磁性ナノ材料の生体機能化

このプロトコルの主な特徴は、広範囲の酸化鉄ナノ材料に適用できることです。また、鉄-金ナノワイヤーなどのマルチセグメントナノ材料にも適用できます。このプロトコールは、標準的な生物学研究室であれば、どのようなものでも安全に実施することができます。

このバイオファンクショナル化技術の主な利点は、ナノワイヤと抗体との間の強力な共有結合に基づいて、特異的に標的を絞ったナノ材料を作製できることです。まず、片刃の刃と小さなハンマーでアルミディスクを細かく切ります。カットしたピースを2ミリリットルのチューブに入れ、1ミリリットルの1モルの水酸化ナトリウムで満たし、すべてのアルミニウム片が覆われていることを確認します。

チューブを室温で化学吸引フードに30分間放置します。インキュベーション後、ピンセットでアルミニウム片を取り出し、放出したナノワイヤーをさらに水酸化ナトリウムに30分間保持します。チューブを磁気ドライラックに入れ、2分間待ってから、溶液を新鮮な水酸化ナトリウムと交換します。

2ミリリットルのチューブをナノワイヤーで30秒間超音波処理し、化学ドラフト内に1時間放置します。この手順を少なくとも 4 回繰り返します。終了したら、2ミリリットルのチューブを磁気ラックに入れ、水酸化ナトリウムを捨てて、1ミリリットルの無水エタノールと交換します。

ナノワイヤーを30秒間超音波処理し、チューブを磁気ラックに入れ、エタノールを交換します。エタノール洗浄を少なくとも4回繰り返します。ナノワイヤーを洗浄した後、1ミリリットルのピペットで5ミリリットルのガラス管に移します。

ナノワイヤ溶液に100マイクロリットルのAPTESを加え、ガラス管を20秒間ボルテックスします。チューブを超音波浴に入れ、1時間超音波処理します。次に、チューブを浴から取り出し、400マイクロリットルの脱イオン水と20マイクロリットルの1モル水酸化ナトリウムを追加します。

1時間の超音波処理を繰り返します。ガラス管を超音波浴から取り出した後、磁石の隣に置き、ナノワイヤーを収集します。上清を1ミリリットルの新鮮な無水エタノールと交換し、チューブを10秒間超音波処理します。

エタノール洗浄と超音波処理を2回繰り返します。0.4ミリグラムのEDCと1.1ミリグラムのスルホNHS、および1ミリリットルのMESを2ミリリットルのチューブに溶解します。別の2ミリリットルのチューブに、960マイクロリットルの0.1モルPBSを追加し、それに30マイクロリットルの抗CD44抗体を追加します。

次に、このチューブに、以前に調製したEDC / Sulfo-NHS混合物の10マイクロリットルを追加します。抗体チューブをシェーカーに入れ、Gの10倍で室温で15分間振とうします。その間、APTESでコーティングされたナノワイヤーをチューブの隣に磁石で2分間置き、エタノールを捨ててPBSに交換します。

ナノワイヤーを10秒間超音波処理します。PBSでの最後の洗浄後、ナノワイヤーを回収し、活性化抗体溶液をナノワイヤーのチューブに移します。その後、10秒間超音波処理します。

ローテーターのチューブを摂氏4度で一晩交換します。翌日、磁石でナノワイヤーを採取し、上清を捨てます。2%BSAを1ミリリットル加え、チューブを摂氏4度で1時間インキュベートして反応をブロックします。

電子エネルギー損失分光法またはEELSマップを使用して、ナノワイヤ表面上のシリコン原子を視覚化し、APTESコーティングの存在を確認できます。コーティングされていないナノワイヤでは、鉄原子は濃い青色に見え、鉄原子と酸素混合原子は水色です。非被覆ナノワイヤの対応するEELSマッピングは、表面よりも中央の鉄対酸素の強度が高いことを示しており、酸化鉄-酸化鉄構造を示しています。

マッピングは、酸化鉄層が酸化鉄(III)よりも酸化鉄(II、III)が多く構成されていることを示しました。付着した抗体の抗原性は、免疫沈降およびウェスタンブロットアッセイを用いて確認しました。BCAアッセイを使用して、ナノワイヤー上の抗体の数を定量しました。

ゼータ電位の測定を用いて、表面の機能化を解明しました。APTES上の末端アミン基は、コーティングされていないナノワイヤと比較して負電荷を減少させました。抗体の機能化により、電荷がさらに減少しました。

抗体官能化ナノワイヤーの特異的な細胞標的化は、共焦点顕微鏡を用いて確認されました。図AとBは、それぞれ試料CとDの明視野顕微鏡画像を表しています。赤色は細胞膜の描写に対応し、青色は核を表し、緑色のクラスターは結合した標的CD44ナノワイヤの存在を表しています。

さらに、細胞生存率アッセイを使用して、非コーティング、APTESコーティング、および抗体コーティングされたナノワイヤーが生体適合性であることを確認しました。APTESプロセスコーティングでは、APTES分子とナノワイヤとの間の結合を強化するために、水酸化ナトリウム溶液の前に脱イオン水を加えることが非常に重要です。また、バイオファンクチャリゼーションの過程で、抗体とナノワイヤーとの間の共有結合を強化するために、ナノワイヤーをPBSバッファーで数回洗浄する必要があります。