キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術
2020年5月24日
このプロトコルは、CRISPR/Cas9遺伝子編集ツールで動作するように最適化された Culex quinquefasciatus 胚のマイクロインジェクション手順について説明します。この技術は、この研究対象疾患ベクターの遺伝的技術を構築するために使用できる部位特異的、遺伝性、生殖細胞系列突然変異を効率的に生成することができる。
胚マイクロインジェクション技術は、数多くの遺伝子ベースのベクター制御ツールの開発への道を開いてきました。多くの昆虫種がすでに十分に発達したプロトコルを持っていますが、Culex quinquefasciatusは比較的研究が進んでいません。このマイクロインジェクションプロトコルは、採卵、卵ラフト分離、注入後の手順など、Culex quinquefasciatusのユニークな生物学的特性に対応するように特別に設計されています。
この方法は、関心のある任意のCulex種に適用できる可能性が高く、遺伝子機能の研究やCulex種の遺伝子ベースの制御技術の生成に使用できます。いかだから卵を分けることから始めます。鉗子または絵筆を使用していかだを押し下げ、個々の卵をからかいます。
スライドガラスの上部に敷いた両面粘着テープの薄いストリップに卵を合わせ、各卵の前面を同じ方向に向けて努力します。ハロカーボン試薬を水と穏やかに混合し、25°Cで一晩インキュベートして、ハロカーボン混合物を調製します。整列した卵をハロカーボンオイル混合物で覆います。
マイクロインジェクション用の針を生成するには、製造元の指示に従って、アルミノケイ酸塩キャピラリーガラスをニードルプラーに入れます。.熱を 560 に、速度を 100 に、遅延を 70 に、引っ張りを 97 に、圧力を 500 に設定します。次に、ニードルプラーをアクティブにします。
回転するダイヤモンド砥粒板に引っ張った針の先端に50度の角度で約10秒間そっと触れ、針先を面取りします。引っ張って面取りした針を、ペトリ皿のモデラーの粘土の線に埋め込みます。ゲノム改変試薬からなる注入混合物を調製し、氷上に保存します。
マイクロローダーチップを使用して、2マイクロリットルの注射混合物を注射針に装填します。充填した注射針を電子マイクロインジェクターに連結したマイクロマニピュレーターにセットし、整列卵を並べたスライドガラスを複合顕微鏡のステージに置きます。マイクロマニピュレーターを使用して、針を胚の後端に向けるように25〜35度の角度で合わせます。
針を胚に慎重に挿入し、胚の体積の約10%の量で混合物を注入します。一度に20個の卵子を注入し、その後停止して胚回収手順を実行します。注射後20分以内に、清潔な絵筆で卵を軽くブラッシングして、卵からハロカーボンオイルを慎重に取り除きます。
絵筆で卵を持ち上げ、卵が表面に付着しないように注意しながら、二重蒸留水のカップに入れます。次の7日間は、卵の孵化を毎日チェックし、通常の幼虫の飼育手順に従ってください。ステレオスコープを使用して、突然変異体の表現型について注射された蚊をスクリーニングします。
この方法は、ダークアイ色素の発症に重要な遺伝子の体細胞および生殖細胞変異を成功裏に生成するために使用されてきました。CRISPR-Cas9が生成した体細胞変異は、注射を受けた個人の瞳孔期の眼における色素沈着の喪失をスクリーニングすることによって採点されました。体細胞変異は一般にモザイク表現型として存在し、細胞のすべてではないが一部が変異表現型を有する
。生殖細胞変異率は、モザイクGゼロ個体を交配し、完全に白眼の子孫ごとにスコアリングすることによって決定されました。これらの実験により、胚の生存率は64〜82%、体細胞突然変異誘発率は37〜57%、生殖細胞系突然変異誘発率は61%を超えました。sgRNAをマルチプレックス化して同じ遺伝子の複数の遺伝子座を標的とすることにより、体細胞および生殖細胞系の突然変異誘発率は86%にも増加しました。さらに、何世代にもわたって、白色変異体の生存可能なホモ接合ストックが実験室で成功裏に保持されてきました。
生存率と突然変異誘発率を最適化するために、マイクロインジェクションを試みる前に、ハロカーボンオイル、注射液、針を含むすべての材料を適切に準備する必要があります。これにより、より合理化され、焦点を絞ったマイクロインジェクションプロセスが可能になります。
概要
このプロトコルは、CRISPR/Cas9遺伝子編集のために最適化されたCulex quinquefasciatus胚のマイクロインジェクション技術を概説しています。これは、遺伝学研究とベクター制御技術のための遺伝性の生殖系変異の効率的な生成を可能にします。
主要な研究構成要素
科学分野
- 遺伝子工学
- ベクター生物学
- CRISPR/Cas9技術
背景
- Culex quinquefasciatusは、研究が不十分な疾病媒介者です。
- マイクロインジェクション技術は、遺伝的制御ツールの開発に不可欠です。
- 他の昆虫種の既存のプロトコルは確立されています。
- この方法はCulex種の独特な生物学的特性を考慮に入れています。
研究の目的
- Culex quinquefasciatusのためのマイクロインジェクションプロトコルを確立すること。
- 遺伝子機能研究と遺伝子制御技術を促進すること。
- 注入された胚の生存率と変異誘発率を最適化すること。
使用した方法
- 卵の収集とラフト分離技術。
- ハロカーボン油と注入混合物の調製。
- マイクロマニピュレーターを用いた胚のマイクロインジェクション。
- 注入後の変異体表現型のスクリーニング。
主な結果
- 64-82%の胚生存率を達成しました。
- 体細胞の変異誘発率は37-57%の範囲でした。
- 生殖細胞の変異誘発率は61%を超えました。
- 複数のsgRNAの使用により、変異誘発率は86%に増加しました。
結論
- このプロトコルは、体細胞および生殖細胞の変異を成功裏に生成します。
- 実験室で生存可能な変異体のホモ接合体株を維持しました。
- 材料の適切な準備により、マイクロインジェクションプロセスが向上します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient embryo microinjection enables site-specific mutagenesis in Culex quinquefasciatus, a key vector for diseases such as West Nile virus and lymphatic filariasis. This capability supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by generating heritable mutations for functional gene studies. The protocol addresses species-specific barriers, improving predictive confidence in vector control target identification and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise gene knockout in a disease-relevant insect vector.
- Operational Value: Provides a reproducible method to generate germline mutations for functional validation of targets involved in pathogen transmission.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking gene disruption to phenotypic outcomes critical for vector competence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantifiable mutagenesis readouts (somatic and germline rates) to assess editing efficiency across guide RNA designs.
- Operational Value: Standardizes embryo handling and injection conditions, improving assay reproducibility across experimental batches.
- Scalability: Enables multiplexed sgRNA delivery to increase mutagenesis rates, supporting high-throughput target screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates heritable white-eye mutants to establish stable genetic lines for long-term phenotypic and transmission studies.
- Operational Value: Achieves embryo survival rates of 64–82%, ensuring sufficient viable mutants for downstream phenotypic screening.
- Translational Continuity: Maintains viable homozygous mutant stocks across generations, supporting preclinical evaluation of genetic control strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis to lead identification by enabling functional genomics in an understudied vector species.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis to clarify gene function in pathogen-vector interactions.
- Screening: Delivers quantitative mutagenesis rates (37–57% somatic, >61% germline) to compare guide RNA efficacy and optimize editing conditions.
- Analytics: Enables scoring of mutant phenotypes through stereoscopic screening, providing measurable outputs for hit validation.
- Translational Research: Facilitates continuity from gene discovery to preclinical model development by generating stable mutant lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized microinjection workflow adaptable across Culex species, reducing redundant protocol development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling direct genotype-phenotype linkage in a vector-borne disease model.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized egg alignment, halocarbon overlay, and needle preparation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional validation of targets essential for vector survival or pathogen transmission.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on heritable mutation rates and phenotypic severity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling, micromanipulation, and fluorescent or stereoscopic screening.
- Dependent on needle puller, microinjector, and halocarbon oil preparation for embryo viability.
- Necessitates cross-team standardization of egg collection and raft separation techniques.
- Adaptation across Culex species may require adjustments to injection volume and needle geometry.
- Practical limitations include embryo fragility and the need for immediate post-injection recovery to maintain survival rates.
