単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

このプロトコールは、マクロファージ、単球、ミクログリア、樹状細胞を含む単核食細胞のマルチパラメータフローサイトメトリーのために、マウスの眼全体を単一細胞懸濁液に消化するように設計されています。この手法の主な利点は、フルオロフォア強度による定量分析を行い、細胞表面マーカー発現を用いて密接に関連する細胞タイプを区別できることです。当社のプロトコールは、レーザー誘起脈絡膜新生血管モデルにおける常在集団と浸潤集団の両方を含むマクロファージの不均一性の分析に最適化されています。

ただし、これらの概念と手法は、糖尿病性網膜症、実験的自己免疫性ブドウ膜炎、狼瘡の症状などの他のモデルにも同様に適用できます。このプロトコルを試す際には、すべてのサイトメーターがまったく同じように設定されているわけではないため、サイトメーターの設定を理解することが重要な出発点となります。したがって、蛍光標識抗体の量を滴定したり、サイトメーターの構成に基づいてプロトコルを最適化するために蛍光色素を調整したりする必要がある場合があります。

原稿の指示に従って消化バッファーを準備することから始めます。解剖顕微鏡と合計倍率の10倍を使用して、残りの結膜と視神経を目から取り除きます。清潔な目を乾いた解剖皿または小さな計量ボートに移し、視軸を介してそれらの間に90度の角度で2つの穿孔創を作ります。

30ゲージの針が付いたシリンジを使用して、0.15〜0.2ミリリットルの消化バッファーを各眼の硝子体腔に注入します。.スプリングハサミと細い鉗子で目をミンチにし、その後のステップでピペットチップが詰まるのを防ぐために、鈍い機械的破壊でレンズ組織を解離します。鉗子とハサミを0.75ミリリットルの分解緩衝液ですすぎ、各サンプルの皿を交換します。

P1000ピペットを使用して、材料を失わないように注意しながら、皿の内容物を氷上の解離チューブに移します。さらに1.5ミリリットルの消化緩衝液で皿をすすぎ、それを解離チューブに追加すると、総容量が3.25〜3.5ミリリットルになります。テキスト原稿に記載されているように、電子解離器で組織を解離し、すべての組織が逆解離チューブの底にあり、消化バッファーと接触していることを確認します。

次に、解離チューブを摂氏37度、200RPMで30分間インキュベートします。組織の解離をさらに2回繰り返し、解離の間にサンプルを摂氏37度、200RPMで30分間インキュベートします。反応を停止するには、10ミリリットルのコールドフローバッファーを追加し、サンプルチューブを氷の上に置きます。

単一細胞懸濁液を作製するには、50ミリリットルの円錐形遠心チューブの上部に配置された40マイクロメートルのフィルターを介して、停止した眼消化反応を濾過します。2.5ミリリットルのシリンジからプランジャーを使用して、未消化の眼組織の残りの部分をフィルターに押し込みます。解離チューブを10ミリリットルのフローバッファーで洗浄し、フィルターをすすぎます。

次に、同じプランジャーを使用して、未消化の眼組織片を再度フィルターに通します。このプロセスを5ミリリットルのフローバッファーで繰り返します。次に、解離チューブを洗浄し、最後の10ミリリットルのフローバッファーでろ過します。

コニカルチューブをGの400倍で摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞ペレットを乱さずに上清をデカントします。チューブを別のチューブに対してフリックして、ペレットを分割します。次に、1ミリリットルの溶解液を加え、チューブを室温で30秒間回転させて赤血球を溶解します。

20ミリリットルのフローバッファーで反応を停止し、コニカルチューブの400倍Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。細胞ペレットを乱さずに上清をデカントします。チューブを別のチューブに対してフリックします。

次に、5ミリリットルの冷たいHBSSを追加します。遠心分離を繰り返し、上清を取り除きます。P1000ピペットを使用して各サンプルに0.5ミリリットルの生死染色を加え、ペレットが完全に解離することを確認します。

サンプルを1.2ミリリットルのマイクロタイターチューブに移し、暗所で15分間インキュベートします。その間、トリパンブルーと血球計算盤でサンプルの10マイクロリットルのアリコートを数えます。インキュベーション後、400マイクロリットルのコールドフローバッファーを追加して各サンプルを洗浄します。

マイクロタイターチューブラック内のチューブをGの400倍で摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞ペレットを乱さずに上清を吸引します。細胞を500マイクロリットルのコールドフローバッファーに再懸濁します。その後、遠心分離を繰り返し、上清を取り除きます。

50マイクロリットルのFCブロックで最大500万個の生細胞をブロックします。細胞ペレットを完全に解離し、摂氏4度で20分間インキュベートします。次に、各サンプルに50マイクロリットルの抗体染色溶液を加えます。

完全に混合し、摂氏4度でさらに30分間インキュベートします。ここでは、1 つのマウスの 2 つの目から解析されたすべてのイベントの前方散乱領域と側面散乱領域のプロパティを示します。ビーズカウントは、APC-Cy7上にPEをプロットすることにより洗浄および確認され、PE陽性イベントとAPC-Cy7陰性イベントの密集クラスターが作成されました。

次に、すべてのイベントから生細胞のシングレットを同定しました。一重項は、前方散乱高さと前方散乱面積で正の相関があり、ダブレット細胞と三重項細胞は前方散乱高さよりも前方散乱面積が大きかった。生細胞は前方散乱領域が陽性で、生死染色が陰性です。

ここでは、生きた一重項細胞から単核食細胞を描写するための最初のゲーティング戦略を示します。生きたシングレットは、CD45対CD11bプロットを用いて可視化した。CD45 FMOにCD45陽性細胞が存在しないことから、ゲート選択が確認されました。

次に、好中球、好酸球、B細胞、K細胞、およびT細胞を、系統ゲート付きCD45陽性の生シングレットとCD11bをプロットすることにより、除外しました。マクロファージサブセットも同定されました。

ミクログリアは、CD64陽性MHC2低染色のCD45-dim細胞で描写されました。MHC2陰性マクロファージは、CD64陽性MHC2陰性として同定された。CD11c陰性およびCD11c陽性マクロファージは、CD64陽性CD11c陰性として示されました。

MHC2陽性細胞におけるCD64陽性CD11c陽性。レーザー治療により、MHC2陰性、CD11c陰性、CD11c陽性のマクロファージの量が増加することがわかりました。樹状細胞数もレーザー治療によってアップレギュレーションされましたが、ミクログリアと単球の数は影響を受けませんでした。

全身性灌流はマクロファージ数に影響を与えませんでした。この手順に続いて、解析のみではなく蛍光活性化セルソーティングにより、トランスクリプトームまたはプロテオミクス研究を通じて、マクロファージの不均一性およびそれが機能に及ぼす影響の特性評価が可能になります。