Name: シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学ぶ 大腸菌の鞭毛駆動運動性を解析する3つの確立技術。ソフトアガー平板、相対比顕微鏡、スウォームアッセイを用いて個体および集団運動を系統的に評価し、病原性細菌の挙動理解に貢献します。

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この研究は、国立衛生研究所助成金GM118085とロバート・ウェルチ財団(R.M.H.にF-1811を付与)によって部分的に支援されました。

1. 運動不足株におけるサプレッサー変異体の分離
注: この方法を広範な「キャッチオール」として使用して、運動性欠陥の一般的な性質を特定してください。
<ol><li>ソフト寒天プレートの準備 注:軟寒天は、運動性または水泳寒天とも呼ばれ、低パーセンテージ寒天(〜0.2-0.35%w/v)であり、長い間気胸31,32をアッセイするために使用される。<ol>
<li>2 Lラウンドボトムフラスコにバクト寒天(0.3%w/v)とLB20gを加えます。フラスコに1LのddH2O(二重蒸留水)を加え、攪拌棒と磁気攪拌板を使用して懸濁液を均等に混合します。</li>
		<li>121 °Cで20分間オートクレーブ。</li>
		<li>上記のようにロッド/プレートを使用して穏やかな攪拌で冷却することができます。温度が約50°Cに達したら、滅菌ペトリ皿(100mm x 15mm)に25mLを注ぎ、溶融寒天を16時間以内に蓋を少なくとも1時間所定の位置にセットします。</li>
	</ol></li>
	<li>培養製剤、接種、およびサプレッサー変異体の単離 注:柔らかい寒天で固まった栄養豊富な培地の中心に接種された 大腸菌 は、栄養素を局所的に消費し、彼らが従う栄養勾配を作り出します。彼らが外側に移動すると、定義された「リング」が現れ(図1A)、これは細菌が反応する特定の化学誘引物質に関連している。このアッセイでは、気化システムまたは構造成分の欠陥が性能を損なう可能性があります。多くの場合、運動性優位を有する変異体はスクリーニング中に生じ、環の周囲に沿った単一または複数の点から出現し、そこから「フレア」アウト(図1C)を見ることができる。一つは、水泳の前線の最も外側の端は、植民地化されていない処女柔らかい寒天と対比容易に気づくでしょう。<ol>
<li>レノックスブロスの5 mLで所望の運動欠乏株の一晩培養を成長させます (LB; 10 g/L トリプトン, 5 g/L酵母エキス, 5 g/L NaCl, 材料表) 水平振幅を有する 30 °Cで (220 r.p..m.).翌日、亜培養(1:100希釈)を新鮮なLBで、同じ条件下で指数相(OD600 0.6)に成長する。</li>
		<li>培養液の6μLをピペットを用いて柔らかい寒天プレート(1.1)の中央に接種し、ロードされた無菌チップを寒天に押し込んで内容物を静かに排出します。30°Cに移し、インキュベート(図1B)、運動性'フレア'が明らかになるまで、運動環の接種点または周辺から発せられる、典型的には24〜36時間(図1C)。 注:運動性アッセイでは、変異体分離物と一緒に野生型株を接種して比較します。この野生型株は特徴的な同心円式化学式の環(図1A)を示し、8-10時間内にプレートを充填します。</li>
		<li>滅菌ワイヤーループを使用して「フレア」領域から細胞を持ち上げ、ストリークして単一コロニーをLB硬寒天プレート(上記のように調製したLB、15 g/Lバクト寒天で固化)に精製します。</li>
		<li>滅菌ワイヤーループを使用してストリークプレートから単一のコロニーを選び、「純粋な」コロニー分離を確実にするために単一のコロニーのためにストリークすることによって再精製します。</li>
	</ol></li>
	<li>サプレッサー変異体の確認と特性評価
	<ol>
<li>分離されたサプレッサー変異体が運動性を回復したことを確認する。軟寒天プレート(1.1)、および野生型と比較のための開始「運動不足」株を含む、関心のある株(1.2.1のように)のための培養を準備します。</li>
		<li>プレート(1.2.2のように)を接種し、30°Cで8〜10時間インキュベートします。</li>
		<li>最も外側のリング(円の縁)の直径を記録し、どの分離株が運動性を実質的に回復させているかを確立するために比較する。 メモ:実験の時間を通してプレートを撮影することをお勧めします。最良の結果を得るためには、デジタルカメラを光源の上に取り付けて、泳ぐコロニーの直径を測定し、非植民地化された寒天と区別する「光のバケツ」装置30を使用する。</li>
		<li>被験者は必要に応じてWGSに隔離し、野生型の機能を回復した突然変異を肯定的に同定するのに十分な「シーケンスカバレッジ」を可能にする。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 細胞テザリングによるフラゲラ運動の挙動を定量化する
注: 通常のランタンブル動作(chemotaxis)が危険にさらされていると思われる場合は、この方法を使用します。
<ol><li>
培養準備とフラゲラせん断
	<ol>
<li>ステップ 1.2.1 で説明したように、対象株の指数位相培養を準備します。</li>
		<li>ペレット 10 mL の細胞は、フィルター滅菌された運動バッファー (MB; 10 mM リン酸カリウムバッファー [0.0935 M K2HPO4,0.0065 M KH2PO4,pH 7.0] , 0.1 mM EDTA [pH 7.0] , 10 mM NaCl, 75 mM KCl. 注:MBは 運動性を サポートしていますが、細菌の増殖をサポートしていません</li>
		<li>ステップ 2.1.2 を 2 回繰り返してから、最終ペレットを 1 mL の MB で再懸濁します。</li>
		<li>細胞懸濁液を1mLのシリンジに移し、23G針を最後に取り付けます。同一の注射器/針装置を組み立て、各針先にしっかりと覆ったポリエチレンチューブ(0.58mmの内径)の6インチを介して2つを一緒に取り付けます。</li>
		<li>1つのシリンジから他の50倍に細胞懸濁液をゆっくりと前後に渡し、10パスごとに1分の休止を行うことによって、フラゲラ(壊れやすく、簡単に壊れる)を剪断します。</li>
		<li>2,000 x g で 3 分間の皮を遠心し、500 μL の最終体積で再中断します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
スライド調製および細胞テザリング
	<ol>
<li>18 mm x 18 mm のカバースリップを 3 インチ x 1 インチ x 1 mm ガラス顕微鏡スライド上に積み重ねて、両面テープで区切ってセル固定チャンバーを準備します (図 S1)。</li>
		<li>チャンバーの上部に塗布することで、0.01%(w/v)ポリリジン溶液でチャンバを洗い流します。下端(顕微鏡スライドでカバースリップをフラッシュ)をタスクワイパー(ティッシュペーパー)に傾け、チャンバー(図S1)を通して溶液を引き出すのに役立ちます。その後、室温で10分間インキュベートします。</li>
		<li>ステップ2.2.2で説明したように使用して、40 μLのMBでチャンバーを3回洗浄します。</li>
		<li>チャンバーの上部に40μLの皮分セル懸濁液(上記を用意)を加え、室温で10分間インキュベートし、細胞をカバースリップに取り付けることができます。</li>
		<li>2.2.3のように40 μLのMBでチャンバーを静かに洗い流し、未接続の細胞を取り除きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞回転記録と定量
	<ol>
<li>つながれた細胞を積んだ顕微鏡のスライドを顕微鏡の段階に移す。</li>
		<li>位相対面顕微鏡と100xの目的を用いて、所定の位置に固定された細胞の母集団をスキャンし、単一軸上で回転する、すなわち、細胞が焦点の出入りする角度で提示するのではなく、固定点で滑らかな回転を行う(ビデオ1)。</li>
		<li>市販の顕微鏡と関連するカメラを使用してください。関連するソフトウェアを開き、対象のセルがフォーカスされていることを確認し、 ビデオ取得 をクリックしてセルの回転を1分間記録します(10フレーム/秒以上)。</li>
		<li>ビデオ再生から、1 分あたりの完全な回転数と、セルの方向 (スイッチング周波数) の変化回数を数値化します。 注:回転速度とスイッチング周波数は目で測定するには速すぎる可能性があるため、低速/細かい再生を提供するビデオソフトウェアを使用するか、自動ソフトウェアシステムを採用して回転パターン33を定量化することをお勧めします。代替手段としては、メチルセルロース(または同様の薬剤)を使用してMBの粘度を上げ、より速い細菌の回転を遅くして解決したり、フレームレートの低いカメラが使用中の場合に補償したりすることです。</li>
		<li>生物学的複製でステップ2.3.2を繰り返し、対象の集団の表現をまとめます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 国境を越えるアッセイにおける群れの準備
注: この方法は、グループ運動性に対する突然変異または条件の影響を評価するために使用します。群寒天とは、一般的に、割合が柔寒天よりも高い寒天を指します。柔らかい寒天(0.3%)では、細胞は寒天の中で個別に泳ぎます。群寒天(0.5%以上)では、細胞は表面上のグループとして移動します。群れプレートはここで詳細に使用する必要がありますが、スイムプレートは貯蔵寿命が長く、数日間使用することができます。私たちの個人的な好みは、1-2日で使用することにあります。
<ol><li>
群寒天の準備
	<ol>
<li>2 Lラウンドボトムフラスコにエイケン寒天5g(0.5%w/v)とLB20gを加えます。フラスコに1LのddH2Oを加え、攪拌棒と磁気攪拌板を使用して懸濁液を均等に混合します。</li>
		<li>121 °Cで20分間オートクレーブ。</li>
		<li>上記のようにロッド/プレートを使用して気泡を避けるために穏やかな攪拌で冷却することができます。約50°Cの場合、フィルター滅菌されたグルコースを加え、最終濃度の0.5%を得ます。</li>
		<li>滅菌ペトリ皿(100ミリメートルx 15ミリメートル)に25 mLを注ぎ、少なくとも14時間と20時間以下の室温で設定することができます。今後の使用のために保管しないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
群板の接種とインキュベーション
	<ol>
<li>寒天の上にスポッティングして、中指数培養物(1.2のように調製)の6μLを接種します。</li>
		<li>蓋を5~10分間は切り、接種物が寒天表面に乾燥したら交換してください。</li>
		<li>30°Cで8時間インキュベートする。これは寒天の乾燥に寄与し、群れを損なうため、蓋を取り除くことによって群れの進行状況を検査する誘惑を避けてください。 注:インキュベーション時間は、歪み表現型によって異なる場合があります。いくつかの孤立した突然変異は、群れの能力を妨げる可能性があり、寒天の減少率またはインキュベーションのより長い期間を必要とします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
国境通過アッセイプレートの準備 注:このアッセイは、プラスチック製の分割(境界)が1つではなく2つのチャンバーを作成する修正されたペトリ皿を利用しています(図2A)。各チャンバーは、2つを「接続」する前に、群れのための異なる条件を提供し、他の独立して準備することができます。実験計画に応じて、第1室(左指定)は、スイム寒天(0.3%w/v)または群寒天(0.5%w/v)のいずれかで調製することができ、そこから細菌は境界を越えて群れの寒天を含む右の部屋に移動することができます+/-必要なサプリメントまたは挑戦(例えば、抗生物質)。いずれの寒天の移動も、通常、接種の元の点から細菌コロニー形成(エッジからエッジ)の最も広い直径を記録することによって測定/比較される。<ol>
<li>必要に応じて、1.1 に記載されているように、スイム寒天を準備します。</li>
		<li>3.1 で説明したように、群れの寒天を準備します。</li>
		<li>〜30 mLの群れ寒天(必要に応じて必要な補充)を、二重コンパートメントペトリ皿(100mm x 15 mm)の右室に注ぎ、チャンバー間のプラスチック仕切りでレベルが高いが、左側にあふれていないところまで(図2B)。</li>
		<li>寒天が固まった後、左室を泳ぐか、または群れの寒天の30mLで満たし、再びプラスチックの分裂と接触するところまで(図2C)。設定する前に、滅菌ピペットチップを使用して、境界線上で寒天をそっとドラッグして、両側を、分割の全長にまたがる約1mmの高さの寒天橋と接続します(図2D)。</li>
		<li>プレートを室温(3.1)で乾燥させます。 注:ブリッジを作成する別の方法は、左チャンバー寒天を乾燥させ、2つのチャンバー(3.4)を橋渡しするためにプラスチック製の仕切りに沿って溶融群寒天のピペット〜100 μLをゆっくりと可能にすることです(3.4)。泳ぐ(1.2.2)または群れ(3.2)寒天のために上記の詳述通り、12-16時間、または群れが右のチャンバー上で十分に進行するまで、左のチャンバーのプレートを接種して、関心のある株の比較を可能にします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

サプレッサー突然変異の分離と特徴付けは、気化システム35、36、37、ならびにモータ機器自体38、39、40の主要成分の同定に成功した。プロトコル1を使用している間、運動性の喪失を補うことができる突然変異の大きなスペクトルの分離を確実にするために、複数の独立した複製を含める必要があります。スポットではなくラインで培養物をストリークさせることにより菌の数を増やすことで、サプレッサ41を生成する確率を向上させることができる。同じ突然変異の単離(DNAシーケンシングによって決定される)を複数回、その真正性に対する信頼度を高めます。WGSは、常にゲノム内の他の突然変異の存在を明らかにする。したがって、同定された突然変異を元の運動...

細菌は、その生態学的ニッチに移動と分散のための多くの付属物を採用しています1.これらの中で最も速いのが、環境信号に応答して好ましいロケールの植民地化を促進し、いくつかの種2,3の病原性能力に大きく寄与する。バネラ菌は、バルク液体で個別に泳ぐか、半固体表面4の上に集団として群がることができます。細胞外のフラグラは膜に埋め込まれた回転モーターによって取り付けられて駆動され、イオン勾配の力を利用して回転1、2、4、5、6、7、8を引き起こすトルクを発生させる。モーターが一定のトルク9で動く大腸菌では、モーター出力は回転速度と回転子の反時計回り(CCW)方向と時計回り(CW)方向の切り替えの観点から分類することができる。CCW回転は、セルを前方に推進するコヒーレント・フラネラ・バンドルの形成を促進し(CW)、一時的な回転方向スイッチ(CW)を行うと、バンドルは部分的または完全に10個を分解し、細胞は泳方向(タンブル)を再び向きにします。大腸菌は通常1秒間走り、10分の1秒は転倒する。ロータまたは「タンブルバイアス」のスイッチング周波数は、化学運動体信号システムによって制御され、膜貫通化学受容体は外部の化学信号を検出し、リンベレーを介してフラゲラモーターに伝達し、誘引物質に応答してランを延長するか、または有毒化学物質11、12に応答してそれらを抑制する。水泳運動は0.3%柔らかい寒天でアッセイされます。
群れの間、細菌は半固体表面を密な集団として移動し、連続渦巻き運動2、13、14、15の中で細菌のパックが流れる。大腸菌群は、変化した化学感覚生理学(低タンブルバイアス)、より高速、およびバルク液体16、17で泳ぐ細胞に対する抗菌性に対する耐性の高さを示す。スウォーマーは、界面活性剤の生産、ハイパーフラフェレーション、細胞伸長2を含む、運動を助ける多くの戦略の展開において異なる。群れは、細菌に生態学的および臨床的な設定18、19、20の両方で競争上の優位性を提供しています。群れの細菌には、0.5-0.8%寒天で固められた媒体でのみ群がることができる温帯スウォーマーと、より高い寒天濃度21を横切ってナビゲートできる堅牢なスウォーマーの2つのカテゴリーがあります。
水泳の運動性とその規制を尋問するために様々なアッセイが存在します。突然変異や環境条件によって障害を受けた場合、運動性自体は、機能の得るサプレッサー突然変異を同定するための強力な選択を提供する。これらのサプレッサーは、元の突然変異の本物の復帰剤、または第2の突然変異が機能を回復する疑似戻し物である可能性があります。このような変異体は全ゲノムシーケンシング(WGS)によって同定することができる。非バイアスサプレッサー選択の代替は、偏った標的突然変異誘発戦略(例えば、PCR変異生成)である。これらの方法論は、多くの場合、運動装置の機能または環境調節に光を当てる。モータ機能を研究することが目標である場合、軟寒天で測定された野生型運動性の回復は、必ずしも野生型モーター出力の回復を示すものではない。細胞テザリングアッセイは、細胞が単一の旗臼によってガラス表面に結合され、その後、細胞体の回転が監視される、運動行動を評価するための最初のアッセイであり得る。モーターの特性を監視するためにより高度な方法論が利用可能になりましたが、モーション分析のためのソフトウェアパッケージの必要な高速カメラのセットアップと適用は、その広範な使用を制限します22,23,24,25.細胞テザリングアッセイは、フラゲラをせき止めることだけを必要とし、短いフィラメントをガラススライドに取り付けることができ、続いて細胞体の回転をビデオ撮影する。このアッセイでは、細胞体がフラゲラムにかかる負荷が高いため、記録されたモータ速度は低いが、このアッセイは、化学戦術応答26、27、28、29に関する貴重な洞察に寄与しており、以下で説明するように有効な調査ツールのままである。
群れの運動性は、研究者にとって異なる課題をもたらします。機能向上抑制剤の選択は、豊富な界面活性剤を生成し、容易に13を群がって生じるスウォーマーでのみ機能する。大腸菌のような界面活性剤非生産者は、寒天、培地組成及び環境2、13、14、21の湿度の選択に対して潔癖性である。群れの状態が確立されると、国境を越えるアッセイ17は、群れが新しい/過酷な条件をナビゲートする能力を尋問するのに有用な方法論です。以下に示すプロトコルは大腸菌に関連していますが、他の種での適用に容易に適応することができます。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Dehydrate</td><td>Agar Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二ナトリウム塩・二水和</td>物 <td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>栄研寒天</td>培地 <td>栄研化学工業株式会社</td><td>E-MJ00</td><td>大腸菌群れに必須</td></tr><tr><td>グルコースD (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>410955000</tr><tr><td>LB (レノックス) ブロス</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン溶液 (0.1%)</td> <td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性 (KH2PO4)</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性カリウム (K2HPO4)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Materials and Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense 顕微鏡イメージングソフトウェア (V. 1.6)</td><td>オリンパス</td><td></td><td>または同等の顕微鏡用ソフトウェア</td></tr><tr><td>電子顕微鏡 Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>つや消し顕微鏡スライド 3x1x1mm</td><td>フィッシャー</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス BX53 顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX53</td><td>直立または逆位相の顕微鏡は、</td></tr><tr><td>ペトリ皿 (直径 100 mm ) を使用できます フィ</td><td>ッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>FB0875712</td><td>軟寒天アッセイ用</td></tr><tr><td>ポリエチレン ネブライザー キャピラリー チューブ (0.58mm x 99mm 3.0m)</td><td>パーキン・エルマー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9908265 ラウンドペトリ皿、2コンパートメント付き</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>国境を越えるアッセイ用</td></tr><tr><td>安全性 皮下注射針 (23G)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジ - 1mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>タスク/ティッシュワイプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>06-666</td><td>または同等の使い捨てティッシュワイプ</td></tr><tr><td>VWRマイクロカバーガラス18x18mm</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10カメラ</td><td>オリンパス</td><td>XM10</td><td>または同等の顕微鏡カメラ</td></tr></tbody></table>

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

運動性は、多くの細菌種の生存と成功に不可欠です。運動性を利用して信号経路を理解し、フラネラ部の機能と組み立てを解明し、運動パターンを調べ、理解するために多くの方法論が存在する。ここでは、これらの方法の3つの組み合わせを示します。柔らかい寒天の運動性は最も古く、運動性障害のある株の機能利得抑制性突然変異を分離するための強力な選択を提供し、運動性は第2の突然変異によって回復する。細胞テザリング技術は、最初に、フラグラーモータの回転性を実証するために使用され、モータ速度および回転方向を切り替える能力に対するシグナルエフェクタの影響を評価するために使用することができる。「国境を越える」アッセイは、水泳細菌が群れとして集団的に移動する準備ができる、より最近のものです。これらのプロトコルは、運動機械の構成要素を特定し、水泳や群れの異なる側面におけるその役割を特徴付けるための体系的かつ強力なアプローチを表しています。それらは他の細菌種の運動性を研究するために容易に合わせることができる。

高レベルのシグナル伝達分子c-di-GMPによって運動性が損なわれる大腸菌株における擬似復帰物質の単離は、我々の研究室34からの最近の研究で詳述された。この株(JP1442)は、ΔyhjHとΔycgRの2つの突然変異を抱えた。YhjHは、大腸菌のc-di-GMPを分解する最も活性なホスホジエステラーゼである。YhjHの不在は、上昇したc-di-GMPレベルと運動性の阻害につながります.YcgRはc-di-GMPエフェクターです。C-di-GMPとの複合体では、YcgRは最初にCCWモータ回転を誘導し、その後モータ速度を低下させるために、フラゲラローターに結合する。細胞テザリングおよびビーズアッセイは、二重変異体において運動行動が正常に戻ることを示したが、軟寒天では運動性は34ではなかった。そこで、プロトコルのステップ1を展開して、二重変異体内の疑似復帰フレアを分離しました(図1C)。WGS(HiSeq 4000プ...

多くの細菌は、彼らの環境をナビゲートし、個々と集団の両方として有利な環境を植民地化するために、フラゲラ駆動の運動性を使用しています。ここでは、水泳や群れの運動に寄与する成分/経路を特定するための選択ツールとして運動性を利用する3つの確立された方法の使用を実証しています。

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

このビデオで紹介されているプロトコルは、世界中のどのラボでも再現できます。これらを組み合わせることで、細菌のべん毛の運動性を特徴付けるための体系的かつ強力なアプローチを表しています。運動性は細菌の播種と生存の重要な側面であり、これら3つの方法は、個人および集団の運動性を分析するための有用で強力なツールです。ここで説明する手法は、自然界で病原性として分類される細菌を含む、さまざまな細菌の研究に容易に適用できます。この手順を初めて試みるときは、群れプレートが正しく準備されていない場合、集団運動を模倣しているが実際には反映していない一貫性のない動作やパターンが観察される可能性があることに注意してください。5ミリリットルのレノックスブロスで30°Cの水平振とうを行いながら、所望の運動性欠損株の培養物を一晩培養し、次いで同じ条件下で新鮮なLBで指数関数的段階まで継代培養する。6マイクロリットルの培養物を柔らかい寒天プレートの中央に接種し、装填したピペットチップを寒天に押し込んで内容物を穏やかに排出します。プレートを摂氏30度でインキュベートし、接種点または運動リングの周辺から発せられる運動性フレアが明らかになるまで。滅菌ワイヤーループを使用して細胞をフレア領域から持ち上げ、LB硬質寒天プレートにストリークして、単一のコロニーを精製します。単離されたサプレッサー変異体が運動性を回復したことを確認するために、目的の株のために柔らかい寒天プレートで培養します。比較のために野生型と開始運動性欠損株を含めます。培養プレートを摂氏30度で8〜10時間インキュベートした後、最も外側のリングの直径を記録して、どの分離株が実質的に運動性を回復したかを確認します。目的の菌株の指数相培養物を調製します。次に、10ミリリットルの細胞を2000倍Gで3分間遠心分離してペレット化し、10ミリリットルのフィルター滅菌運動性緩衝液(MB)に再懸濁します。細胞をMBでさらに2回洗浄し、最終遠心分離後に1ミリリットルのMBに再懸濁します。細胞懸濁液を1ミリリットルのシリンジに移し、端に23ゲージの針を取り付けます。同一のシリンジと針の装置を組み立て、各針の先端にしっかりと覆われた6インチのポリエチレンチューブを介して2つを一緒に取り付けます。10回のパスごとに1分間の一時停止を挟みながら、細胞懸濁液を1つのシリンジから別のシリンジに50回ゆっくりと前後に通過させることにより、べん毛をせん断します。次に、剪断した細胞をGの2000倍で3分間遠心分離し、500マイクロリットルの MB.To に再懸濁して細胞固定チャンバーを準備し、両面テープで分離したガラス顕微鏡スライド上に18×18ミリメートルのカバースリップを積み重ねます。チャンバーの上部に0.01%ポリリジン溶液を加えて洗い流します。下端をタスクワイプに傾けて溶液をチャンバー内に引き込み、室温で10分間放置します。チャンバーを40マイクロリットルのMBで3回洗浄し、チャンバーの上部に40マイクロリットルのせん断細胞懸濁液を追加します。細胞をカバースリップに10分間付着させてから、チャンバーを40マイクロリットルのMBで静かに洗い流し、付着していない細胞を取り除きます。スライドを顕微鏡ステージに移し、位相差顕微鏡と100倍対物レンズを使用して、所定の位置に固定され、1つの軸で回転している細胞の集団をスキャンします。顕微鏡ソフトウェアを開き、細胞に焦点が合っていることを確認し、ビデオ取得を開始して細胞の回転を1分間記録します。ビデオ再生から、1 分あたりの完全な回転数とセルの方向が変わる回数を定量化します。6マイクロリットルの中指数関数的培養物を寒天の上にスポットして接種します。蓋を5〜10分間外し、接種物が寒天表面に乾いたら元に戻します。次に、プレートを摂氏30度で8時間インキュベートします。約30ミリリットルの群寒天をデュアルコンパートメントシャーレの右側のチャンバーに注ぎ、チャンバー間のプラスチック仕切りと同じ高さになるようにしますが、左側にはあふれないようにします。寒天が固まったら、左側のチャンバーに約30ミリリットルの水泳または群れの寒天を満たします。固まる前に、滅菌ピペットチップを使用して寒天を境界線上に静かに駆動し、分割の全長にまたがる高さ1ミリメートルの寒天ブリッジで両側を接続します。プレートを室温で乾燥させます。寒天を注ぐときは、その深さに注意してください。高すぎるとオーバーフローします。低すぎると、2つのチャンバーを橋渡しできなくなります。このプロトコルは、運動性が損なわれた二重変異大腸菌株の疑似復帰フレアを分離するために使用されました。これらのリバータントの1つは、野生型に近い運動性を示しました。二重変異親株と同質遺伝子野生型株を対照として使用した。ビデオキャプチャを解析して、1分あたりの回転数と、モーターが時計回りに回転する時間の割合、つまりタンブルバイアスを計算しました。yhjH変異体は、予想通り、野生型大腸菌と比較して、1分間に数回の回転と低いタンブルバイアスを示しました。二重変異体とそのサプレッサーは、どちらも野生型と同様の運動挙動を示した。境界越えアッセイを使用して、野生型とサプレッサー分離株の群れの能力を比較し、次に境界を越えて移動し、カナマイシンを添加した寒天に群がる能力を比較しました。どちらの株も、同じ接種ポイントからの群れの割合はほぼ同じでしたが、群れから抗生物質チャンバーへのクロスオーバーは、サプレッサーよりも野生型の方が一貫して大きかった。2つの菌株の違いは、カナマイシン濃度が高いほど顕著でした。スウォームアッセイは、セットアップが難しい場合があります。目的の細菌に合わせて描画条件を最適化するだけでなく、培地調製中のラボ条件にも時間を費やす必要がある場合があります。このプロトコルの技術は、一連の鞭毛性細菌に適用されており、未試験の多数の種に適用できる可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、chemoeffectorsの安定した濃度勾配で細菌の走化性を調べるためのマイクロ流体デバイスの開発を説明します。...

安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

出典: Morales-Soto、N. et al.、 細菌表面運動性アッセイの調製、イメージング、および定量化。 J. Vis. 経験。...

細菌の表面運動性を可視化するためのスウォーミングアッセイ

出典: Pioli、R.、 et al.、 シーケンシャルキャピラリティアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング。 J. Vis. 経験。 (2021年)このビデオでは、カーボンフリー懸濁液と制御されたフローを使用して、マイクロ流体トラップで単一の蛍光タグ付き 大腸菌(大腸菌)...

マイクロ流体パターニングと蛍光に基づく単一細胞細菌増殖の追跡

出典: Scheidweiler, D., 他 流体装置と顕微鏡、フローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを超えた多孔質培地内の微生物輸送を研究すること。 J. Vis.

マイクロ流体装置を用いた細菌の運動性評価

群れの運動性は、物理的および環境的要因の影響を受けます。ここでは、スウォームアッセイの調製とデータ収集に一般的に関連する課題を回避するための2段階のプロトコルとガイドラインについて説明します。巨視的なイメージング技術を使用して、現在の分析技術では提供されない群れの行動に関する詳細な情報を取得します。...

準備、イメージング、および細菌表面運動性アッセイの定量化

最近の発見は、細菌のべん毛モーターがさまざまな環境信号を感知し、それに応じて改造することを示唆しています。ここで議論されているビーズアッセイは、環境ストレス要因に対する細胞適応におけるリモデリングの役割を説明するのに役立つと期待されています。...

べん毛モーターの機能の生物物理学的特性評価

細菌細胞のイメージングは、大きな高分子機械の機能を決定する静的および動的プロセスの定義に焦点を当てた新しいシステム生物学アプローチです。ここでは、定量的ライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の統合により、レジオネラ菌型肺炎球体系IV型分泌系のアーキテクチャと機能を研究しています。...

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

この研究は、合成遺伝子回路の確率的挙動の分析と定量化のために 、大腸菌 の単一細胞の生画像化を可能にする顕微鏡法を提示する。...

タイムラプス顕微鏡による 大腸菌 における生物学的ノイズの連続測定

ここでは、特定の糖転移酵素または糖転移酵素を含む領域における アエロモナ...

細菌の運動性における細菌の糖転移酵素の役割を解明するためのヌル変異体の生成

ここでは、呈色反応に基づいて細菌の運動性を検出するためのプロトコルを提示します。この方法の主な利点は、評価が容易で精度が高く、特殊な機器を必要としないことです。...

呈色反応に基づく細菌の運動性の可視化

このプロトコルは、緑膿菌のさまざまなタイプの運動に関与する遺伝的要因を特定するための迅速かつ効率的な方法を提供します。...

緑膿菌における運動表現型を観察するためのハイスループット法

学ぶ 大腸菌の鞭毛駆動運動性を解析する3つの確立技術。ソフトアガー平板、相対比顕微鏡、スウォームアッセイを用いて個体および集団運動を系統的に評価し、病原性細菌の挙動理解に貢献します。

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより、大腸菌におけるフラゲラ駆動運動性の調査

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シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

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シリーズで3つの確立された技術を適用することにより、大腸菌におけるフラゲラ駆動運動性の調査