Name: 子宮内電散法における両側性を用いたパイプラインによるげっ歯類の行動に対する遺伝的影響の調査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-21T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 学ぶ両側性子宮内電散法によるマウス胚への遺伝子導入技術。神経精神疾患関連遺伝子の発現変化と社会的行動への影響を効率的に解析し、新規治療法開発への貢献を目指す研究方法です。

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リサ・クレツジの批判的なフィードバックと原稿の編集に感謝します。私たちは、行動脳の灌流と細胞カウントを支援する上で非常に貴重だったクルス・マルティン研究所のすべての研究アシスタントに感謝します。三極電極の設計に関するアンジェイ・チェッチ、コンフォーカル顕微鏡の使用に対するトッド・ブルーテとボストン大学生物学イメージングコアに感謝します。この研究は、NARSADヤング・サーポジスト・グラント(AC-M、#27202)、ブレントン・R・ルッツ賞(ALC)、I.アルデン・マッキ賞(ALC)、NSF NRT UtB:神経フォトニクス国立研究フェローシップ(ALC、#DGE1633516)、ボストン大学学部研究機会プログラム(WWY)によって支援されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。

<ol><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+association+and+meta-analysis+of+a+schizophrenia+GWAS+variant+rs10489202+in+East+Asian+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Genetic association and meta-analysis of a schizophrenia GWAS variant rs10489202 in East Asian populations.</a> Translational Psychiatry. 8 (1), 144(2018).</li>
<li>Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+insights+from+108+schizophrenia-associated+genetic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci.</a> Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).</li>
<li>Howard, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+meta-analysis+of+depression+identifies+102+independent+variants+and+highlights+the+importance+of+the+prefrontal+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genome-wide meta-analysis of depression identifies 102 independent variants and highlights the importance of the prefrontal brain regions.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 343-352 (2019).</li>
<li>Grove, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+common+genetic+risk+variants+for+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder.</a> Nature Genetics. 51 (3), 431-444 (2019).</li>
<li>Comer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+schizophrenia-associated+gene+C4+leads+to+hypoconnectivity+of+prefrontal+cortex+and+reduced+social+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Increased expression of schizophrenia-associated gene C4 leads to hypoconnectivity of prefrontal cortex and reduced social interaction.</a> PLoS Biology. 18 (1), 3000604(2020).</li>
<li>Chini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+and+Rescuing+Developmental+Miswiring+in+a+Mouse+Model+of+Cognitive+Impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Resolving and Rescuing Developmental Miswiring in a Mouse Model of Cognitive Impairment.</a> Neuron. 105 (1), 60-74 (2020).</li>
<li>Clifton, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+genes+associated+with+schizophrenia+and+bipolar+disorder+across+development%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of genes associated with schizophrenia and bipolar disorder across development.</a> Translational Psychiatry. 9 (1), 74(2019).</li>
<li>Oberlander, V. C., Xu, X., Chini, M., Hanganu-Opatz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+dysfunction+of+prefrontal-hippocampal+networks+in+mouse+models+of+mental+illness%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Developmental dysfunction of prefrontal-hippocampal networks in mouse models of mental illness.</a> European Journal of Neurosciences. 50 (6), 3072-3084 (2019).</li>
<li>Batista-Brito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+Dysfunction+of+VIP+Interneurons+Impairs+Cortical+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Developmental Dysfunction of VIP Interneurons Impairs Cortical Circuits.</a> Neuron. 95 (4), 884-895 (2017).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Dissection+of+Neural+Circuits%3A+A+Decade+of+Progress%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic Dissection of Neural Circuits: A Decade of Progress.</a> Neuron. 98 (2), 256-281 (2018).</li>
<li>DeNardo, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+strategies+to+access+activated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Genetic strategies to access activated neurons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 121-129 (2017).</li>
<li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annual Reviews in Neurosciences. 36, 183-215 (2013).</li>
<li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Molecular Therapy. 18 (1), 80-86 (2010).</li>
<li>Callaway, E. M., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+Circuit+Tracing+with+Glycoprotein-Deleted+Rabies+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic Circuit Tracing with Glycoprotein-Deleted Rabies Viruses.</a> Journal of Neurosciences. 35 (24), 8979-8985 (2015).</li>
<li>Cruz-Martín, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dedicated+circuit+links+direction-selective+retinal+ganglion+cells+to+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A dedicated circuit links direction-selective retinal ganglion cells to the primary visual cortex.</a> Nature. 507 (7492), 358-361 (2014).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+stabilization+of+dendritic+spines+in+fragile+X+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice.</a> Journal of Neurosciences. 30 (23), 7793-7803 (2010).</li>
<li>Zhang, J. H., Adikaram, P., Pandey, M., Genis, A., Simonds, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+genome+editing+through+CRISPR-Cas9+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Optimization of genome editing through CRISPR-Cas9 engineering.</a> Bioengineered. 7 (3), 166-174 (2016).</li>
<li>Strecker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+DNA+insertion+with+CRISPR-associated+transposases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases.</a> Science. 365 (6448), 48-53 (2019).</li>
<li>Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+induces+the+elongation+of+early+dendritic+protrusions+via+mGluRs+in+wild+type+mice%2C+but+not+in+fragile+X+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Glutamate induces the elongation of early dendritic protrusions via mGluRs in wild type mice, but not in fragile X mice.</a> PLoS One. 7 (2), 32446(2012).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. 19, Suppl 1 120-125 (2009).</li>
<li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> Frontiers in Molecular Neurosciences. 4, 37(2011).</li>
<li>Szczurkowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+in+vivo+genetic+manipulation+of+the+mouse+or+rat+brain+by+in+utero+electroporation+with+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Targeted in vivo genetic manipulation of the mouse or rat brain by in utero electroporation with a triple-electrode probe.</a> Nature Protocols. 11 (3), 399-412 (2016).</li>
<li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960(2012).</li>
<li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature Neurosciences. 17 (3), 400-406 (2014).</li>
<li>Mathis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeepLabCut%3A+markerless+pose+estimation+of+user-defined+body+parts+with+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning.</a> Nature Neurosciences. 21 (9), 1281-1289 (2018).</li>
<li>Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transportable%2C+inexpensive+electroporator+for+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation.</a> Development Growth and Differentiation. 57 (5), 369-377 (2015).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+analysis+identifies+30+new+susceptibility+loci+for+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association analysis identifies 30 new susceptibility loci for schizophrenia.</a> Nature Genetics. 49 (11), 1576-1583 (2017).</li>
<li>Ripke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+analysis+identifies+13+new+risk+loci+for+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association analysis identifies 13 new risk loci for schizophrenia.</a> Nature Genetics. 45 (10), 1150-1159 (2013).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-selective+electroporation+of+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Subtype-selective electroporation of cortical interneurons.</a> Journal of Visualized Experiment. (90), e51518(2014).</li>
<li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li>
<li>Soma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+mouse+amygdala+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development of the mouse amygdala as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> Journal of Comparative Neurology. 513 (1), 113-128 (2009).</li>
</ol>

著者らは競合する利益を宣言しない。

本明細書において、前頭皮質ニューロンの大きな集団における関心のある新規遺伝子の操作をマウスにおける行動アッセイと組み合わせたパイプラインが記載されている。さらに、このパイプラインは、出生後の早期発達と成人期の両方で同じマウスの行動の縦断的研究を可能にする。この技術は、時間と費用の面でコストがかかる可能性のある遺伝的動物モデルに依存する必要性をバイパスします。このプロトコルの強みは、最近のGWASが新しい遺伝関連を発見した神経発達および神経精神疾患を研究するために使用することができるということです28,29.この方法は、興奮性ニューロンの細胞型特異的なトランスフェクションを提供するが、1つの制限は、インターニューロンまたはグリア細胞のような他の脳細胞タイプを標的にすることは不可能である。しかし、複数の研究は、他の脳細胞タイプ30、31を標的とする修正されたアプローチを示唆している。さらに、胚の頭部に対する電...

ゲノムワイド関連研究(GWAS)は、脳病理1、2、3、4に関連する新しい候補遺伝子の発見を推進してきた。これらの研究は、統合失調症(SCZ)などの壊滅的な神経精神疾患を理解する上で特に有益であり、新しい遺伝子の調査は、新しい研究ラインと治療介入の開始点として役立っています5,6.SCZに対するリスクを抱える遺伝子は、出生前および出生後早期の発達の間に前頭前野(PFC)において偏った発現を示し、いくつかの神経精神疾患の病理に関与する領域7。さらに、精神障害のマウスモデルはPFCネットワーク6、8、9において異常な活動を示す。これらの結果は、SZC関連遺伝子がこの領域の発達配線に役割を果たす可能性があることを示唆している。動物モデルを用いたさらなる調査は、PFCにおける接続の確立に対するこれらの候補遺伝子の寄与を理解し、これらの遺伝子が神経精神疾患の病因に原因となる役割を有するかどうかを判断するために必要である。出生前および出生後の発達の間に特定の神経回路の遺伝子発現変化を研究することを可能にするマウスの遺伝子操作技術は、遺伝子発現変化をPFC機能不全に結びつける分子メカニズムを理解するための有望な方法である。
遺伝的マウスラインは、脳の発達と機能に対する特定の遺伝子の影響を研究する方法を提供します。しかし、トランスジェニックマウスに頼ることは、特定の遺伝子が神経回路の発達に及ぼす影響を調べるために必ずしも市販のラインが存在するとは限らないので、制限することができます。さらに、カスタムマウスラインを開発するには非常にコストがかかり、時間がかかる場合があります。トランスジェニックマウスとウイルスアプローチを組み合わせた交差遺伝子操作戦略の使用は、脳10、11、12の理解に革命を起こしている。多くの進歩にもかかわらず、ウイルス戦略は、ウイルス発現13およびウイルス発現14に関連する細胞毒性を制限することができる包装能力の限界を含むウイルスベクタータイプに依存する一定の制限を伴う。さらに、ほとんどの実験条件では、アデノ関連ウイルス(AAV)を用いた堅牢な遺伝子発現には約2~4週間の15週間が必要であり、出生後の早期開発中に遺伝子を操作することは不可能な日常的なウイルス戦略を作る。
子宮エレクトロポレーション(IUE)では、蛍光標識および薬理遺伝学的または光遺伝学的アプローチと相まって、神経回路の機能を解剖するための強力なプラットフォームを提供する、迅速かつ安価な遺伝子導入16、17を可能にする代替アプローチである。さらに、CRISPR-Cas9ゲノム編集遺伝子の開発により、細胞型特異的なノックダウンまたは特定遺伝子のノックアウトまたはプロモーター18、19の調節を介して過剰発現または正確に改変することができる。IUEを用いた遺伝子操作アプローチは、狭い発達窓20の間に遺伝子が神経回路に及ぼす影響をテストする必要がある場合に特に有利である。IUEは多目的な技術であり、特定のプロモーターの下で発現ベクターに遺伝子を挿入することによって容易に過剰発現を達成することができる。遺伝子発現のさらなる制御は、異なる強みのプロモーターを用いて発現を駆動するか、または遺伝子発現21,22を時間的に制御できる誘導性プロモーターを用いて達成できる。さらに、IUEは、特定の皮質層、細胞タイプおよび脳領域内の細胞の標的化を可能にするが、これは他のアプローチ5,17を使用して必ずしも実現可能ではない。より効率的な電界分布を発生させる3つの電極の使用に基づくIUE構成の最近の進歩は、この方法の機能的レパートリーを拡大し、科学者が新しい細胞タイプを標的にし、23、24を標的とすることができる細胞の効率、精度、および数を増加させることができた。この技術は、補体成分4A(C4A)、SCZに連結された遺伝子、PFC機能および早期認知5における原因の役割を決定するために最近使用された。
ここでは、PFCを含む前頭皮質の興奮性ニューロンの大規模な集団を標的とする遺伝子導入アプローチと、細胞および回路レベルの変化の研究を可能にするだけでなく、早期産後の発達および成人期を通じて行動を監視することを可能にする行動パラダイムを組み合わせた実験的パイプラインです。第1に説明する、前頭皮質領域における層(L)2/3錐体ニューロンの大きな集団を両側にトランスフェクトする方法である。次に、若年マウスおよび成体マウスにおける社会的行動をアッセイする課題について概説する。細胞数は、細胞トランスフェクションの範囲と位置を定量化する行動タスクの完了時に得ることができます。さらに、トランスフェクトされた細胞の数は、より多くのトランスフェクトされた細胞が行動のより大きな摂動につながるかどうかを判断するために行動データと相関させることができる。

<table><tbody><tr><td>13mmシルクブラック編組縫合</td><td>糸ハヴェルの</td><td>SB77D</td><td>縫合皮</td></tr><tr><td>広告ソン鉗子</td><td>FST</td><td>11006-12</td><td>IUE</td></tr><tr><td>C270 Webcam</td><td>Logitech</td><td>N/A</td><td>Record behavior</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Custom-built</td><td>N/A</td><td>図1および図2およびBullmann et al, 2015</td></tr><tr><td>EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>BS466</td><td>プラドミド製剤</td></tr><tr><td>ファストグリーンFCF</td><td>シグマ</td><td>F7252-5GDNA</td><td>溶液用染料</td></tr><tr><td>ファインハサミ-シャープ</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td>IUE</td></tr><tr><td>フィッシャーブランドガーゼスポンジフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>1376152</td><td>IUE</td></tr><tr><td>ゲイマー加熱/冷却</td><td>ブレイン</td><td>ツリーTP-700</td><td>加熱パッド</td></tr><tr><td>ガラスピペットプーラー</td><td>サッター機器、</td><td>P-97</td><td>IUE</td></tr><tr><td>ガラスピペット</td><td>サッター機器、</td><td>BF150-117-10</td><td>IUE</td></tr><tr><td>脱毛ローション</td><td>ネア</td><td>N / A</td><td>脱毛</td></tr><tr><td>用ハートマン止血</td><td>剤F.S.T.</td><td>13002-10</td><td>IUE</td></tr><tr><td>オープンフィールド迷路-自家製アクリルアリーナカスタム</td><td>ビルド</td><td>N / A</td><td>50 &times; 50 &times; 30 cm 長さ-幅-高さ</td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td>GFPの発現のための哺乳類発現ベクトル</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>パーカーハネフィン</td><td>N / A</td><td>圧力インジェクター</td></tr><tr><td>リトラクター-2プロングブラント</td><td>FST</td><td>17023-13</td><td>IUE</td></tr><tr><td>リング鉗子</td><td>F.S.T.</td><td>11103-09</td><td>IUE</td></tr><tr><td>滅菌器、ドライビーズ</td><td>シグマ</td><td>Z378569</td><td>ステリゼ手術器具</td></tr><tr><td>縫合糸、3/0 PGA、FS-2、獣医用バイオレットのみ</td><td>ハヴェルの</td><td>HJ398</td><td>縫合筋</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>コールパー</td><td>マーEW-12105-84</td><td>加温滅菌生理食塩水</td></tr></tbody></table>

子宮内電散法における両側性を用いたパイプラインによるげっ歯類の行動に対する遺伝的影響の調査

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

ゲノムワイド関連研究は、多くの神経疾患の異種遺伝的基盤に光を当てるにつれて、脳の発達と機能に対する特定の遺伝子の寄与を研究する必要性が高まる。トランスジェニックマウスラインは非常に高価であり、多くの新しい疾患関連遺伝子はまだ市販の遺伝的線を持っていないため、特定の遺伝子操作の役割を研究するためにマウスモデルに頼ることは必ずしも実現可能ではありません。また、マウス ラインを作成するには、開発と検証に何年もかかる場合があります。子宮内エレクトロポレーションでは、特定の遺伝子操作を達成するためにDNAプラスミドを開発するだけで必要な生体内での細胞型特異的な方法で遺伝子発現を操作する比較的迅速かつ容易な方法を提供する。子宮内の両側性のエレクトロポレーションは、前頭皮錐体錐神経細胞の大規模な集団を標的にするために使用することができる。この遺伝子導入法と行動アプローチを組み合わせることで、前頭前野ネットワークの機能や若年マウスおよび成体マウスの社会的行動に対する遺伝子操作の効果を研究することができます。

カスタムエレクトロポレーターと3つのプロング電極の開発と実装に成功しました。 IUE の場合、前述の設計27に基づいて安価なカスタムエレクトロポレーターが構築されました (図 1Aおよび図 2)。突起の先端に2つの負極を取り付けたプラスチック鉗子を用いて23,24の突起電極を作り、正極を歯ブラシハンドルの端に取り付けた(図1B)。エレクトロポレーターと3つの突起電極を試験し、適切な機能を確保した。IUEは、子宮の角を露出させ、プラスミドDNAを注入し、各胚を電気ポッピングすることによって行われた(図1C)。3つの突起電極は、胚の頭部を安定化させるために突起を使用して、図示のように(<strong c...

神経精神疾患の病因における最近発見された疾患関連遺伝子の役割は依然として不明瞭である。子宮エレクトロポレーション技術における修飾された両側性は、ニューロンの大規模集団における遺伝子導入と、社会的行動に対する遺伝子発現変化の原因の影響の検討を可能にする。

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...

この方法を用いることで、特定の遺伝子発現の変化が神経疾患に関連する病状にどのように起因するかを発見することができます。この技術の利点は、作成と検証に何年もかかる可能性のある遺伝的動物系統を作成または購入する必要性を回避できることです。この技術により、神経疾患に関与する遺伝子の研究が可能になります。特定の遺伝子が病理にどのように寄与しているかを決定することは、新しい治療法を開発するための重要なステップです。このプロトコルの利点は、実験者が生存率を低下させることなく遺伝子導入ステップを達成するように、胚を操作することを学習することです。胚は非常に壊れやすいため、この方法を視覚的に示しておくことは重要であり、経験豊富な実験者が処置中に胚をどのように操作するかを観察することは有益です。手術の少なくとも30分前に、妊娠中の母親を手術エリアに持っていきます。滅菌した殺菌ワイプを使用して手術部位全体を滅菌し、次に70%エタノールを使用します。次に、オートクレーブツールをガラスビーズ滅菌器で滅菌します。滅菌PBSを50ミリリットルの円錐管に移し、38〜40°Cに加熱した水浴にチューブを置きます。温度計で滅菌生理食塩水温度を確認してください。給湯循環ポンプをオンにして、摂氏37度に温めます。次に、圧力インジェクターとエレクトロポレーターをオンにして、適切に機能していることを確認します。血漿DNA溶液を卓上遠心分離機で短時間遠心し、氷上に置きます。ピペットプーラーでガラスピペットを引っ張り、引っ張ったガラスピペットの先端が直径約50マイクロメートルになるようにします。次に、ピペットに20〜40マイクロリットルのDNA溶液を入れます。脱毛ローション、ヨウ素、70%エタノール、綿棒、点眼薬、縫合糸、ガーゼなど、手術に必要なすべてのアイテムを設定します。手術シートを用意し、必要事項を記入します。手術前にマウスの体重を測定し、体重を記録します。マウスに麻酔をかけた後、術前に鎮痛薬を投与し、脱毛クリームまたはカミソリを使用して腹部から毛皮を取り除きます。腹部をポビドンヨードと70%エタノールで3回綿棒で拭いて滅菌します。腹部の周りに滅菌フィールドを作成し、滅菌ガーゼとドレープで。筋肉を切開しないように、鉗子で皮膚を持ち上げながら腹部の皮膚に正中線を切開します。次に、筋肉を持ち上げて切り抜き、重要な臓器を切らないように注意しながら切り抜きます。環状鉗子を使用して子宮角をダムから慎重に引き出し、無菌フィールドにそっと置き、パッドで支えられ、ダムから離れすぎないようにします。手術の残りの部分では、温めた滅菌PBSを使用して子宮角を湿らせておきます。鉗子または指のいずれかで胚を配置し、引っ張ったガラスピペットを横方向の垂直に慎重に挿入し、ピペットを一方の心室に挿入し、次にもう一方の心室に挿入して、各心室に2〜3マイクロリットルを注入します。心室は、注射後に三日月形が存在する場合、うまく標的化されています。前頭皮質で細胞を両側にトランスフェクションするには、2つの負極を胚の頭の側面に置き、側脳室に対してわずかに尾側に配置し、正極を発育中の鼻のすぐ前の目の間に配置します。胚がたっぷりと湿っていることを確認し、4つの正方形のパルスを適用します。DNA溶液注入の直後に各胚がエレクトロポレーションされるように、すべての胚を1つずつ注入してエレクトロポレーションします。すべての胚がエレクトロポレーションされたら、子宮角を慎重に腹腔に戻します。腹腔内を滅菌PBSでコーティングして、子宮角の配置を助けます。縫合が完了した後にエアポケットが残らないように、腹腔内に滅菌PBSを充填します。吸収性縫合糸で筋肉を縫合し、シルク非吸収性縫合糸で皮膚を縫合します。ダムが加熱されたチャンバーで少なくとも1時間完全に回復するのを待ちます。今後48時間、定期的にダムをチェックしてください。ダムが麻酔から回復して意識を取り戻すと、動き始めて泡立て始めます。この方法は、約5, 000層2/3錐体ニューロンをpCAG-GFPプラスミドでトランスフェクションするために使用されました。これらの細胞のほとんどは、前頭皮質領域に局在していました。代表的な例は、成体コントロールマウスにおけるトランスフェクションされたニューロンの吻側尾側分布を示しており、前頭皮質の錐体ニューロンの大きな集団を標的とし、遺伝的に標識する両側のIUEの能力を確認しています。母性相互作用課題の最初の部分では、制御されたP18トランスフェクトマウスが巣床を見つける能力をテストします。対照マウスは、新しい寝床を探索するよりも巣床を探索する時間の方が長かったことから、感覚運動能力と探索行動が損なわれていないことが示唆された。タスクの2番目の部分は、マウスが母親と対話するように動機付けられる傾向を利用します。このタスクでは、子犬はほとんどの時間を母親の近くで過ごし、空のカップや巣の寝具を探索する時間が大幅に減少しました。成体対照マウスは、新しい物体を探索する時間の約35%を費やしました。小説と身近な物体を提示されたとき、成体マウスは新しい物体を探索するのにより多くの時間を費やしました。社会性課題では、対照の成体マウスが同様の時間を費やして、新しいマウスと空のカップを探索しました。この動作は、DeepLabCutソフトウェアを使用して、手足、重心、頭、耳など、マウス上のさまざまなポイントにラベルを付けることにより、自動的に追跡されました。また、マウスが後ずさりすると体の長さが短くなるため、マウスがいつ子育てをしていたかを判断するためにも使用されました。この手順に従うと、組織を検査し、スパイン密度やさまざまなタンパク質の発現レベルなどのさまざまな測定値をアッセイすることで、多くの細胞分子の質問に答えることができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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このプロトコルは、子宮内エレクトロポレーションを介してC57BL/6中枢神経系の異なる領域を特異的にトランスフェクションする方法を詳細に説明しています。このプロトコルには、皮質、海馬、視床、視床下部、外側中隔核、線条体に発達する領域のトランスフェクションに関する詳細な指示が含まれています。...

Cortex-、Hippocampus-、Thalamus-、Hypothalamus-、横中隔Nucleus-と線条体固有<em&gt;子宮内</em&gt; C57BL / 6マウスでのエレクトロポレーション

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脳奇形の原因となる遺伝子を識別するアレイ CGH、全エキソーム配列と齧歯動物の子宮にエレクトロポレーションを組み合わせた新たな戦略

子宮エレクトロポレーションの二重は、空間的および時間的に分離された細胞集団を標的にすることを可能にする。この技術は、通常の条件で蛍光タンパク質を使用して、また、目的の遺伝子を摂動する機能実験の後に、それらの細胞集団間の相互作用を視覚化するのに有用である。...

時間的および空間的に分離された細胞集団を標的とする子宮エレクトロポレーションの二重

学ぶ両側性子宮内電散法によるマウス胚への遺伝子導入技術。神経精神疾患関連遺伝子の発現変化と社会的行動への影響を効率的に解析し、新規治療法開発への貢献を目指す研究方法です。

子宮内電散法における両側性を用いたパイプラインによるげっ歯類の行動に対する遺伝的影響の調査

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