Name: クラミジア・トラコマティスにおける発生変異体の同定と分離に対する生細胞前方遺伝的アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぶ生細胞前方遺伝学的手法によるChlamydia trachomatisの発生変異体の同定と分離。蛍光プロモーターレポーターとライブセル顕微鏡を用いて発生サイクルをリアルタイムで追跡し、治療戦略の向上に貢献する遺伝子を特定します。

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CIP-1無数のメディアを供給してくれたワシントン州立大学のアンダース・オムズランド博士に感謝します。この作業は、NIH助成金R01AI130072、R21AI135691およびR21AI113617によって支えられた。追加のサポートは、彼らのNIH助成金P20GM104420を通じてアイダホ大学とモデリング複雑な相互作用センターからのスタートアップ資金によって提供されました.

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<li>Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+expression+of+hctB+encoding+a+strain-variant+chlamydial+histone-like+protein+with+DNA-binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity.</a> Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

クラミジア発達サイクルを制御するメカニズムを解剖することは、現在利用可能な遺伝的ツールの限界によって妨げられています。プロモーターレポーターのクラミジアを生細胞自動顕微鏡と組み合わせて、24時間にわたって個々のインクルージョンにおける細胞型の発達を監視できるシステムが構築されました。このシステムは、化学的変異誘発と直接包含分離との組み合わせにより、変化した発達プロファイルを発現するクラミジアを迅速かつクローン的に選択する方法を確立した(図5)。
クラミジア性脳は、細胞内イオン条件およびエネルギー源55,1212を備えた場合、宿主の外で代謝的に活性である。このEBアキセニック代謝を利用して、宿主細胞外の精製EBを変異させる。このプロトコルでは、EB を代謝して EMS を使用して直接変異した。EMS治療はEBの生存率を効果的に低下させ、予測通り可変発生性運動を生み出すEBを...

クラミジア・トラコマティス (Ctr)は、その生存および増殖に不可欠な二ファシズム発達サイクルを経て進行する細胞内病原体である。このサイクルは、2つの発達形態、初等体(EB)とレチク体(RB)で構成されています。EBは、レプリケーション無能であるが、エフェクター誘発性エンドサイトーシス2を介して細胞の侵入を仲介する。ホストに入ると、EB は複製 RB に成熟します。RBは、感染の後続のラウンドを開始するために、EBに戻って変換する前に、複製の複数のラウンドを実行します。
遺伝的ツールの限られた配列は、生化学的研究または代理システムの使用にクラミジア研究のほとんどを制限しています。その結果、遺伝子調節の解明と発達周期の制御は困難であった3,4.4クラミジアの分野でより重要な課題の1つは、クラミジア発生周期の高分解能時間追跡とその調節に関与するタンパク質の同定である。クラミジア発育サイクル中の遺伝子発現は、従来、RNAEq、qPCR、および固定細胞顕微鏡55,66を含む破壊的な「終点」法によって行われてきた。これらの方法は貴重な情報を提供してきましたが、採用されている技術は面倒で、時間的解像度が低い5,66です。
過去10年の間に、Ctrの遺伝子操作は、プラスミド変換と変異生成77、8、98,の方法の導入と共に進んでいる。この研究では、感染の過程で個々のインクルージョンにおけるクラミジアの発達をリアルタイムで監視するプラスミドベースのシステムが開発された。RBとEB細胞型特異的プロモーターレポーターの両方を発現するクラミジア形転換体を作成した。RB特異的レポーターを、蛍光タンパク質クローバーの初期RB遺伝子ユーオ上流のプロモーターを融合させることにより構築した。EUOは、後期EB関連遺伝子10のサブセットを抑制する転写調節因子である。HCtBのプロモーターは、EBヌクレオイド縮合に関与するヒストン様タンパク質をコードし、mKate2(RFP)の上流に直接クローン化し、EB特異的レポーター11を作成した。hctBプロムmKate2/ユーオプロムクローバーのバックボーンはp2TK2SW27でした.hctBおよびeuoプロモーターを、Ctr-L2ゲノムDNAから増幅した。各プロモーター配列は、指定されたクラミジア遺伝子に対する予測転写開始部位の上流の約100塩基対と、各ORFの最初の30ヌクレオチド(10個のアミノ酸)から構成された。蛍光FP変異体を、Ctrコドン最適化遺伝子ブロックとして商業的に得られ、各クラミジア遺伝子およびプロモーターの最初の30ヌクレオチドを有するフレームでクローニングした。incDターミネーターはmKate2の直接下流にクローン化されました。第2プロモーターレポーターは、incDターミネーターの下流に挿入した。p2TK2SW2のアンピシリン耐性遺伝子(bla)をpBam4からaadA遺伝子(スペクチノマイシン耐性)に置換した。これにより、Ctr-L2 7 に変換された最終的な構築 p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-クローバー (図 1A)が生まれました。このRB/EBレポーター株は、生細胞顕微鏡を用いた単一インクルージョン内の発達サイクルの観察を可能にした(図1B,C)。
化学変異誘発と組み合わせてプロモーターレポーター構築物を採用し、Ctr血清膜L2の変異原性集団から発達異常を示した個々のクローンを追跡および分離するためのプロトコルが考案されました。このプロトコルは、個々のクラミジアインクルージョンの直接モニタリング、時間の経過に関する遺伝子発現プロファイルの追跡、変化した発生遺伝子発現パターンを発現するクラミジアクローンの同定、およびクラミジアの個々のインクルージョンからの クラミジア のクローン分離を可能にする。
このプロトコルはクラミジアの発達に関与する遺伝子の同定のために特別に作成されたが、クラミジア遺伝的経路の任意の数を尋問するために容易に適応することができる。

<table><tbody><tr><td>24ウェルポリスチレンプレート</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>分離株の再感染のための細胞培養増殖</td></tr><tr><td>6ウェルガラスボトムプレート</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td>イメージングのための細胞培養増殖</td></tr><tr><td>96ウェルガラスボトムプレート</td><td>Nunc</td><td>165305</td><td>イメージングのための細胞培養増殖</td></tr><tr><td>太字ライン CO2ユニット</td><td>OKO Labs</td><td>CO2ユニット BL</td><td>ステージインキュベーター CO2制御</td></tr><tr><td>太字ライン Tユニット</td><td>OKOラボ</td><td>H301-T-UNIT-BL-PLUS</td><td>ステージインキュベーター 温度制御</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス 毛細管</td><td>サッター</td><td>B1005010</td><td>毛細管</td></tr><tr><td>BrightLine バンドパスエミッションフィルター (514/30nm)</td><td>セムロック</td><td>FF01-514/30-25</td><td>蛍光フィルターキューブ</td></tr><tr><td>ブライトライン バンドパスエミッションフィルター (641/75nm)</td><td>セムロック</td><td>FF02-641/75-25</td><td>蛍光フィルターキューブ</td></tr><tr><td>CellTram Vario</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>マイクロインジェクター</td></tr><tr><td>クラミジア・トラクマチス・セロバー L2</td><td>ATCC</td><td>VR-577</td><td>クラミジア・トラコマチス</td></tr><tr><td>CIP-1 メディア</td><td>社内</td><td>NA</td><td>アキセン培地。IPBに1%FBSを添加、25 &mu;Mアミノ酸、0.5 mM G6P、1.0 mM ATP、0.5 mM DTT、および50 &mu;M GTP、UTP、および CTP。(Omsland、A.2012)社内で作られました。</td></tr><tr><td>Cos-7細胞(ATCC)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td>アフリカ<td>ミドミド腎臓細胞(宿主細胞)</td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>MPバイオメディカル</td><td>194527</td><td>宿主細胞増殖阻害剤</td></tr>エ<tr><td>チルメタンスルホン酸、99%</td><td>Acros Organics</td><td></td><td>AC205260100変異原</td></tr><tr><td>胎児プレックス</td><td>ジェミニバイオプロダクツ</td><td>100-602</td><td>ベース増殖培地用サプリメント</td></tr>フィ<tr><td>ジー/ImageJ</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>NA</td><td>Open sourse 画像解析ソフトウェア. https://imagej.net/Fiji</td></tr><tr><td>Galaxy 170 S CO2 インキュベーター</td><td>Eppendorf</td><td>CO1700100X</td><td>細胞培養インキュベーション</td></tr><tr><td>gblock (蛍光 FP バリアント: Clover および mKate2)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2</td></tr><tr><td>Gentamycin 10mg/ml</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td>成長培地用抗生物質</td></tr><tr><td>HBSS(ハンク平衡塩溶液)</td><td>コーニング</td><td>21-020-CM</td><td>宿主細胞はヘ</td></tr><tr><td>パリンナトリウム</td>をすすぎます <td>アマシャムライフサイエンス</td><td>16920</td><td>は、宿主細胞とEBとの間の初期の静電相互作用を阻害し、逆転させます</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>GEライフサイエンス</td><td>SH30237.01</td>成長<td>培地用pH緩衝液</td></tr><tr><td>InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5179 000.018</td><td>Micromanipulator</td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>https://jupyter.org/</td><td>NA</td><td>介在物痕跡の可視化 https://jupyter.org/</td></tr> <tr><td>ラムダ 10-3</td><td>サッターインストゥルメント</td><td>LB10-3</td><td>フィルターホイールコントローラー</td></tr><tr><td>Oko Touch</td><td>OKO Labs</td><td>Oko Touch</td><td>大胆なラインを制御するインターフェース TとCO2ユニット</td></tr><tr><td>Prior XYステージ</td><td>以前の</td><td>H107</td><td>電動XY顕微鏡ステージ</td></tr><tr><td>PrismR遠心分離機</td><td>Labnet</td><td>C2500-R</td><td>温度制御された微量遠心分離機</td></tr><tr><td>プロブロット ハイブリダイゼーションオーブン</td><td>Labnet</td><td>H1200A</td><td>クラミジア感染用ロッキングインキュベーター</td></tr><tr><td>プロスキャンII</td><td>以前の</td><td>H30V4</td><td>XYZ顕微鏡ステージコントローラー</td></tr><tr><td>清浄機クラス2 バイオセーフティキャビネット</td><td>Labconco</td><td>362804</td><td>細胞培養作業</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (フェノールレッドなし)</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td>イメージング用塩基増殖培地</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (フェノールレッド)</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td>塩基増殖培地</td></tr><tr><td>スコープLED励起LED (470nm,595nm)</td><td>スコープLED</td><td>F140</td><td>励起光</td></tr><tr><td>音波記憶器 モデル500</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-338-550</td><td>ソニケーター、再懸濁クラミジアペレット</td></tr><tr><td>ステージインキュベーター</td><td>OKO Labs</td><td>H301-K-FRAME</td><td>クラスタープレートインキュベーションチャンバー</td></tr><tr><td>スクロース-リン酸-グルタミン酸緩衝液 1X (SPG)</td><td>社内</td><td>NA</td><td>クラミジア保存緩衝液。(10 mM リン酸ナトリウム [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4]、220 mM スクロース、0.50 mM L-グルタミン酸、pH 7.4)</td></tr><tr><td>T-75 フラスコ</td><td>Thermo Scientific</td><td>156499</td><td>細胞培養増殖</td></tr><tr><td>TE 300 倒立顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>16724</td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>THOR LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDD1B</td><td>白色光</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>コーニング</td><td>25-052-CI</td><td>宿主細胞をフラスコから取り除き、プレートに播種</td></tr><tr><td>Zyla sCMOS</td><td>Andor</td><td>ZYLA-5.5-USB3</td><td>イメージングカメラ</td></tr><tr><td>&マイクロ;Manager 2.0gamma</td><td>https://github.com/micro-manager/micro-manager</td><td>NA</td><td>オープンコース自動顕微鏡制御ソフトウェアパッケージ</td></tr></tbody></table>

クラミジア・トラコマティスにおける発生変異体の同定と分離に対する生細胞前方遺伝的アプローチ

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

細胞内細菌病原体 クラミジア・トラコマティス は、形態学的に離散的な2つの発達形態からなる発達周期を受ける。非複製性の初等体(EB)は宿主の感染を開始する。中に入ると、EBはレチク体(RB)に分化する。RBは、感染性のEBフォームに再び区別する前に、複製の複数のラウンドを受けます。このサイクルは、細胞タイプ間の切り替えの失敗が宿主の侵入または複製を妨げるため、クラミジア生存に不可欠である。
クラミジアの細胞内の性質に起因する遺伝的手法の限界は、細胞型の発達に関与する分子機構の同定を妨げている。我々は、生細胞顕微鏡と組み合わせて、リアルタイムで細胞型切替を可視化することを可能にする新しいデュアルプロモーターレポータープラスミドシステムを設計した。細胞型発達の調節に関与する遺伝子を同定するために、生細胞プロモーターレポーターシステムは、二重レポーター株の化学突然変異誘発、クラミジアのイメージングおよび追跡を突然変異体のクローン分離と組み合わせることで、前方遺伝的アプローチの開発に活用された。この前方遺伝的ワークフローは、幅広い遺伝的経路への指示された尋問のために変更することができる柔軟なツールです。

私たちのプロモーターレポータークラミジア株の直接EMS突然変異誘発は、感染性の〜75%の減少をもたらした。記載された生細胞イメージングプロトコルを用いて、〜600個のインクルージョンを24時間にわたって画像化および追跡した。各インクルージョンにおける両方のレポーターの蛍光発現キネティクスを、カスタムPythonノートブックスクリプトを使用して可視化しました。分離のための変異原性クラミジア候補を同定するために2つの視覚化アプローチが実装された。第1の方法論(ステップ3.3.8)は、インタラクティブな散乱プロットで個々のクラミジア分離物からのユーオおよびhctBプロモーターの半最大発現までの時間を視覚化する(図2)。模倣された散乱雲の外に落ちた場合、インクルージョンは隔離のために特定されました。候補のクローンは、視覚的にコントロール クラウドの外に落ちた選択されました。各クローンの検証は、その後行った。クローンA3-6-67およびB3-8-58は、ユープロモーターから半最大発現までの短い時間とhctB<...

このプロトコルは、クラ ミジア・トラコマティスの発生変異体を同定および単離するための指向的な前方遺伝的アプローチにおける蛍光プロモーター−レポーター、生細胞顕微鏡、および個々の包含抽出を利用する。

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

このプロトコルは、クラミジアの生成と分離に、発達プロファイルを変更するための独自のツールを提供し、最終的には発達サイクルを調節する遺伝子の同定を可能にする。この方法の主な利点は、クラミジア細胞型の発達をリアルタイムで追跡する能力と、クラミジアを分離する能力、および開発プログラムを変更する能力である。クラミジア・トラコマティス記者を変異体化するために、約3倍の10分の1から7番目の初等体を含むクラミジアストックを見た。関心のあるレポータープラズマとペレットで変換され、思考は遠心分離によってストックされています。10秒間10%の電力で超音波処理を使用し、100マイクロリテラボの100マイクロリットルで素体を再中断し、得られた初体の懸濁液を2つの1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管の間で均等に分割します。50マイクロリットルの新しく調製したEMS代謝溶液を、突然変異誘発のためのクラミジアアリコートに加え、50マイクロリットルの空水代謝バッファーを、ストック突然変異誘発のためだけにクラミジアアリコートに加え、両方のサンプルを室温で20分間インキュベートします。EMSは、取り扱い時に手袋を着用する既知の発がん性物質であり、廃棄前に24時間、すべてのEMS汚染された機器および媒体を1つのモル水酸化ナトリウムに浸します。卸売文化を設定するために、変異体化クラミジア・トラコメーターのイメージングと分離のために。種子6ウェルガラス底板は、6倍の10〜5番目のコスト7細胞で、1ウェルあたり完全な媒体の2ミリリットルで、5番目に10から5番目の24ウェルポリスチレンプレートを播種すると、1ミリリットルの完全な培地1ミリリットルの完全な培地で7細胞を生じる。宿主細胞培養物に感染するために、変異体化されたフラミジア・トラコマティスが感染することを否定し、約6倍の10〜5番目の、変異体化された素体のガラス底板の5つのウェル。井戸あたり氷冷HBSSの1.5ミリリットルで。残りの井戸に感染し、1ウェルあたり1.5ミリリットルの氷冷HBSSで5番目の模擬変異原ゲン化素体に約20回、摂氏37度で15分間インキュベーションした後、37°CのHBSSで感染細胞を37度のヘパリン1ミリグラムで洗浄し、その直後にHBSrineの1ミリグラムで感染した。ヘパリンで細胞を再び洗い、HBSSだけで2つのリンスをすぐに洗い、すべてのヘパリンが取り除かれるようにします。最後の洗浄後、37°Cのイメージング培地を4ミリリットルずつ加え、各ウェルに加えます。そして、37°C脱イオン水でインターウェルスペースを埋め、10時間細胞培養インキュベーターにプレートを置きます。インキュベーションの最後に、顕微鏡ステージインキュベーターを5%の二酸化炭素、摂氏37度に設定します。そして、ステージインキュベーターに6つのウェルガラス底板を置きます。イメージングソフトウェアでは、高コンテンツスクリーニングプラグインを使用して6つのウェルプレートテンプレートを選択し、自動イメージングのフォーカスを設定し、GFBチャンネルで4%の強度で250ミリ秒、RFPチャンネルの密度で18%の密度に露出を設定するために、12の視野で構成されるイメージング位置リストを生成します。そこで、イメージングサイクルでは、30分間隔で24時間、発達サイクルのキネティックスをキャプチャし、InFocusスライスの両側で終わるフォーカス範囲を持つ複数のZスタックを含むように画像キャプチャを設定し、イメージング用の相対Zを選択し、取得ウィンドウ内の複数のスライスを選択し、画像スタックファイルオプションを使用します。をクリックして、TIFF スタック ファイルとして保存するイメージを設定します。インクルージョントラックを識別するには、開発プロファイルを変更して、EMS画面のインポートセルを使用して、トラック統計のスポットからインクルージョントラックデータをインポートし、CSVファイルをPandaのデータフレームにインポートします。計算セルを使用して、各トラックの早期および後期の両方のレポーターの最大式を持つ時間を計算し、半最大プロット セルでボケプロットパッケージを使用して、hctB prom の式に対して半分の最大表現に対する時間 2 の最大表現を視覚化します。ボケインタラクティブトラックIDエクスプローラを使用して、模擬処理された散乱雲の外に落ちる突然変異体母集団からの包含を識別する。アニメーション血球グラフにおけるプロモーター発現動態の変化を動的に可視化するために、hctBプロムに対するEOUプロムの発現強度をグラフ化した。次に、アクルージョンロケータセルで、アニメーション化されたグラフからスナップショットを視覚化します。発達ニュートンを分離するために、対象物の包含から、識別された包含物を有するウェル上に視野を配置し、位相差差干渉対照白色光チャネル光源に針を渡し、針を視覚化し、595ナノメートル、励起チャネルを使用し、抽出用の素体を可視化する。微細な調整やマイクロマニピュレータを使用して、キャピラリー針を封入まで操縦し、針で包接を破裂させ、マイクロインジェクターを使用して毛細血管針先端に素体を引き込む。抽出された素体を、毛細血管から単一のウェルに出し、24ウェルポリスチレンプレートで調製し、次の抽出のために新しい毛細血管針を使用する。各単離物の十分な膨張の後、感染した単層を1ミリリットルマイクロピップチップで破壊し、培地細胞の破片を移動させ、クラミジアを新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に放出した。遠心分離によって収穫したクラミジアをペレットにし、75マイクロリットルの氷冷、スクロースリン酸グルタミン酸緩衝液中のペレットを再懸濁し、その後、3つの新しい1.5ミリリットルスクリューキャップマイクロ遠心チューブの間で包込懸濁液を均等に分割し、マイナス80でチューブを貯蔵して摂氏を読み取る。変異原ISEDのイメージング用の宿主細胞培養をセットアップするために、1.6倍の10倍の7細胞を有する96ウェルガラス底板を播種し、1ウェル当たり100マイクロリットルの完全培地で培養した。宿主細胞単層が氷上で採取した変異クローンおよび野生型クラミジア株を融解し、1つの分離株につき1列を使用して、各変異体の2倍の連続希釈を行った後、各変異体の2倍の連続希釈を行う。感染感染は、野生型クラミジアを用いた残りのカラムを、約0.5の感染の多重度で、培養後10時間培養器にプレートを入れ、1未満の感染の多重度に対応する変異体分離物当たり3つのウェルを選択し、画像化位置リストを生成する。井戸ごとに2つの視野から成ります。この散布図では、個々のクラミジア分離株からのEOUおよびhctBプロモーターの最大発現の半分までの時間は、クローンA3667およびB3858が、EOUプロモーターからより長い4hctBを有する最大発現を有する短い時間を産生するとして単離のために選出された。変化した動態を有するインクルージョンは、可視化、2つのプロモーターの動的遺伝子発現、およびアニメーショングラフのスナップショットを使用して、目的の包含の位置を同定することに基づいて同定することができる。これらの代表的な可視化では、合計24個のインクルージョンが単離のために同定され、そのうち10個は微分動態を示し、3つの異なる表現型カテゴリーで再検査した際に、8つの分離株が感染後約24時間でEOUプロモーター発現を減少させた。A3667クローンによって示されるように、B3858は単離し、また、感染後約24時間で減少したEOUプロモーター発現を示した。しかし、hctBプロモーター発現の全体的な増加は、B3662単離に対し、EOUプロモーターからの蛍光の増加レベルを発現し、その後、両方のプロモーターで発現の突然の喪失が続いた。変異型B3662の生きた細胞顕微鏡写真の分析は、宿主細胞のライシスが起こったことを明らかにし、この変異体に感染した細胞において、野生型感染細胞よりはるかに早く起こった。細胞型開発不足クラミジア回復は、これらの細胞が宿主を再感染することができないので、不可能であり得る。ゲノムワイド関連研究は、単離後に、発達遺伝子を同定するために、統計的相関を介して、代替プロモーターレポーターの組み込みと共に使用することができる。この方法は、多数の遺伝的経路の調査、遺伝的回路機構、および他の細胞内病原体の解剖に拡張することができる。

live-cell-forward-genetic-approach-to-identify-isolate-developmental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、化学変異誘発および全ゲノムシーケンシングに基づいてクラミジアの遺伝的分析を実行する方法を説明します。さらに、感染細胞内のDNA交換のためのシステムは、遺伝子マッピングのために使用することができることについて説明する。この方法は、変換システムおよび分子遺伝学的ツールを欠く微生物システムに広く適用することができる。...

フォワード遺伝的アプローチで<em&gt;クラミジアトラコマチス</em

クラミジアを含む細胞液胞(封入体)を照らすための生細胞蛍光タンパク質ベースの方法が説明されています。この戦略により、サンプル中のクラミジア感染性を迅速かつ自動的に測定でき、インクルージョン増殖ダイナミクスを定量的に調査するために使用できます。...

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました<em&gt;クラミジア</em生細胞内&gt;液胞の成長ダイナミクス

ストレス耐性は、長寿のための顕著な特徴の一つであり、遺伝的に支配されることが知られています。ここでは、寿命試験のためのマウスモデルを開発したとのES細胞におけるストレス耐性を付与する突然変異をスクリーニングするために公平な高スループットの方法を開発しました。...

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温度感受性(ts)致死変異体は、本質的な機能を特定し分析するための貴重なツールです。ここでは、ts致死変異体をハイスループットで生成および分類する方法について説明します。...

ハイスループットは、ロボットに温度に敏感な致死変異体の単離を支援します<em&gt;クラミドモナス</em

ここでは、CRISPR Cas9 ribonucleoproteins と相同性依存修理テンプレートを使用して線虫のゲノム エンジニア...

迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

細菌病原体は、重要な生物学的プロセスを標的とする宿主にタンパク質を分泌する。細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路を同定することは、分子病因に対処する鍵となる。ここで、毒性細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路を解明するために改変酵母サプレッサーおよび毒性スクリーンを用いる方法について説明する。...

酵母毒性およびサプレッサースクリーンを用いた細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路の同定

ここで説明する、フラミジア・トラコマティスにおける標的化されたマーカーレス遺伝子欠失の方法であり、フロキサセット対立遺伝子交換変異誘発、FLAEMを用いた。...

クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失

フォワード遺伝学はどのように分子レベルで解明するための強力な方法です...

分離するために遺伝学的スクリーニングトキソプラズマホストセル出口変異体

ウイルス誘発性遺伝子サイレンシングは、植物の非宿主抵抗性に関与する遺伝子を同定するための便利なツールです。私たちは、非宿主病原体に感受性遺伝子沈黙植物を識別するのにGFPuvのを表現する細菌の病原体の使用方法を示しています。このアプローチは速く、容易であり、大規模なスクリーニングと同様のプロトコルは、様々な他の植物、微生物の相互作用を研究に適用することができる容易にする。...

非宿主抵抗性に関与する遺伝子の同定のためのVIGS媒介フォワード遺伝スクリーニング

フォワード遺伝学は、識別するためのマクロファージを使用した画面<em&gt;トキソプラズマ</emIFN-γ依存性細胞自律イミュニティへの抵抗のための重要な&gt;遺伝子

学ぶ生細胞前方遺伝学的手法によるChlamydia trachomatisの発生変異体の同定と分離。蛍光プロモーターレポーターとライブセル顕微鏡を用いて発生サイクルをリアルタイムで追跡し、治療戦略の向上に貢献する遺伝子を特定します。

クラミジア・トラコマティスにおける発生変異体の同定と分離に対する生細胞前方遺伝的アプローチ

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