Name: 高力子型E型肝炎ウイルス株を生産するための細胞培養モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学ぶ高力価E型肝炎ウイルス株の細胞培養モデル構築法。プラスミドDNAの線状化と電気穿孔を用いて、非被膜型・被膜型両方の感染性ウイルス粒子を産生し、薬剤設計やワクチン開発の基盤となる研究手法を習得できます。

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私たちは、E型肝炎ウイルスp6クローンのためにスザンヌ・エマーソンに感謝しています。HEV特異的ウサギの超免疫血清は、ドイツのフリードリヒ・ローフラー研究所であるライナー・ウルリッヒによって親切に提供されました。また、ルール大学ボーフムの分子医学ウイルス科のメンバーの皆様のご支援とご意見に感謝いたします。図1~7はBioRender.comで生成した。

著者らは開示するものは何もない。

プラスミド調製から始めて、DNAの収量は150 ng/μLを超えて、同じプラスミド株からの複数の線形化を行うことができるようにし、重要なゲノム配列の細菌誘発性変異生成のリスクを最小限に抑える必要があります。さらに、ゲル電気泳動による完全なプラスミド線形化のための制限消化を確認することが重要である(図8b)。線形化されたプラスミドDNAの欠如は、転環増幅を誘発し、インビトロ転写の効率が低下する。さらに、RNAの完全性を確認して、サンプル内のRNasesの存在量を評価する必要があります(図8c)。その後、標的細胞のエレクトロポレーションを考慮する必要があります。注意すべきは、HepG2細胞の調製を開始する前に、すべてが手元にあり、長い待ち時間を避けることを避けて十分に準備されていることを確認してください。特に、細胞およびRNAのエレクトロポレーションまで細胞およびRNAの短時間の貯蔵を保証する。エレクトロポレーション中に細胞の加熱を回避するには、事前に氷上の緩衝液を冷却することが不可欠です。パルスの持続時間は 20~25 ...

E型肝炎は、世界的に有病率が高まっている、かなり過小評価されている病気です。約2,000万人の感染により、年間70,000人以上の死者が出ます。基礎となるE型肝炎ウイルス(HEV)は最近再割り当てされ、現在はゲネラオルソヘペウイルスおよびピシヘペウイルスを含むヘペビリダ科内に分類されている。様々な起源のHEVは、ヒト、豚、ウサギ、ラット、鳥類および他の哺乳動物からの分離物を含む種オルソヘペウイルスA-D内で分類される2。現在、陽性指向の一本鎖RNAウイルスの8種類の遺伝子型(GT)が同定されている2.彼らは彼らの順序の同一性、伝達および地理的分布の経路で異なるが、彼らのゲノム構造は非常に保存されている。より具体的には、7.2 kbp HEVゲノムは、3つの主要なオープンリーディングフレーム(ORF1-3)に分けられる。ORF1は、宿主細胞内での複製を成功させるために必要なすべての酵素をコードするが、ORF2はキャプシドタンパク質をコードし、ORF3タンパク質は感染性粒子の組み立ておよび放出に必要な機能的イオンチャネルとして動作する3。一旦基礎または座端腔HEVに放出されると、両方に存在し、ウイルスがそれぞれ,4、5に由来するかどうかに応じて、準エンベロープおよび非エンベロープ/裸の種である。4
GT1とGT2は主に発展途上国で見られるが、便経口経路を介して人間6に感染しているだけで、 GT3、GT4、GT7は主に先進国7,18,19,11、7は、例えば、豚8、ラット9、鶏10、11、鹿12、マングース13、コウモリ14、ウサギ15、マングース13、コウモリ14、ウサギ715、16、,16イノ11シシ17、動物園17,7、20、212の証拠を提供する様々な種で発生20,21します22。不十分な衛生状態23および汚染された食品12、24、25、2624,25,26に加えて、輸血および臓器移植による伝染も可能12である27、28。27,HEVは、肝硬変および肝不全29の一般的な原因であり、特に既存の肝疾患を有する患者、免疫不全個体(遺伝子型3、4および7)および妊婦(遺伝子型1)においてである。注意すべきは、造血,性疾患30、31、32、神経障害33,31および腎障害3234のような肝外症状もある。34
現在までに、オフラベル薬リバビリン(RBV)は、多くの感染患者35、36,36のための選択の治療です。しかし、治療不全および臨床長期的な結果の悪い症例が報告されている。治療の失敗は、ウイルス性突然変異誘発に関連しており、慢性感染患者37、38、3938,39におけるウイルス不均一性の増加。37それどころか、最近のヨーロッパの回顧的な多施設研究では、ポリメラーゼ突然変異をRBV治療失敗40に関連付けることができなかった。臨床観察およびインビトロ実験において、インターフェロン41、42、43、ソフォスブビル41,42,434444、45、45亜鉛塩46およびシルヴェストロール47、48,48も抗ウイルス効果を示している。それにもかかわらず、HEVのライフサイクルとその病因に関する知識の欠如によって妨げられ、特定のHEV治療が見つかっていない。したがって、ウイルス学的研究と新しい抗ウイルス薬の開発のための堅牢な細胞培養システムが緊急に必要とされる49.
残念ながら、他の肝炎ウイルスと同様に、HEVは従来の細胞株で伝播することは困難であり、通常は非常にゆっくりと進行し、低いウイルス負荷につながる。それにもかかわらず、いくつかのグループは、細胞株サブクローン50の生成またはメディアサプリメント51の調整によってウイルス負荷を高めることができた。最近cDNAクローン52の生成と一次患者の適応は、細胞培養55におけるHEV伝播をさらに改善し、53、5454を通過させることによって分離する。53このプロトコルでは、セル培養用のゲノムを用いて、Kernow−C1株(p6_WT)54と、複製増強突然変異(p6_G1634Rと呼ばれる)37を収容する変異株とを用いた。Kernow-C1はHEV細胞培養で最も頻繁に使用される株であり、高いウイルス負荷を産生することができる。ウイルスRNAコピー数を評価することにより、HEV複製をインビトロで監視することができる。それにもかかわらず、これらの技術は、産生される感染性粒子の数の評価を可能にしない。そこで、フォーカス形成ユニット(FFU/mL)を決定するための免疫蛍光染色を確立しました。
ここに記載した方法56は、初等細胞および哺乳動物細胞株を含む多様な起源から様々な細胞型に感染することができる全長感染性ウイルス粒子を産生するために使用することができる。これはHEV感染とトロピズムの重要な側面を解読するための基本的な前提条件です。通常限られた患者の隔離で接種する必要はない。プラスミドからの感染性HEV粒子の生成は無限の源であり、このプロトコルは同等に効率的である。さらに、このシステムは、in vivo同定されたゲノム改変の研究とHEV複製および適合性への影響を可能にする逆遺伝学に使用することができる。この技術は多くの制限を克服し、薬物開発、突然変異誘発研究、および制限または侵入因子などのウイルス宿主相互作用の評価への道を歩むことができる。

<table><tbody><tr><td>0.45 以上m mesh</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td>収穫 細胞外ウイルス</td></tr><tr><td>4 % Histofix</td><td>CarlRoth</td><td>P087.4</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>CarlRoth</td><td>6755.1</td><td>コラーゲン ワーキング ソリューション</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910024</td><td>ウイルス 収穫</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td>変換の選択細菌</td></tr><tr><td>ATP</td><td>ロシュ</td><td>11140965001</td><td>in vitro転写およびエレクトロポレーション</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>BioRender</td><td></td><td>Figure Generation</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>Collagen R solution 0.4 % sterile</td><td>Serva</td><td>47256.01</td><td>コラーゲンワーキングソリューション</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Roche</td><td>11140922001</td><td>in vitro転写</td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Biorad</td><td>165-2088</td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D21490</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco</td><td>41965-039</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>in vitro転写</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Promega</td><td>含まれるもの P2077<</td><td>em>in vitro 転写</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Roth</td><td>3054.3</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>Escherichia coli JM109</td><td>Promega</td><td>L2005</td><td>形質転換</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>gibco</td><td>10270106</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>GenePulser Xcell エレクトロポレーションシステム</td><td>BioRad</td><td>1652660</td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>ギブコ</td><td>15710049</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Roche</td><td>11140957001</td><td>in vitro transcription</td></tr><tr><td>H2O</td><td>Braun</td><td>184238001</td><td>Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-03</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>馬血清</td><td>gibco</td><td>16050122</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Roth</td><td>P749.1</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>KCL</td><td>Roth</td><td>6781.3</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.2</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>gibco</td><td>25030081</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>L-グルタチオン還元</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251-5G</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>MEM</td><td>gibco</td><td>31095-029</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>MEM NEAA (100回;)</td><td>gibco</td><td>11140-035</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189.2</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>微量UV-Vis分光光度計 NanoDrop One</td><td>サーモフィッシャー</td><td>ND-ONE-W</td><td>DNA/RNA濃度</td></tr><tr><td>MluI酵素</td><td>NEB</td><td>R0198L</td><td>線形化</td></tr><tr><td>NEBバッファー</td><td>R0198L</td><td>線形化</td>に含まれる<td></td></tr><tr><td>NucleoSpin プラスミドキット</td><td>Macherey &ナーゲル</td><td>740588.250</td><td>プラスミド調製</td></tr><tr><td>NucleoSpin RNAクリーンアップキット</td><td>Macherey&Nagel</td><td>740948.250</td><td>RNA purification</td></tr><tr><td>PBS</td><td>gibco</td><td>70011051</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Plasmid encoding-full-length HEV genome (p6_G1634R)</td><td>Todt et.al</td><td></td><td>Virus production</td></tr><tr><td>Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)</td><td>Shukla et al.</td><td>GenBank加盟番号JQ679013</td><td>ウイルス産生</td></tr><tr><td>一次抗体 1E6</td><td>LS-Bio</td><td>C67675</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>一次抗体 8282</td><td></td><td></td><td>Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>DNA extraction</td></tr><tr><td>Ribo m7G Cap Analog</td><td>Promega</td><td>P1711</td><td>in vitro転写</td></tr><tr><td>RNase カール</td><td>ロス</td><td>A998.3</td><td>RNA精製</td></tr><tr><td>RNasin(RNase阻害剤)</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td>in vitro transcription</td></tr><tr><td>二次抗体 ロバ抗マウス 488</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A-21202</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>二次抗体ヤギ抗ウサギ 488</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A-11008</td><td>免疫蛍光</td></tr>染色 <tr><td>ピルバットナトリウム</td><td>gibco</td><td>11360070</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>T7 RNA ポリメラーゼ</td><td>プロメガ</td><td>P2077</td><td>in vitro 転写</td></tr> 転写<tr><td>バッファー</td><td>P2077</td><td>in vitro 転写</td>に含まれる<td>プロメガ</td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>カールロス</td><td>3051.3</td><td>免疫蛍光</td></tr>法 <tr><td>Trypsin-EDTA (0.5 %)</td><td>gibco</td><td>15400054</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>超低IgG</td><td>gibco</td><td>1921005PJ</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>UTP</td><td>Roche</td><td></td> <td>11140949001in vitro転写</td></tr></tbody></table>

高力子型e型肝炎ウイルス株を生産するための細胞培養モデル

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

E型肝炎ウイルスは、世界的に蔓延する肝硬変および肝不全の主な原因である。一本鎖RNAウイルスは、主に輸血、不十分な衛生状態および汚染された食品によって伝染する。現在までにオフラベル薬リバビリン(RBV)は、多くの患者のための選択の治療です。それにもかかわらず、特定のHEV治療は依然として同定されない。これまでのところ、HEVのライフサイクルと病因に関する知識は、効率的なHEV細胞培養システムの欠如のために著しく妨げられてきた。また、ウイルスの病態を含むウイルスのライフサイクルの研究には、堅牢な細胞培養システムが不可欠です。ここで説明する方法では、非エンベロープHEVの最大3 x 106焦点形成ユニット/mL(FFU/mL)および5 x 104 FFU/mLのウイルス力素を生成することができます。これらの粒子を用いて、原発細胞やヒト、ならびに動物細胞系を含む多様な起源の多様な細胞に感染させることができる。プラスミドからの感染性HEV粒子の生成は無限の源を引き起こし、このプロトコルは非常に効率的です。

このプロトコルでは、高力剤感染性HEVccの生産について説明する。第1のステップは、プラスミドDNA(pBluescript_SK_HEVp654およびpBluescript_SK_HEVp6-G1634R37、図8a)を分離し、次いで制限消化によって線形化され、インビトロ転写のために精製される(図1)。ゲル電気泳動を用いて、非消化プラスミドDNAと消化されたプラスミド-DNAを比較することで、線形化が成功することが確認できます。サイズシフトに加えて、直線状の形態を表すDNAバンドは1つだけ表示する必要があります。線形形状の上下の他の2つのバンドが、それぞれニッキングされた円とスーパーコイル状を表す2つのバンドが完全に減少すると、線形化は完了する(図8b)。精製されたDNAの収率は150 ng/μLを超える必要があります。これらの特性が真実である場合にのみ、線形化さ...

ここで説明するE型肝炎ウイルス(HEV)の高ウイルス力価株を生成し、肝細胞を効率的に感染させる方法について説明する。提示された方法により、非エンベロープのウイルス粒子と同様に、様々な細胞株を接種するために収穫および使用することができる。

高力子型E型肝炎ウイルス株を生産するための細胞培養モデル

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

E型肝炎ウイルスの研究は、効率的な細胞培養システムの欠如によって妨げられてきた。私たちの技術は、これらの制限を克服し、薬物設計とワクチン開発への道を開きます。このプロトコルにより、非エンベロープおよびエンベロープHEV粒子の両方の感染性高力素ウイルスを産生し、様々な細胞の感染を促進することができる。このプロトコルを実行するには、BSA-2施設へのアクセスと基本的な細胞培養技術の経験が必要です。プラスミドDNAを直線化するには、テンプレートDNAの10マイクログラムを10マイクロリットルのバッファーと2マイクロコッカス・ルテウス制限酵素の2マイクロリットルと混合し、最終的な体積を水で100マイクロリットルに調整します。その後、摂氏37度で1時間溶液をインキュベートし、標準的なプロトコルに従ってアガロースゲル電気泳動によるプラスミドの直線化を確認します。プラスミドDNAの単離および直線化後、ゲル電気泳動による非消化プラスミドDNAと消化されたプラスミドDNAを比較することにより、線形化の成功を検証することができます。精製された全長型E型肝炎ウイルスDNAのインビトロ転写については、線形化DNAテンプレートの2マイクログラムを適切な試薬と混合し、核フリー水を使用して溶液の最終体積を100マイクロリットルにします。完全に混合した後、37°Cで2時間の溶液をインキュベートします。2時間後、チューブにT7 RNAポリメラーゼを2マイクロリットル追加します。その後、反応を混合し、さらに2時間摂氏37度でチューブをインキュベートします。インキュベーションの最後に、7.5マイクロリットルのDNAを徹底的に混合して初期DNAテンプレートを消化し、37°Cの30分間インキュベートします。抽出後、標準的なプロトコルに従ってアガロースゲル電気泳動によるRNAの完全性と収率を注意深く確認してください。低RNA帯の場合、ぼやけた塗りつぶしではなく、異なるバンドが観察されるべきである。一部の手順では、迅速な実行と徹底的な準備が必要です。また、RNAの完全性と細胞の生存率にも特に注意してください。細胞培養由来のE型肝炎ウイルス産生のためにヒト肝癌細胞を調製するために、完全なDMEMの20ミリリットルで細胞を15センチメートルのコラーゲンコーティングされた培養皿に播種し、90%の合流に達するまで摂氏37度でインキュベートする。培養終了時に、細胞を10ミリリットルのPBSで洗浄してから、37°Cで0.05%トリプシン-EDTAの3ミリリットルの細胞培養プレートから取り外します。完全なDMEMの10ミリリットルで剥離した細胞を再懸濁し、カウントのための50ミリリットルの円錐管に細胞を移す。新しい50ミリリットルチューブに6つの細胞に5回10を移し、洗浄ごとに35ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。2回目の洗浄後、上清を取り除かずに細胞を氷の上に置きます。標的細胞のエレクトロポレーションの場合、2つのミリモルATPと5ミリモルグルタチオンで384マイクロリットルのサイトミックスを補い、その後さらに使用されるまで氷の上に保存する。上清を400マイクロリットルの溶液全体に慎重に交換してください。精製されたウイルスゲノムRNAを5マイクログラム加え、細胞懸濁液を4ミリメートルキュベットに移し、975マイクロファラドでエレクトロポレーションし、20ミリ秒で270ボルトを送ります。エレクトロポレーション後、パスツールピペットを使用して、完全なDMEMの11ミリリットルに細胞をできるだけ早く移し、10ミリリットルの電気ポレート細胞をコラーゲンでコーティングした10センチメートルの培養皿に入れます。次に、300マイクロリットルの培地中の5番目の細胞に1.3倍の10を加え、コラーゲンコーティングされた24マイクロタイタープレートの1つのウェルのカバースリップに均等に加え、プレートと皿を細胞培養インキュベーターに24時間置きます。翌日、皿の上清を新鮮なDMEMの10ミリリットルに置き換え、さらに6日間培養インキュベーターに皿を戻します。5~7日目には、細胞密度に応じて、対象タンパク質を発現する細胞数を細胞総数に正規化して発現させるトランスフェクション制御の免疫蛍光染色を行う。成功したエレクトロポレーションは、トランスフェクションコントロールの免疫蛍光染色によって監視することができます。トランスフェクション効率は、40%Aを超える必要がある複製欠損変異体は、染色の特異性を確認する陰性制御として機能することができる。細胞外細胞培養由来のE型肝炎ウイルス粒子を採取するには、6日目に0.45マイクロリットルメッシュを通して上澄みを濾過し、細胞の破片を除去し、採取した細胞外細胞培養由来のE型肝炎ウイルスを摂氏4度で保存します。細胞内細胞培養由来のE型肝炎ウイルス粒子採取の場合、PBSで細胞を洗浄し、摂氏37度で0.05%トリプシン-EDTAの1.5ミリリットルで細胞を取り外す。細胞が剥離したら、DMEMの8.5ミリリットルで反応を停止し、遠心分離のために50ミリリットルのチューブに細胞懸濁液を移す。個々の2ミリリットル反応チューブにエレクトロポレーションごとに1.6ミリリットルのDMEM完全培地を加え、800マイクロリットルの培地を使用して細胞を再懸濁し、細胞をチューブに移します。液体窒素で細胞を凍結し、その後、高速遠心分離する前に氷上の細胞を10,000倍gで10分間解凍します。その後、マイナス80°Cの貯蔵のための細胞の破片ペレットを乱すことなく、新しいチューブに上澄み物を転送します。新たに産生された細胞内および細胞外E型肝炎ウイルスストックの抗体を評価するために、コラーゲンコーティングされた96ウェルマイクロタイタープレートの60センターウェルに1ウェル当たりMEMの100マイクロリットル当たり4細胞に10倍の10を播種し、最も外側の井戸を1ウェルあたり100マイクロリットルのPBSで満たす。摂氏37度で24時間後、細胞の最初の行に50マイクロリットルの細胞外ウイルス粒子上清を加える。完全に混合した後、前の細胞から次の行に50マイクロリットルの上澄み物を重複して細胞の最後の行まで移すことによって、ウェル当たり1〜3濃度でウェル内容物を6回連続希釈する。細胞内細胞培養由来のE型肝炎ウイルス粒子に感染するには、細胞の最上列に25マイクロリットルの細胞内ウイルス粒子上清を加え、25マイクロリットルの希釈を伴う1~5倍の比率で細胞を連続希釈する前に十分に混合する。次に、原稿のプロトコルに従って免疫蛍光染色する前に、細胞培養インキュベーターにプレートを7日間入れる。インキュベーションおよび免疫染色に続いて、プレートは免疫蛍光顕微鏡を用いて分析することができる。細胞内および細胞外粒子の最終用の抗体を免疫染色した後、示されたとおりに適切な式を用いて計算することができる。連続希釈による細胞培養由来Eウイルス粒子による標的細胞感染後、1ミリリットル当たり10~5~3倍の10~3倍の焦点形成単位の間の力価は、非包絡細胞培養由来のE型肝炎ウイルス粒子に感染した細胞培養物から期待できる。細胞外培養由来E型肝炎ウイルス粒子を包絡させた培養物では、10~2番目の10倍から10倍の間の力素がミリリットル当たり4番目の焦点形成単位に期待されている。また、ゲノムコピーと非エンベロープ細胞内感染性ウイルス粒子との比は、細胞外細胞由来E型肝炎ウイルス粒子感染培養物に対して観察される比よりも一般的に低く、非エンベロープE型肝炎ウイルス種のより高い特異的感染性を示唆している。ウイルス粒子産生および標的細胞感染は完全なウイルスのライフサイクルを必要とし、ウイルスと宿主の相互作用に関する新しい洞察を提供することができる。このプロトコルは、複製の運動を行うか、または感染アッセイに使用することができる粒子を生成するために変更することができる。私たちの研究のほとんどは現在、エンベロープと非エンベロープHEVの両方で感染性粒子に依存しています。そして、私たちの技術を使用した記事は現在公開されています。

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