Name: ヒト腎臓組織における局所転写論を明らかにするレーザー微小解剖の応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: 学ぶレーザー微小解剖によるヒト腎臓組織の局所転写解析法。糸球体や近位尿細管など特定領域からRNAを単離し、疾患関連遺伝子発現変化を明らかにする技術を習得できます。

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一般的な: 著者らは、腎臓精密医療プロジェクト(www.kpmp.org)の研究者の優雅な支援とアドバイスに感謝したいと考えています。
資金調達: この作業のサポートは、NIH/NIDDK K08DK107864(M.T.E.)によって提供されました。NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M E., P.C.D.);R01DK099345 (T.A.S.)。この原稿で報告された研究は、国立糖尿病・消化器病研究所と腎臓病研究所(NIDDK)腎臓精密医療プロジェクト(KPMP)(kpMP)(www.kpmp.org)によって、賞番号U2CDK114886の下で支援されました。
データと材料の可用性: データは遺伝子発現オムニバス(GEO #保留中)にアーカイブされます。

この研究は、インディアナ大学の機関審査委員会(IRB)によって使用が承認されました。
注:最適な切断温度(OCT)化合物に保存され、-80°Cで保存されている腎臓腎切開組織(XおよびY次元の両方で最大2 cm)でこのプロトコルを使用してください。 RNA汚染を制限する方法ですべての作業を実行し、きれいな使い捨て手袋とフェイスマスクを使用してください。すべての表面の清潔さを確認します。このプロトコルが最適化された装置は、パルスUVレーザーを搭載したレーザーマイクロ解剖システムです。
1. クライオセクション
<ol><li>1.2 μm LMD PPS膜(ポリ(p-フェニレンスルフィド)は、凍結切断の直前にUV光(組織培養層流れフード)に30分間スライドします。最適な組織付着のために、スライドを室温で保管してください。</li>
	<li>クライオスタットを-20°Cに冷却します。 作業面を清掃し、新しい切断ブレードを取り付けます。</li>
	<li>小さなスライドボックス(RNase表面除染液で洗浄)をクライオスタットチャンバーの中に置き、切りたてのティッシュでスライドを保存します。</li>
	<li>組織ホルダーにOCTで標本を付着し、チャンバー温度に達するために数分間平衡化し、OCTブロックとホルダーの間の接着を強化します。熱抽出器を使用してプロセスを支援します。</li>
	<li>試料を12μmの厚さに切り、スライドアダプタを使用して専用のLMDスライドに貼り付けます。各スライドは、スライドごとに1つの腎切除セクションを保持するか、スライドごとに最大2つの腎臓生検セクションを保持します。スライドを -80 °C に乾燥剤カートリッジを使用して保管し、密閉したビニール袋の中に保管して、余分な水分がスライドボックス内に蓄積するのを防ぎます。</li>
	<li>各スライドに、標本ID、日付、スライド番号をラベル付けします。</li>
	<li>凍結切断の最初の日から10日以内に標本とスライドを使用してください。</li>
</ol>2. レーザーマイクロディシス
<ol><li>染色の直前に、以下を加えることによってRNaseフリーPBSで10%BSAの抗体ミックス(Ab-Mix)を調製する:FITC-ファロイジンの4 μL、 DAPIの1.5 μL、アレクサフルオール546に直接結合したタム・ホースフォールタンパク質(THP)抗体の2μL、RNase阻害剤の3.3μL、PBS中の10%BSAの89.2 μL(100 μLの体積に達する)。 注:代替抗体はTHP抗体の代わりに使用されてもよい。例えば、2μLのメガリン/LRP2抗体は、アレクサフルオール568に直接結合して、近位細管を標識するために使用することができる。Ab-Mixには、LRP2またはTHP抗体が含まれています(それぞれ、近位細管または太い上昇肢のいずれかを視覚化します)。他の抗体は、ユーザのニーズに応じて検証され得る。</li>
	<li>スライドを氷冷(-20°C)で100%アセトンで1分間洗い、湿度室に移動します。</li>
	<li>RNaseフリーPBSでスライドの上部を30sリピートで洗います。</li>
	<li>RNaseフリーPBSで10%BSAでスライドの上部を30sの繰り返し洗います。</li>
	<li>5分間、Ab-Mixを塗布します。</li>
	<li>RNaseフリーPBSで10%BSAでスライドの上部を30sの繰り返し洗います。</li>
	<li>スライドを5分間空気乾燥し、レーザーマイクロ解剖切断プラットフォームに積み込みます。</li>
	<li>PCR作業に適した回収チューブ(オートクレーブ0.5 mLマイクロ遠心分離チューブ)を取り付け、RNA分離キットから50 μLの抽出バッファーを含みます。</li>
	<li>LMD を続行します。各 LMD セッションは、2 時間以内に完了します。<ol>
<li>顕微鏡カメラを使用して、実行されたプロトコルのアーカイブ目的、トレーニング、品質評価の解剖を検証するために、LMD前後の免疫蛍光画像を収集します。0.5 ~ 1 ng の RNA を得るためには、最低 500,000 μm2 領域が必要です。これは、多くの場合、関心のあるすべてのサブセグメントに十分な量の材料を得るために、最大8 x12 μm厚いセクションを使用する必要があります。</li>
		<li>染色、形態、位置によって関心領域を特定し、40を超えるレーザーパワーを使用してそれらを切除します。 注: 解剖基準は次のとおりです。近位細管はFITC-ファロイジンおよびLRP2標識によって定義される。太い昇順の四肢はTHPラベリングによって定義されます。収集ダクトは核形態(DAPI)および他の染色の欠如によって定義される。糸球体はFITC-ファロイジンおよび形態によって定義される。インタースティジウムは、染色された管状の間の面積として定義される。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2つの12μm断面をLMDスライドに貼り付け、その断面全体を抽出バッファに解剖することで、バルク断面式シグネチャを得ます。</li>
	<li>LMDプロセスが完了したら、収集マイクロ遠心チューブを閉じ、それを激しくフリックして、コンテンツがキャップからチューブの底に移動したことを確認します</li>
	<li>30 sの3,000 x g でチューブを遠心分離します。</li>
	<li>42°Cの水浴で30分間チューブをインキュベートします。</li>
	<li>2分間3,000 x g でチューブを遠心分離します。</li>
	<li>上清を新しい0.5 mLチューブに移し、-80°Cで保管してください。</li>
</ol>3. RNAの単離
注: この RNA 絶縁プロトコルでは、市販の RNA 分離キットからプロトコルを適合させました。製造元のプロトコルは、プロジェクトに設定された品質管理要件を満たすように変更されています。
<ol><li>各RNA精製カラム(PC)に250μLのコンディショルドバッファー(CB)を加え、室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>遠心分離機 16,000 x gで 1 分間すべての PC .</li>
	<li>50 μLの70%エタノール(キットに付属)を組織サンプルでチューブに加えます。上下にピペットを入れ、サンプルをよく混ぜます。渦を出さないで下ろしてください。遠心分離機を使用しないでください。</li>
	<li>100 x g で 2 分間調整された PC と遠心分離機に混合物を移し、16,000 x g で 30 s の遠心分離を迅速に行います (流れを除去するため)。特定のサブセグメントに対して組織サンプルを持つチューブが 1 つ以上ある場合は、この手順を繰り返します。</li>
	<li>100 μL のウォッシュバッファ 1 (WB1) を PC に追加し、遠心分離機を 8,000 x gで 1 分間追加します。</li>
	<li>各サンプルごとに40 μLのDNaseを用意します(RDDバッファの35 μLに5μLのDNaseを追加します)。その後、PCの膜に直接40μLの混合物を加え、室温で15分間インキュベートします。</li>
	<li>PCの膜にWB1の40 μLを加え、8,000 x gで15 sの遠心分離機を加 えます。</li>
	<li>PCの膜に100 μLのウォッシュバッファ2(WB2)を加え、遠心分離機を8,000 x gで1分間加 えます。</li>
	<li>PCの膜にWB2の100 μLを加えて、16,000 x gで2分間遠心分離し、16,000 x gで1分間の遠心分離の直後に加 えます。</li>
	<li>PCを新しい0.5 mLチューブに移します。</li>
	<li>膜に溶出バッファー(EB)の12 μLを加え、室温で7分間インキュベートします。したがって、全ての分化された解剖組織サンプルの最終容積は、サブセグメント当たり12μLである。</li>
	<li>遠心分離 1000 x g で 1 分間、16,000 x gで 2 分間のサンプルを.</li>
	<li>バイオアナライザ分析用に2μLを新しいチューブに移します(凍結融解イベントを防止するため)。</li>
	<li>すべてのチューブを-80 °Cに保管して、さらなる処理の準備が整います。</li>
</ol>4. RNAシーケンシング
<ol><li>商業用バイオアナライザーと少量のRNA測定専用チップを使用して、シーケンシング用の各サンプルを評価します。</li>
	<li>ライブラリの準備とシーケンスの前に次の品質管理(QC)パラメータが必要です:バルクの場合は4 ngより大きく、各サブセグメントの1 ng以上のRNAの量。200ヌクレオチド(DV200)より長い転写物のパーセントは、LMD標本(最適>75%)に対して25%を超える必要があります。</li>
	<li>少量の分解されたRNAを対象とした商用cDNAライブラリ調製キットでライブラリの準備を行います。サプリメントに記載されている市販キットの場合、25% の最小 DV200 と断片化を必要としないオプション 2 を使用することをお勧めします。シーケンス テクノロジによっては、30% 7 など、より高い最小 DV200 しきい値が必要になる場合があります。</li>
	<li>cDNAアダプターとインデックスを追加します。</li>
	<li>磁気ビーズ技術を使用して、RNAseqライブラリを浄化します。</li>
	<li>RNAseqライブラリ増幅工程の前に市販のrRNA除去キットを使用してリボソームcDNAを枯渇させます。</li>
	<li>2 ng/μL cDNAライブラリ濃度で磁気ビーズ技術を使用して、最終的なRNAseqライブラリを精製します。</li>
	<li>バルク用に 3,000 万読み取り/サンプル、サブセグメントセクションの場合は 1 億読み取り/サンプルを使用して、商業シーケンシング システムで 75 bp ペアエンドの RNA シーケンシングを実行します。</li>
	<li>バッチ効果の制御を可能にするために、シーケンシングの実行ごとにリファレンスRNA(25 μg)を使用してください。リファレンスRNAの初期濃度は1μg/μLで、シーケンシングで使用される最終濃度は25 ng/μLです。</li>
	<li>FastQC アプリケーションを利用してデータ解析を実行し、シーケンシング、遺伝子間およびミトコンドリア読み取りの品質を評価し、遺伝子に起因する読み取りを決定します。</li>
	<li>アライメントには統合ゲノミクスビューア(IGV)を使用し、トランスクリプト発現測定にはedgeR/rbamtoolsを使用します。</li>
	<li>100,000 読み取りより少ないサンプルを削除します。位数は、ユーザー定義のしきい値で低く発現した遺伝子を除外した後、データセット内の生の読み取りを正規化します。</li>
	<li>式を、他のすべてのサブセグメントおよび log2 変換の平均に対する対象サブセグメントの比率として定量化します。同じ遺伝子の相対発現は、サブセグメントとサンプル間で比較され得る。しかし、遺伝子とRNA種間の分解の可能性により、2つの異なる遺伝子間の相対的な発現を比較することは理想的ではありません。</li>
	<li>各ネフロンサブセグメントに固有のメーカーのセットの遺伝子発現を比較するために濃縮分析を行い、参照RNAサンプルはバッチ間で比較されます。R 値が 0.9 を超える平均式の標準偏差の 1 以内のバッチ効果は許容可能と見なされます。バッチ効果スコアを高くする場合は、追加の正規化が必要です。受け入れられたバッチ効果から逸脱した実行には、フラグを設定できます。Q30 は、シーケンス実行ごとに 90%以上にする必要があります。</li>
</ol>

<ol><li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+Barrett%27s+esophagus%3A+laser+capture+versus+whole+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li>
<li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li>
<li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IF-LCM%3A+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li>
<li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li>
<li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li>
<li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).</li>
<li>Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016).</li>
<li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832(2019).</li>
<li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components%3A+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li>
<li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Aided+Laser+Dissection%3A+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+Informatics%22%5BJournal%5D)">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45(2018).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

LMDベースのトランスクリプトミクスは、組織内の特定の領域に遺伝子発現を固定する有用な技術である。腎臓におけるこの技術とその潜在的な応用の基礎は、前に説明された8.しかしながら、最適化、近代化、蛍光法解解の合理化は、特に下流RNAシーケンシングのための高精度解離を目的とすることは、あまりユビキタスではない。この方法論は組織内に空間的に接地されているため、特に疾患状態において、組織構造における新規または過小評価されたマーカーを明らかにする可能性がある。実際、細胞の多くの一般的なマーカーは疾患によって変化する可能性があるため、空間的文脈のない同一性裁定のために細胞RNA発現マーカーのみに依存することは、疾患状態では困難である可能性がある。したがって、空間的に固定されたLMDアプローチは、単一細胞および単一核RNAシーケンシングのような他の多くの転写技術を補完し、その遺伝子発現プロファイル9によって主に細胞を定義する地上真理プラットフォームを提供する可能性がある。さらに、LMDが提供する遺伝子発現の深さ(サンプルあたり最大20,000個の遺伝子)は...

組織標本の研究における技術の進歩は、様々な臓器における健康と病気の状態の理解を改善しました。このような進歩は、病理学が限られた領域または特定の細胞タイプで始まることができるが、臓器全体に重要な意味を持つことを強調している。したがって、現在の個別化医療の時代において、細胞レベルと地域レベルの両方で生物学を理解することが重要であり、世界的に1.これは、病理学的ストレスを開始および/または応答する様々な特殊な細胞および構造で構成される腎臓において特に当てはまる。様々なタイプのヒト腎臓病の病因はまだよく分かっていない。ヒト腎臓における特定の管状のセグメント、構造、または間質の領域における遺伝子発現の変化を研究する方法論を生み出すと、疾患の病因を知らせることができる領域固有の変化を発見する能力が高まる。
ヒト腎臓生検検は限られた貴重な資源です。したがって、腎臓組織のトランスクリプトミクスを問い合わせた技術は、組織を減態するために最適化されるべきである。細胞および地域レベルでのトランスクリプトミクスを研究するために利用可能な方法は、単一細胞RNAシーケンシング(scRNaseq)、単一核RNaseq(snRNaseq)、その場空間ハイブリダイゼーション、およびレーザーマイクロダイスセクション(LMD)を含む。後者は、下流RNAシーケンシングおよび分析2、3、4、5のために、組織切片内の対象となる領域または構造を正確に分離するために適しています。LMDは、解剖中に蛍光ベースのイメージングを使用して検証されたマーカーに基づいて、特定の細胞タイプまたは構造の同定に頼るために採用することができる。
レーザー顕微鏡解剖支援地域転写術のユニークな特徴には、1)細胞および構造の空間的文脈の保全が含まれ、細胞が組織学的ではなく発現によって同定される単一細胞技術を補完する。抗体マーカーは発現シグネチャを定義するため、2)この技術は他のイメージング技術に情報を提供し、知らされる。3)マーカーが疾患で変化した場合でも構造を識別する能力;4)約20,000遺伝子における低発現転写物の検出。5)顕著な組織経済。この技術は、十分なRNA取得に必要なコアの厚さが100μm未満の腎臓生検に対してスケーラブルであり、大規模なリポジトリまたは学術センター6で一般的に利用可能なアーカイブされた凍結組織の使用を可能にする。
その後の研究では、ヒト腎臓組織で使用するための新しい急速蛍光染色プロトコルで最適化された、地域およびバルクトランスクリプトミクス技術を詳細に記述します。このアプローチは、凝集した管間質の表現とは対照的に、インタースティジウムおよびネフロンサブセグメントに対して別々の発現データを提供するため、従来の LMD 探索を改善します。厳格かつ再現性を確保するために実施される品質保証と管理対策が含まれています。このプロトコルは、細胞および関心のある領域の可視化を可能にし、これらの孤立した領域からのRNAの満足のいく獲得をもたらし、下流RNAシーケンシングを可能にする。

<table><tbody><tr><td>アセトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-1L</td><td></td></tr><tr><td>アンプレ ビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>バイオアナライザー</td><td>アジレント</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>サーモフィッシャー</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>乾燥剤カートリッジ</td><td>Bel-Art</td><td>F42046-0000</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>RDDバッファーは、パッケージに含まれています</td></tr><tr><td>レーザーマイクロダイセクション顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>LMD6500</td><td></td></tr><tr><td>メガリン/LRP2抗体</td><td>Abcam</td><td>ab76969</td><td>Alexa Fluor 568</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td>に直接結合 <td>サーモフィッシャー</td><td>AB-0350</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カメラ</td><td>ライカ</td><td>DFC700T</td><td></td></tr><tr><td>PBS (RNAse Free)</td><td>VWR</td><td>K812-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td><td>ThermoFisher</td><td>O7466</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>PPSメンブレンスライド</td><td>Leica</td><td>11505268</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &micro;g</td><td>タカラクロンテック</td><td>636690</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 真核生物 トータルRNAピコチップ</td><td>アジレント</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNAse アウェイ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>7000</td><td></td></tr><tr><td>RNAse阻害剤</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>シーケンサー (HiSeq または NovaSeq)</td><td>イルミナ</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer ストランドトータル RNAseq ピコ インプット v2</td><td>タカラクロンテック</td><td></td><td></td>634411</tr><tr><td>Tamm-Horsfall タンパク質抗体</td><td>R&D Systems</td><td>AF5144</td><td>Alexa Fluor 546</td></tr><tr><td>Tissue-Tek&reg; O.C.T. Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr>に直接結合</tbody></table>

ヒト腎臓組織における局所転写論を明らかにするレーザー微小解剖の応用

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

ヒト腎臓組織の遺伝子発現解析は、恒常性および疾患病態生理を理解する重要なツールである。この技術の解像度と深さを高め、組織内の細胞のレベルにそれを拡張することが必要です。単一核および単一細胞RNAシーケンシングの使用は広く普及しているが、組織解離から得られた細胞の発現シグネチャは空間的文脈を維持しない。特定の蛍光マーカーに基づくレーザーマイクロディション(LMD)は、既知の局在化を伴う特定の構造および対象細胞群の単離を可能にし、それによって腎臓組織における空間的に固定されたトランスクリプトーミックシグネチャの取得を可能にする。迅速な蛍光ベースの染色に導かれたLMD方法論を最適化し、ヒト腎臓内の5つの異なるコンパートメントを分離し、その後のRNAシーケンシングを貴重なヒト腎臓組織標本から行います。また、収集した検体の妥当性の評価を可能にする品質管理パラメータも提示します。この原稿で概説されているワークフローは、高い信頼を持ってサブセグメントの転写シグネチャを分離するこのアプローチの実現可能性を示しています。ここで提示される方法論的アプローチは、関連する抗体マーカーの置換を伴う他の組織タイプにも適用され得る。

サンプル
9つの基準腎切除術(インディアナ大学で得られた3つの標本と腎臓精密医療プロジェクトを通じて得られた6つの標本)からのデータを提示し、腎臓腎球体のセグメントおよび間質領域を分離する急速な蛍光染色法を利用する。このプロセスで利用されたセクションは、死亡した腎臓ドナーまたは影響を受けない腫瘍腎摘出から得られた。これらのサンプルは、連続したセクションから採取したH&amp;E染色で可視化された疾患の病理学的証拠を有していなかった(図1A)。
レーザーマイクロディスセクション品質管理
腎臓の管状サブセグメントの同定は、独自の管状マーカーの抗体染色、ならびに形態および構造的ランドマークによって達成される。 図1B-C は、代表的な腎摘出術からの管状サブセグ...

糸球体、近頭尿細管、太い上昇肢、集結管およびインタースティジウムを含むヒト腎臓のサブセグメントのレーザーマイクロディシセクションのプロトコルについて述べている。次いで、RNAを得られたコンパートメントから単離し、RNAシーケンシングを行い、各サブセグメント内のトランスクリプトームシグネチャの変化を決定する。

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

レーザーマイクロダイセクションは、腎臓組織サンプル内の空間的に定義された領域のトランスクリプトーム分析を可能にします。これにより、疾患による変化が起こった後でも、関心のある構造を特定するユニークな機会が得られます。この方法論の主な利点は、シングルセルRNAシーケンシングなどの他のオミクス技術との相補性です。優れた組織経済性を実現し、低発現の転写産物の検出も可能にします。組織サンプルを取得した後、摂氏マイナス20度に設定されたクライオスタットを使用して試料を12マイクロメートルの厚さに切断し、スライドアダプターを使用して試料を専用のレーザーマイクロダイセクションスライドに固定します。凍結切片作成から10日以内に、PBS中の89.2マイクロリットルのRNaseフリー10%BSAを、4マイクロリットルのFITCファロイジン、1.5マイクロリットルのDAPI、2マイクロリットルのAlexa Fluor 546に直接結合した目的の抗体、および3.3マイクロリットルのRNase阻害剤と混合します。スライドをマイナス20°Cの100%アセトンで1分間洗浄し、スライドを湿度チャンバーに入れます。スライドの上部を新しいRNaseフリーPBSで1回の洗浄につき30秒間2回洗浄し、続いてRNaseフリーPBSで10%BSAで30秒洗浄を2回行います。最後の洗浄後、調製した抗体溶液で室温で5分間サンプルを処理し、その後、RNaseフリーPBS中の10%BSAでさらに2回洗浄します。2回目の洗浄後、スライドを組織培養フードで5分間風乾してから、スライドをレーザーマイクロダイセクションカッティングプラットフォームにロードします。PCR作業に適した、RNA単離キットからの50マイクロリットルの抽出バッファーを含む、オートクレーブ処理された500マイクロ遠心分離用コレクションチューブをデバイスに取り付けます。ロード後、サンプル内の関心領域を染色、形態、および位置によって特定します。免疫蛍光法を使用して、少なくとも 500, 000 マイクロメートル四方の関心のあるセグメントの輪郭を描きます。次に、レーザーマイクロダイセクションを開始して、40を超えるレーザー出力を使用して領域を切除します。レーザーマイクロダイセクションプロセスが完了したら、マイクロ遠心回収チューブにキャップをし、チューブを激しくフリックして、内容物がキャップからチューブの底に移動することを確認します。遠心分離後、チューブを摂氏42度の水浴で30分間インキュベートしてから、チューブを再度遠心分離します。次に、上清をマイナス80°Cの貯蔵庫から新しい500マイクロリットルのチューブに移します。腎臓の尿細管サブセグメントの同定は、細胞の形態や構造的ランドマークに加えて、ユニークな尿細管マーカーの抗体染色によって達成されます。形態学的組織の特徴と組み合わせた蛍光標識および画像構造の空間的配置により、腎臓のサブセグメントを高い信頼性で視覚化することが容易になります。この代表的なダウンストリームシーケンシング解析では、最小解剖面積インプットを満たす成功率が90%を超え、遺伝子検出に利用できる総mRNA量が多くなりました。この分析では、サンプルの100%が少なくとも10, 000遺伝子の最小検出閾値を満たしました。レーザーマイクロダイセクション後、既知のマーカーの遺伝子発現の濃縮分析を他のコンパートメントのものと比較できます。この解析では、レーザーマイクロダイセクション地域トランスクリプトミクスにより、各サブセグメントに1つのマーカーを同定し、対応するネフロンサブセグメントの特異的な免疫組織化学的染色ももたらしました。レーザーマイクロダイセクションは、解剖対象の構造を正確に特定するために、ユーザーの専門知識に大きく依存していることに注意することが重要です。この技術により、特定の局所的な遺伝子発現シグネチャの研究が可能になり、疾患の進行に関与する可能性のある経路や健康な組織の生物学を評価するために使用できます。

application-laser-microdissection-to-uncover-regional-transcriptomics

Research

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Biology

生物学

レーザーマイクロダイセクションは、ローカライズされたRNAi実験に供ショウジョウバエの翅のディスクの特定のコンパートメントでの遺伝子発現プロファイリングの解析に適用した...

から細胞のサブセットの遺伝子発現プロファイリングへの応用レーザーマイクロダイセクションショウジョウバエウィングディスク

マウス脳の特定の領域におけるRNA発現プロファイリングには、正確で再現性のある組織採取戦略が必要です。ここでは、冠状断による脳切断と組織コーラーを用いたマイクロダイセクションの両方を併用するプロトコルについて説明します。得られたサンプルから抽出した全RNAの収量と品質により、本手法の有用性が確認されています。...

トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

この記事では、ホルマリン固定腎臓切片にマイクロRNA発現の比色検出のために最適化されたin situハイブリダイゼーションプロトコルについて説明します。...

マイクロRNA<em&gt;その場で</em&gt;ホルマリン固定腎臓組織のためのハイブリダイゼーション

このプロトコルの目標は、下流のRNA分析のために不均一な前立腺組織から純粋な細胞型の集団を分離する効果的な方法として、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用することです。...

RNA分析のためのヒト前立腺上皮のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

ここでは、転写プロファイリングのための特定の植物細胞タイプのレーザー支援マイクロダイセクションのためのプロトコルを提示します。このプロトコルはさまざまな種や細胞タイプに適していますが、焦点は、アブラナ科Boechera属の有性生殖およびアポミティック生殖に重要な雌性生殖細胞の非常にアクセスしにくい細胞にあります。...

個々の細胞タイプの転写プロファイリングのためのツールと​​してのレーザ支援顕微解剖（LAM）

このプロトコルは、マウス胚の新鮮な凍結切片から軟骨および骨を分離するためのレーザー捕捉マイクロセクションを記述する。軟骨および骨はクレシルバイオレット染色によって急速に視覚化され、正確に集めることができるので、トランスクリプト工学的分析のための高品質のRNAを得ることができます。...

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

細胞死の間に放出される細胞外DNA(ecDNA)は炎症を誘発し、炎症に寄与する。傷害部位におけるecDNAの測定は、標的器官における治療の有効性を決定することができる。このプロトコルは、機械学習ツールを使用して腎臓組織のecDNAの測定を自動化する方法を説明します。...

糸球体腎炎における細胞外DNAの半定量化のための教師付き機械学習

ここでは、髄質腎細胞タイプの表現を改善し、酵素組織解離による遺伝子発現アーティファクトを回避する凍結マウス腎臓から高品質の核を単離するためのプロトコルを提示します。...

単核RNAシーケンシングのための成体マウス腎臓からの核分離

レーザーマイクロダイセクションを使用してRNAシーケンシングのために個々の線虫組織を単離するプロトコルが記載されている。このプロトコルは、種固有の遺伝子ツールキットを必要とせず、単一組織サンプルのレベルで異なる種間で遺伝子発現プロファイルを比較することを可能にする。...

種にとらわれない単一組織アプリケーションのためのレーザーマイクロダイセクション

ここでは、腎臓全体、単離された皮質尿細管、および髄質プロテオームのプロテオミクス解析のための詳細なプロトコールを紹介します。また、この研究では、糖尿病マウスモデルと非糖尿病マウスの局所プロテオームも比較しています。...

マウスにおける腎障害の糖尿病発症機序における全腎臓・髄質・皮質尿細管の比較プロテオミクス解析

この記事では、ヒト腎動脈枝の単離と機能評価のための段階的なプロトコルを紹介し、医薬品開発のための前臨床研究を促進します。...

ヒト腎動脈枝のマルチレベル顕微解剖と機能構造プロファイリング

学ぶレーザー微小解剖によるヒト腎臓組織の局所転写解析法。糸球体や近位尿細管など特定領域からRNAを単離し、疾患関連遺伝子発現変化を明らかにする技術を習得できます。

ヒト腎臓組織における局所転写論を明らかにするレーザー微小解剖の応用

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