ヒト腎臓組織における局所転写論を明らかにするレーザー微小解剖の応用
2020年6月9日
糸球体、近頭尿細管、太い上昇肢、集結管およびインタースティジウムを含むヒト腎臓のサブセグメントのレーザーマイクロディシセクションのプロトコルについて述べている。次いで、RNAを得られたコンパートメントから単離し、RNAシーケンシングを行い、各サブセグメント内のトランスクリプトームシグネチャの変化を決定する。
レーザーマイクロダイセクションは、腎臓組織サンプル内の空間的に定義された領域のトランスクリプトーム分析を可能にします。これにより、疾患による変化が起こった後でも、関心のある構造を特定するユニークな機会が得られます。この方法論の主な利点は、シングルセルRNAシーケンシングなどの他のオミクス技術との相補性です。
優れた組織経済性を実現し、低発現の転写産物の検出も可能にします。組織サンプルを取得した後、摂氏マイナス20度に設定されたクライオスタットを使用して試料を12マイクロメートルの厚さに切断し、スライドアダプターを使用して試料を専用のレーザーマイクロダイセクションスライドに固定します。凍結切片作成から10日以内に、PBS中の89.2マイクロリットルのRNaseフリー10%BSAを、4マイクロリットルのFITCファロイジン、1.5マイクロリットルのDAPI、2マイクロリットルのAlexa Fluor 546に直接結合した目的の抗体、および3.3マイクロリットルのRNase阻害剤と混合します。
スライドをマイナス20°Cの100%アセトンで1分間洗浄し、スライドを湿度チャンバーに入れます。スライドの上部を新しいRNaseフリーPBSで1回の洗浄につき30秒間2回洗浄し、続いてRNaseフリーPBSで10%BSAで30秒洗浄を2回行います。最後の洗浄後、調製した抗体溶液で室温で5分間サンプルを処理し、その後、RNaseフリーPBS中の10%BSAでさらに2回洗浄します。
2回目の洗浄後、スライドを組織培養フードで5分間風乾してから、スライドをレーザーマイクロダイセクションカッティングプラットフォームにロードします。PCR作業に適した、RNA単離キットからの50マイクロリットルの抽出バッファーを含む、オートクレーブ処理された500マイクロ遠心分離用コレクションチューブをデバイスに取り付けます。ロード後、サンプル内の関心領域を染色、形態、および位置によって特定します。
免疫蛍光法を使用して、少なくとも 500, 000 マイクロメートル四方の関心のあるセグメントの輪郭を描きます。次に、レーザーマイクロダイセクションを開始して、40を超えるレーザー出力を使用して領域を切除します。レーザーマイクロダイセクションプロセスが完了したら、マイクロ遠心回収チューブにキャップをし、チューブを激しくフリックして、内容物がキャップからチューブの底に移動することを確認します。
遠心分離後、チューブを摂氏42度の水浴で30分間インキュベートしてから、チューブを再度遠心分離します。次に、上清をマイナス80°Cの貯蔵庫から新しい500マイクロリットルのチューブに移します。腎臓の尿細管サブセグメントの同定は、細胞の形態や構造的ランドマークに加えて、ユニークな尿細管マーカーの抗体染色によって達成されます。
形態学的組織の特徴と組み合わせた蛍光標識および画像構造の空間的配置により、腎臓のサブセグメントを高い信頼性で視覚化することが容易になります。この代表的なダウンストリームシーケンシング解析では、最小解剖面積インプットを満たす成功率が90%を超え、遺伝子検出に利用できる総mRNA量が多くなりました。この分析では、サンプルの100%が少なくとも10, 000遺伝子の最小検出閾値を満たしました。
レーザーマイクロダイセクション後、既知のマーカーの遺伝子発現の濃縮分析を他のコンパートメントのものと比較できます。この解析では、レーザーマイクロダイセクション地域トランスクリプトミクスにより、各サブセグメントに1つのマーカーを同定し、対応するネフロンサブセグメントの特異的な免疫組織化学的染色ももたらしました。レーザーマイクロダイセクションは、解剖対象の構造を正確に特定するために、ユーザーの専門知識に大きく依存していることに注意することが重要です。
この技術により、特定の局所的な遺伝子発現シグネチャの研究が可能になり、疾患の進行に関与する可能性のある経路や健康な組織の生物学を評価するために使用できます。
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概要
本研究では、糸球体や近位尿細管を含むヒト腎組織内の特定のサブセグメントをレーザーマイクロダイセクションで採取するプロトコルを提示します。これらのコンパートメントから単離したRNAを用いることで、異なる腎構造に関連する遺伝子発現パターンの変化を明らかにするトランスクリプトーム解析が可能になります。
研究の主要構成要素
研究分野
- トランスクリプトーム解析
- 腎臓生物学
- 疾患進行の調査
背景
- 腎臓のサブセグメントを研究することの重要性
- 疾患後の空間的に定義された構造を解析する際の課題
- 他のオミクス技術との相補性
使用した手法
- レーザーマイクロダイセクション
- ヒト腎臓組織サンプル
- RNA抽出およびシーケンシング
主要な結果
- 解剖およびRNA回収における高い成功率
- 腎臓サブセグメントにおける遺伝子発現マーカーの同定
- 疾患進行に関連する潜在的な経路の提示
結論
- 本プロトコルでは、腎臓における局所的な遺伝子発現を研究するための効果的な手法を解説します。
- 得られた知見は、腎生物学および潜在的な疾患メカニズムの理解に寄与します。
よくある質問
業界における重要性
レーザーマイクロダイセクションを用いることで、ヒト腎臓組織の空間的に解像されたトランスクリプトームプロファイリングが可能になります。これにより、細胞分散ベースの手法では解剖学的コンテキストが失われるという、探索生物学における重大な課題が解決されます。このアプローチは、遺伝子発現シグネチャーを特定のネフロン亜分節に関連付けることでターゲットバリデーションを支援し、腎疾患モデルにおけるメカニズム的なリスク低減を促進します。本手法は、初期の探索ワークフローにおいて、パスウェイ解析やポートフォリオの優先順位付けに対する予測的な信頼性を提供します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：遺伝子発現を解剖学的に定義された腎臓のコンパートメントにマッピングすることで、治療仮説の検証を可能にします。
- 運用上の価値：組織のコンテキストを維持した空間的に固定されたトランスクリプトーム・シグネチャーを通じて、生物学的なリスク低減をサポートします。
- 予測的価値：領域マーカーの発現と機能的なサブセグメントのアイデンティティを相関させることで、ターゲットへの信頼性を高めます。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： マイクロダイセクション（微小解剖）領域から高完全性のRNAを単離することにより、後続のオミクスワークフローに向けた検証済み生物学的システムを調製します。
- 運用の価値： 検体の適切性とダイセクション成功率を評価するQCパラメータを通じて、アッセイの標準化と再現性を確保します。
- 拡張性： スクリーニングキャンペーンにおいて、定量的に空間分解されたトランスクリプトーム出力を提供することで、信頼性の高い化合物評価を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：ヒト腎臓のサブセグメントを用いた疾患関連システムモデリングを通じて、基礎研究の知見を前臨床検証へと結びつけます。
- バイオマーカーの整合性：組織内で検出可能なコンパートメント特異的な遺伝子発現プロファイルを特定することで、トランスレーショナルなバイオマーカー開発を支援します。
- リスク調整済み進展：解剖学的に正確な疾患影響領域におけるパスウェイ活性を明らかにすることで、前臨床段階の意思決定に情報を供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
レーザーマイクロダイセクションは、仮説検証からリード同定に至る発見の連続体の中に位置づけられ、イメージングとオミクスを橋渡しする空間的に分解された分子プロファイリングを可能にします。
- 探索生物学： 遺伝子発現を腎臓組織の構造的ランドマークに関連付けることで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 高い解剖成功率（>90%）と、シーケンシングアプリケーションに十分なRNA収量を実現し、アッセイへの適用を可能にします。
- 分析： 定量的な従属変数測定（遺伝子検出閾値 ≥10,000 genes）を提供し、条件間の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 解離ベースの手法で失われる空間的コンテキストを維持することで、前臨床研究の連続性を向上させます。
- 企業内での再利用： 抗体マーカーを置換することで、異なる組織型においても再利用可能な機能として動作し、プラットフォーム全体への導入を支援します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：腎臓ターゲットのバリデーションにおけるメカニズム的な曖昧さを排除することで、予測の信頼性を向上させる。
- 運用的価値：定義されたワークフローパラメータとQCチェックポイントを通じて、標準化と再現性を高める。
- 戦略的価値：サブセグメント固有の生物学に基づいたリスク調整後の優先順位付けを可能にし、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：空間的に解像されたエビデンスを用いて腎臓ターゲットの早期リスク低減を行うことで、資本効率をサポートする。
実施上の検討事項
- 免疫蛍光染色および腎臓サブセグメントの形態学的同定に関する専門知識が必要です。
- レーザーマイクロダイセクションプラットフォームおよび低投入量サンプルに対応したRNA抽出キットに依存します。
- 染色プロトコル、切除しきい値、およびQC指標について、チーム間での標準化が必要です。
- 異なるモデルへ適応させるには、標的組織における抗体マーカーおよび構造的指標の検証が必要です。
- 実用上の制限として、領域同定におけるユーザー依存の精度や、処理中のRNA完全性の維持が挙げられます。
