを保管してください。カウントビードは、フローサイトメトリーデータ収集の日に追加する必要があります。固定サンプルは、1〜2日でフローサイトメーターで実行する必要があります。 注意:パラホルムアルデヒドは腐食性および健康上の危険である。</li>
	<li>500 μL のコールド フロー バッファを使用して、サンプルを再度洗浄します。400 x g のマイクロ力器管ラック内の遠心管を4°Cで10分間用いた。細胞ペレットを乱すことなく上清の半分を吸引する。</li>
	<li>ペレットを再懸濁し、96ウェルのUボトムアッセイプレートに移します。遠心板 400xg で5分4°Cで。上清をデカントするには、プレートをひっくり返し、1つの強いシェイクでペレットを乱すことなく、液体をシンク盆地に取り除きます。</li>
	<li>新しい1.2 mLマイクロ・トイターチューブに、50 μLのウェルボルテックス・カウントビーズを配置します。</li>
	<li>200 μL のコールド フロー バッファで 96 ウェル プレートにペレットを再懸濁します。前のステップからビーズの上に細胞混合物を追加します。250 μL/マイクロ力さチューブの総容積でフローサイトメーターで実行します。</li>
</ol>5. フローサイトメトリーデータの収集
<ol><li>オンにして、フローサイトメーターを準備します。ここに記載されている指示は、修正された4つのレーザーサイトメーターのためのものです(表2)。</li>
	<li>各サンプルの小さなアリコートを含むテストサンプルを実行し、各検出器のすべてのセルがスケールであることを確認します。すべてのセルがスケールになるように電圧を調整します。</li>
	<li>染色カクテルに使用されるフルオロフォアごとに単一のカラーコントロール(SCC)を実行する(表3)。マイクロ力価チューブを大きな5 mLポリスチレンチューブに入れ、フローサイトメーターステージに配置します。 注:BV421(パシフィックブルー)、FITC、PE、Alexa647(APC)、Alexa700などの根管内フルオロフォアは、カクテルと同じ抗体を必要としません(CD64 PEのCD19 PE)。しかし、PE-CF594、PE-Cy7、またはAPC-Cy7のようなタンデムフルオロフォアは、コンジュゲートフルオロフォアの解離の可能性があるため、カクテルと同じSCC抗体を必要とします。<ol>
<li>1.2 mLのタイターチューブに2滴の補償ビーズを加え、ハムスターアンチマウスCD11c BV421を1μLと一緒に追加して、BV421用のSCCを作成します。補正ビーズは、CD11c BV421が5.3.3で説明したようにカッパではなくIgGラムダサブタイプであるため使用されます。4°Cで15分間インキュベートします。0.2 mL のフロー バッファを追加します。</li>
		<li>アミン反応性ビーズから正の染色ビーズ(グリーンキャップ)を1滴加え、その後1 μLのライブ/デッド染料を追加して、ライブ/デッド染料用のSCCを作成します。暗闇の中で室温で15分間インキュベートします。アミン反応性ビーズからマイナスビーズ(白キャップ)を1滴追加します。0.2 mL のフロー バッファを追加します。</li>
		<li>抗ラットおよび抗ハムスターIgカッパビーズセットから正の染色ビーズ(緑色のキャップ)を1滴加え、続いて1.2 mLの塊茎チューブに記載されている抗体量(表3)を加えて、残りのSCCを作成します。4°Cで15分間インキュベートします。アンチラットとアンチハムスターIgカッパビーズセットからマイナスビーズ(白キャップ)の1滴を追加します。0.2 mL のフロー バッファを追加します。</li>
		<li>渦は完全にすべてのビーズ混合物。SCCは4°Cで3日間保存します。 注:蛍光レポーターマウスのSCCは、染色されていない細胞です。</li>
		<li>SCCを実行する場合、SCCサンプルが同じ検出器チャネル内の細胞のサンプルに対してどの蛍光よりも大きいピークを有するような電圧を設定する。さらに、任意のSCCが、対象チャネルのヒストグラムピークと他のチャンネルとの間に少なくとも0.5のログ差を持たるように電圧を設定する必要があります(図1)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>「低」でサンプルを実行し、イベント/秒を4000以下に抑えます。流量を適切に下げることができない場合は、追加のコールドフローバッファでサンプルを希釈します。カウント計算に必要となるように、追加されたボリュームを記録します (代表結果を参照)。</li>
	<li>サンプルごとに少なくとも 3 x 106 のイベントを収集します。これは、あなたのサイトメーター上のイベントとしてカウントされる顔料顆粒や破片のために細胞数よりも高い可能性があります。</li>
	<li>セクション6.4の適切な格言戦略のために、ライブ/デッド以外の蛍光性マイナス1(FMO)を記録します。FMOは、1つを除くすべてのフルオロフォアで染色されたサンプルです。</li>
	<li>製造元または施設の指示に従ってフローサイトメーターを清掃し、シャットダウンします。</li>
</ol>6. フローサイトメトリーデータのアノテーション
<ol><li>分析ソフトウェアを使用して新しいワークシートを開きます。すべてのサンプルと単色コントロールのサイトメーターからFCSファイルをインポートします。</li>
	<li>SCC を使用して、報酬マトリックスを作成します。</li>
	<li>補正マトリックスを染色したサンプルと MMO に適用します。</li>
	<li>FMOを使用して、ゲートを描画するための正の染色を決定します。</li>
</ol>

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著者らは開示するものは何もない。

マルチパラメータフローサイトメトリーは、複雑な組織における複数の細胞タイプの定量分析を可能にします。本報告では、マウス眼でのレーザー損傷後の単球、樹状細胞、マクロファージサブセットを含む単核食細胞集団のフローサイトメトリック検出について述べた。Liyanageらは最近、好中球、好酸球、リンパ球、DC、マクロファージ、マクロファージ、および単球27を検出するための同様の格子戦略を報告した。当社の格言戦略は、主にCD64の追加によって異なります。Liyanageらは、DCをCD4-CD8-B220-CD11b + CD11c+細胞、マクロファージをCD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1 -Ly6G-細胞として識別する。 我々は、DCをCD4-CD8-B220-...

自然免疫系には、補体の活性化および炎症を刺激する複数の細胞タイプが含まれる。自然免疫細胞には、ナチュラルキラー(NK)細胞、肥満細胞、好塩基球、好酸球、好中球、および単核食細胞が含まれる。単球、マクロファージ、樹状細胞からなる単核食細胞は、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症(AMD)1を含む複数の眼科病態の病態生理に関与している。このプロトコルでは、新血管AMD2のマウスモデルにおける多パラメータフローサイトメトリック解析を用いた単核食細胞の同定に焦点を当てる。このプロトコルは、糖尿病性網膜症および/またはuveitisのマウスモデルに適応可能であるが、これらの疾患の全身的な性質のために、より広範な眼解剖が推奨される。
単核食細胞は、重なり合う細胞表面マーカーを発現する。長期にわたる組織居住マクロファージおよびミクログリアは、黄身嚢由来のエリスロメロイド前駆体3に由来し、一方、マクロファージおよび樹状細胞を骨髄由来のマクロファージ樹状細胞前駆細胞4から分化した。単球に共通するマウス細胞表面マーカーは、マクロファージ、および樹状細胞、CD45、CD11b5、F4/806、Cx3cr17、および細胞内マーカーIba1 8を含む。この課題を克服するために、複数の組織からマクロファージ、単球、および樹状細胞のトランスクリプトーム解析は、CD64をマクロファージ特異的細胞表面マーカー6と定義する。マクロファージは、虹彩、脈絡膜、毛様体、及び健康眼における視神経3に記載されている。あるいは、樹状細胞の識別がより困難である。樹状細胞同定の最も具体的な方法は、Zbtb46-GFPレポーターマウス9を使用して運命マッピングを必要とします。このレポーターラインとは無関係に、CD64の存在と併せてCD11cおよびMHCIIの発現は、潜在的な樹状細胞6,10を同定することができる。樹状細胞は正常眼11において角膜、結膜、虹彩、および脈絡膜で同定されている。ミクログリアは、そのレチナに位置する特殊なマクロファージであり、血液-腎障害によって保護され、黄身嚢前駆細胞12に由来する。その結果、レチナルミクログリアは、CD45発現13のそれらの薄暗いレベルと高レベルのTmem119によって単球由来マクロファージと区別することができ、これはフローサイトメトリー抗体14として利用可能である。しかし、ミクログリアの活性化時には、CD45はアップレギュレーション15、Tmem119はダウンレギュレート3となり、ミクログリア生物学の複雑さを示し、AMDとそのマウスモデルの両方に関連する可能性があります。最後に、単球は、古典と非古典的を含む少なくとも2つのサブタイプに分けることができます。古典的な単球ディスプレイCCR2+Ly6C高CX3CR1低発現、および非古典的単球はCCR2-Ly6C低CX3CR1ハイマーカー5を実証する。
マーカー発現の定量的分析、すなわち、高いレベルと低/薄暗いレベルの必要性により、多パラメータフローサイトメトリーは、眼および他の組織における単球、マクロファージ、ミクログリア、樹状細胞間の識別に理想的な方法である。その他の利点としては、サブ集団の同定、蛍光活性化細胞分類(FACS)を使用して、転写またはプロテオミクス解析のために細胞集団を分類する能力、および運命マッピングが含まれる。マルチパラメータフローサイトメトリーの主な欠点は、組織アーキテクチャの欠如です。これは、角膜、結膜、虹彩、レンズ、失膜、および脈絡膜-スクレラ複合体:様々な眼部区画への眼圧解剖によって克服することができる。さらに、確認免疫蛍光イメージングを行うことができますが、マーカーの数と堅牢な定量の欠如によって制限されます。
ゲノムワイド関連研究は、複数の補体遺伝子をAMD16と結合している。補体活性化はアナフィラトキシン産生、白血球のリクルート、および結果として生じる炎症をもたらす。補体受容体欠損マウスにおいて、レーザー傷害は、単核食細胞の動員およびレーザー誘導脈絡膜新血管化(CNV)領域17を減少させる。同様に、C-Cモチーフケモカイン受容体2(CCR2)ノックアウトマウスは、組織への単球募集に欠損しており、単核食細胞のリクルートとレーザー誘導CNV領域18の両方を示す。これらのデータは、実験的CNVおよびおそらく新血管AMDを有する単核食細胞を補完する。この関連を支持して、補体受容体は、新血管AMD19,20の患者において末梢血単球に対して調節不全である。これらのデータは、AMDと単核食細胞との間の強い関連を示す。
本稿では、実験レーザー誘導CNVモデルを用いて、マルチパラメータフローサイトメトリーを用いてマウスアイ中の単核食細胞集団を特徴付ける。レーザー誘導CNVは、新血管AMDの標準的なマウスモデルであり、現在の第1線新幹線AMD療法21の有効性を実証した。このプロトコルは、マウスの目の核形成、眼解剖、単一細胞懸濁液への消化、抗体染色、単色制御を用いたレーザー電圧の決定、および蛍光マイナス1(FMO)制御を用いた測定戦略について説明する。レーザー誘発CNVモデルの詳細な説明については、前の出版物22を参照してください。このプロトコルを用いて、ミクログリア、単球、樹状細胞、マクロファージ集団を定義する。さらに、MHCIIとCD11cを用いて、レーザー誘導CNVモデル内のマクロファージサブセットをさらに定義します。

<table><tbody><tr><td>0.6 ml 微量遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml 微量遠心チューブ</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>10 ml ピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>431031</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 円錐</td>形 <td>ThermoFisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>2.5 ml syringe</td><td>HenkeSass Wolf</td><td>7886-1</td><td></td></tr><tr><td>20% パラホルムアルデヒド溶液</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>25 ml ピペット</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>431032</td><td></td></tr><tr><td>30 G ニードル</td><td>エクセル</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>3ml ルアー ロック シリンジ</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>14955457</td><td></td></tr><tr><td>41 x 41 x 8 mm ポリスチレン 計量皿</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>50 ml円錐</td>形 <td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル、U底アッセイプレート、蓋なし</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>アミン反応性ビーズ</td><td>ThermoFisher</td><td>A10628</td><td></td></tr><tr><td>分析ソフトウェア</td><td>FlowJo</td><td>v 10</td><td></td></tr><tr><td>抗ラットおよび抗ハムスター Ig κビーズセット</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J マウス</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Invitrogen AMQAX1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell counter slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Compensation beads</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>Count beads</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>湾曲鉗子</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-123</td><td></td></tr><tr><td>消化酵素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>National Optical and Scientific Instruments, Inc.</td><td>DC3-420T</td><td></td></tr><tr><td>解離チューブ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>電子解離器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva ソフトウェア</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fc ブロック、ラット抗マウス CD16/CD32</td><td>BD Biosciences 553142</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ファイン鉗子</td><td>インテグラ ミルテックス</td><td>17035X</td><td></td></tr><tr><td>フローバッファー</td><td>ミルテニー バイオテック</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>BD バイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フローチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>ハムスター アンチマウス CD11c BV421</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>562782</td><td></td></tr><tr><td>アイスバケツ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-210-123</td><td></td></tr><tr><td>生/死用色素</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>溶解液、10倍溶液</td><td>BD Biosciences 555899</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ力価チューブとラック</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-380</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗マウス CD64 PE</td><td>BioLegend</td><td>139304</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗マウス NK1.1 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562864</td><td></td></tr><tr><td>P1000ピペットチップ</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>P2404</td><td></td></tr><tr><td>P1000ピペッター</td><td>ギルソンFA10006M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2ピペットチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>22491806</td><td></td></tr><tr><td>P2ピペッター</td><td>ギルソン</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>P20ピペッター</td><td>ギルソン</td><td>FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>P200ピペットチップ</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>P200ピペッター</td><td>ギルソン</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>ピペットマン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス B220 PECF594</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>562313</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウスCD11b APC-Cy7</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウスCD19 AlexaFluor 700</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>557958</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウスCD19 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553786</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス CD4 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562314</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス CD45 FITC</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス CD45 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552848</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス CD8 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562315</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス Ly6C</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>561085</tr><tr><td>ラット抗マウス Ly6G PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562700</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス MHC II AlexaFluor 700</td><td>BioLegend</td><td>107622</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス Siglec F PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス Tim4 AlexaFluor647</td><td>BD Biosciences</td><td>564178</td><td></td></tr><tr><td>振盪インキュベーター</td><td>Labnet</td><td>311DS</td><td></td></tr><tr><td>スプリングハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>滅菌細胞ストレーナー、40 mm ナイロンメッシュ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>滅菌水、500 ml</td><td>Gibco</td><td>A12873-01</td><td></td></tr><tr><td>スイングバケット遠心分離機</td><td>eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー、0.4% 溶液</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

自然免疫系は、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症を含む眼部病態生理学において重要な役割を果たしている。自然免疫細胞、特に単核食細胞は、重なり合う細胞表面マーカーを発現し、これらの集団を同定することが課題となる。マルチパラメータフローサイトメトリーは、マウス目の単球、マクロファージ、ミクログリア、樹状細胞を区別するために、複数の細胞表面マーカーの同時定量分析を可能にします。このプロトコルは、マウスの目全体の核分裂、眼圧解剖、単一細胞懸濁液への消化、および骨髄細胞マーカーに対する単一細胞懸濁液の染色について説明する。また、単色制御を用いて電圧を決定する方法や、蛍光から1つの制御を使用して正のゲートを引いた正のゲートを引いたものを解法するための適切な方法を説明します。マルチパラメータフローサイトメトリーの主な制限は、組織アーキテクチャの欠如です。この制限は、個々の眼区画のマルチパラメータフローサイトメトリーまたは無料の免疫蛍光染色によって克服することができる。しかし、免疫蛍光は、定量分析の欠如とほとんどの顕微鏡の蛍光体の数の減少によって制限されます。レーザー誘導脈絡膜新血管化における単核食細胞の定量的分析を提供するマルチパラメトリックフローサイトメトリーの使用について述べた。さらに、マルチパラメータフローサイトメトリーは、マクロファージサブセットの同定、運命マッピング、およびトランスクリプトームまたはプロテオミクス研究のための細胞分類に使用することができる。

図1 は、赤レーザーのSCCとセルの無補償周波数ヒストグラムを示しました:Alexa647、Alexa700、およびAPC-Cy7。 図1Aでは、マゼンタ線はAlexa647のSCCのピークを表し、シアンラインは意図された0.5ログの違いを示しました。Alexa700とAPC-Cy7のピークはシアンラインの左(明るさが低い)であることに注意してください。また、セルはすべてマゼンタラインの左側にあったことに注意してください。SCCピークの右側にあるいずれの細胞も補償されなかった。特定のチャネルは、フッ素色素の化学(すなわち.e.e.)の化学に基づいて他のチャネルに流出することが知られていた。 バイオレットレーザー: BV421 -&gt; V500, 黄緑色レーザー: PE -&gt; PE-CF594, 赤レーザー: Alexa647 -&gt; Alexa700, Alexa700 -&gt; APC-Cy7, クロスレーザー: PE-Cy7 -&gt; APC-Cy7)。上記の条件のいずれかが満たされない場合、1つ...

このプロトコルは、単球、ミクログリア、マクロファージ、樹状細胞を含む特定の眼単核貪食集団を同定するために、多パラメータフローサイトメトリック分析を目的として、目全体を単一細胞懸濁液に消化する方法を提供する。

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

このプロトコールは、マクロファージ、単球、ミクログリア、樹状細胞を含む単核食細胞のマルチパラメータフローサイトメトリーのために、マウスの眼全体を単一細胞懸濁液に消化するように設計されています。この手法の主な利点は、フルオロフォア強度による定量分析を行い、細胞表面マーカー発現を用いて密接に関連する細胞タイプを区別できることです。当社のプロトコールは、レーザー誘起脈絡膜新生血管モデルにおける常在集団と浸潤集団の両方を含むマクロファージの不均一性の分析に最適化されています。ただし、これらの概念と手法は、糖尿病性網膜症、実験的自己免疫性ブドウ膜炎、狼瘡の症状などの他のモデルにも同様に適用できます。このプロトコルを試す際には、すべてのサイトメーターがまったく同じように設定されているわけではないため、サイトメーターの設定を理解することが重要な出発点となります。したがって、蛍光標識抗体の量を滴定したり、サイトメーターの構成に基づいてプロトコルを最適化するために蛍光色素を調整したりする必要がある場合があります。原稿の指示に従って消化バッファーを準備することから始めます。解剖顕微鏡と合計倍率の10倍を使用して、残りの結膜と視神経を目から取り除きます。清潔な目を乾いた解剖皿または小さな計量ボートに移し、視軸を介してそれらの間に90度の角度で2つの穿孔創を作ります。30ゲージの針が付いたシリンジを使用して、0.15〜0.2ミリリットルの消化バッファーを各眼の硝子体腔に注入します。.スプリングハサミと細い鉗子で目をミンチにし、その後のステップでピペットチップが詰まるのを防ぐために、鈍い機械的破壊でレンズ組織を解離します。鉗子とハサミを0.75ミリリットルの分解緩衝液ですすぎ、各サンプルの皿を交換します。P1000ピペットを使用して、材料を失わないように注意しながら、皿の内容物を氷上の解離チューブに移します。さらに1.5ミリリットルの消化緩衝液で皿をすすぎ、それを解離チューブに追加すると、総容量が3.25〜3.5ミリリットルになります。テキスト原稿に記載されているように、電子解離器で組織を解離し、すべての組織が逆解離チューブの底にあり、消化バッファーと接触していることを確認します。次に、解離チューブを摂氏37度、200RPMで30分間インキュベートします。組織の解離をさらに2回繰り返し、解離の間にサンプルを摂氏37度、200RPMで30分間インキュベートします。反応を停止するには、10ミリリットルのコールドフローバッファーを追加し、サンプルチューブを氷の上に置きます。単一細胞懸濁液を作製するには、50ミリリットルの円錐形遠心チューブの上部に配置された40マイクロメートルのフィルターを介して、停止した眼消化反応を濾過します。2.5ミリリットルのシリンジからプランジャーを使用して、未消化の眼組織の残りの部分をフィルターに押し込みます。解離チューブを10ミリリットルのフローバッファーで洗浄し、フィルターをすすぎます。次に、同じプランジャーを使用して、未消化の眼組織片を再度フィルターに通します。このプロセスを5ミリリットルのフローバッファーで繰り返します。次に、解離チューブを洗浄し、最後の10ミリリットルのフローバッファーでろ過します。コニカルチューブをGの400倍で摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞ペレットを乱さずに上清をデカントします。チューブを別のチューブに対してフリックして、ペレットを分割します。次に、1ミリリットルの溶解液を加え、チューブを室温で30秒間回転させて赤血球を溶解します。20ミリリットルのフローバッファーで反応を停止し、コニカルチューブの400倍Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。細胞ペレットを乱さずに上清をデカントします。チューブを別のチューブに対してフリックします。次に、5ミリリットルの冷たいHBSSを追加します。遠心分離を繰り返し、上清を取り除きます。P1000ピペットを使用して各サンプルに0.5ミリリットルの生死染色を加え、ペレットが完全に解離することを確認します。サンプルを1.2ミリリットルのマイクロタイターチューブに移し、暗所で15分間インキュベートします。その間、トリパンブルーと血球計算盤でサンプルの10マイクロリットルのアリコートを数えます。インキュベーション後、400マイクロリットルのコールドフローバッファーを追加して各サンプルを洗浄します。マイクロタイターチューブラック内のチューブをGの400倍で摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞ペレットを乱さずに上清を吸引します。細胞を500マイクロリットルのコールドフローバッファーに再懸濁します。その後、遠心分離を繰り返し、上清を取り除きます。50マイクロリットルのFCブロックで最大500万個の生細胞をブロックします。細胞ペレットを完全に解離し、摂氏4度で20分間インキュベートします。次に、各サンプルに50マイクロリットルの抗体染色溶液を加えます。完全に混合し、摂氏4度でさらに30分間インキュベートします。ここでは、1 つのマウスの 2 つの目から解析されたすべてのイベントの前方散乱領域と側面散乱領域のプロパティを示します。ビーズカウントは、APC-Cy7上にPEをプロットすることにより洗浄および確認され、PE陽性イベントとAPC-Cy7陰性イベントの密集クラスターが作成されました。次に、すべてのイベントから生細胞のシングレットを同定しました。一重項は、前方散乱高さと前方散乱面積で正の相関があり、ダブレット細胞と三重項細胞は前方散乱高さよりも前方散乱面積が大きかった。生細胞は前方散乱領域が陽性で、生死染色が陰性です。ここでは、生きた一重項細胞から単核食細胞を描写するための最初のゲーティング戦略を示します。生きたシングレットは、CD45対CD11bプロットを用いて可視化した。CD45 FMOにCD45陽性細胞が存在しないことから、ゲート選択が確認されました。次に、好中球、好酸球、B細胞、K細胞、およびT細胞を、系統ゲート付きCD45陽性の生シングレットとCD11bをプロットすることにより、除外しました。マクロファージサブセットも同定されました。ミクログリアは、CD64陽性MHC2低染色のCD45-dim細胞で描写されました。MHC2陰性マクロファージは、CD64陽性MHC2陰性として同定された。CD11c陰性およびCD11c陽性マクロファージは、CD64陽性CD11c陰性として示されました。MHC2陽性細胞におけるCD64陽性CD11c陽性。レーザー治療により、MHC2陰性、CD11c陰性、CD11c陽性のマクロファージの量が増加することがわかりました。樹状細胞数もレーザー治療によってアップレギュレーションされましたが、ミクログリアと単球の数は影響を受けませんでした。全身性灌流はマクロファージ数に影響を与えませんでした。この手順に続いて、解析のみではなく蛍光活性化セルソーティングにより、トランスクリプトームまたはプロテオミクス研究を通じて、マクロファージの不均一性およびそれが機能に及ぼす影響の特性評価が可能になります。

digestion-whole-mouse-eyes-for-multi-parameter-flow-cytometric

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、マウスの眼に硝子体内送達後の蛍光バイオ粒子のミクログリア取り込みを測定するためのフローサイトメトリーを示しています。フローサイトメトリーは、CD11bを発現する生細胞を検出し、緑色蛍光を示す食作用性ミクログリア細胞を、Ly6C発現単球やLy6G発現好中球などの他の骨髄系細胞と区別します。...

フローサイトメトリーを用いた硝子体内送達蛍光粒子のミクログリア取り込みの測定

小膠細胞は、それらの細胞外環境に材料を貪食又は巻き込むための高い能力を有する中枢神経系（CNS）の居住者の免疫細胞である。ここでは、シナプスのコンポーネントのミクログリア媒介貪食を可視化し、測定するために広く適用可能で信頼性が高く、高度に定量的なアッセイが記載されている。...

貪食アッセイ：CNS食細胞と神経細胞間の相互作用を評価するためのプロトコル

組織の恒常性と不十分な食細胞機能の維持が病態に関与しているためにミクログリアの貪食作用が重要です。しかしながら、 インビボでのミクログリアの機能を評価することは技術的に困難です。私たちは、正確に監視し、生理的な環境の中でミクログリアの貪食の可能性を定量化するためのシンプルでありながら堅牢な技術を開発しました。...

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

眼循環中の標識された血液細胞の生細胞イメージングは​​、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性における炎症および虚血に関する情報を提供し得る。血球を標識し、網膜循環中の標識細胞を画像化するプロトコルが記載されている。...

マウス網膜循環における血流動態を調べるための赤血球および白血球の蛍光色素標識

このプロトコールは、成体マウス中枢神経系におけるマクロファージ亜集団のフローサイトメトリーによる分析を提供し、これらの細胞によって発現される複数のマーカーの研究に有用である。...

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

何百万人もの人々が不可逆的な失明をもたらす網膜変性疾患に苦しんでいます。これらの疾患の多くの共通要素は、網膜神経節細胞（RGC）の喪失である。この詳細なプロトコールは、フローサイトメトリーによる陽性および陰性選択による原発性ネズミRGCの単離を記載する。...

フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離

リンパ球走化性と移行の定量的評価のためのプロトコルは、免疫学の研究のための重要なツールです。ここでは、リアルタイムで、多重セル移行の評価だけでなく、生体内で相補的な技術有効にする追跡ネイティブ細胞の脾臓に、体外のプロトコルを説明します。...

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

ここでイメージの単一食イベントに回転ディスク共焦点顕微鏡を用いたマウス腹腔マクロファージの方法について述べる。他の貪食細胞に、プロトコルを拡張できます。...

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

このプロトコルの目的は、説明されているマーカーを用いた肝臓内リンパ管の内皮細胞集団を識別するためにです。コラゲナーゼ IV と DNase...

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

このプロトコルは、2016年1年にフェルナンデス・ゴディーノらによって報告されたもので、トランスウェルプレート上で1週間以内に機能的で偏極したRPE単層を形成するマウスRPE細胞を効率的に単離および培養する方法を説明している。手続きには約3時間かかります。...

一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

蛍光トマトレクチンの眼窩後注射後、血小板由来成長因子受容体βによる免疫蛍光染色により、網膜血管系の周皮細胞を調べました。標識された網膜をさらに組織透明化法で処理し、共焦点顕微鏡下で網膜血管系を取り巻く周皮細胞の3次元ビューを視覚化するために全体をマウントしました。...

免疫染色によるマウス網膜血管周皮細胞の3D可視化 

学ぶマウス眼の単細胞懸濁液調製と多パラメータフローサイトメトリーによる単核食細胞解析法。マクロファージ、ミクログリア、樹状細胞の同定に適用でき、網膜疾患モデルでの免疫細胞動態研究に有用です。

単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

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