虚血性腎障害マウスモデルの腎臓内microRNAの定量的検出法

AKI におけるマイクロ RNA の発現の変化は、バイオマーカーと治療に役立つ可能性があります。このプロトコルはシンプルで、ラボ間で一定の結果を達成します。腎臓の IRI は、AKI の主要な危険因子の 1 つです。IRIによって変化したマイクロRNAを定量化することで、診断につながります。腎臓サンプルから精製されたマイクロRNAは、他のシステムに適用されます。処置中は、低体温症、腸の保湿、麻酔の深さを注意深く監視してください。慣れる手作業のテクニックが多いからだ。

[ナレーター]つま先つまみに反応がないことを確認した後、麻酔をかけたマウスを仰臥位で加熱した手術パッドの上に置きます。腹部正中線切開を行った後、PBSで湿らせた綿棒を使用して腸を腹腔外の左側にそっと押して右腎臓と尿管を露出させ、角度の付いた鉗子を使用して右尿管を持ち上げます。4-0の絹編み縫合糸で尿管を2か所結紮し、腎臓に近い縫合糸に長い結び目を残し、縫合糸の間を切断します。残りの縫合糸を慎重に持ち、腎臓に沿って結合組織と脂肪を鈍く解剖し、右腎臓に血液を供給する腎動脈や静脈ではない血管を特定します。血管を結紮し、右腎臓が十分に剥離したら、腎静脈と動脈を結紮します。PBSで湿らせた綿棒を使用して、腸を腹腔外の右側に向かってそっと押して左腎臓を露出させ、湿らせたドレープで腸を覆います。示されているように左腎臓を準備した後、腎臓から1センチメートルのところに腎動脈と静脈をクランプして、左腎虚血を誘発します。虚血の成功は、腎臓組織の段階的に均一に黒ずむことによって視覚的に確認できます。虚血が確認されたら、腸のねじれを避けるように注意しながら腸組織を腹腔に戻し、腹部の皮膚を一時的に閉じてドレープします。25〜45分後、クランプを取り外し、血流再灌流と腎臓の色が改善することを確認します。腸がねじれていないことを確認した後、腹腔内にPBSを点眼し、4-0ナイロン縫合糸で腹筋と皮膚を2層に閉じます。虚血性損傷誘発の 24 時間後、正中線切開を再開し、27 ゲージの針を使用して下大静脈から血液を採取します。胸壁に正中線を切開し、23ゲージの針を左心室に挿入します。針への逆流を確認したら、肝臓の右葉を切開し、PBSを20ミリリットル注入します。肝臓が赤からピンクに変わり、十分な血液が排出されたことを確認します。鉗子とハサミを使用して左腎臓を切除し、切除した組織をPBSの皿で洗浄します。次に、鉗子を使用して腎臓を乾燥させることなく腎筋膜を取り除き、垂直の正中線に沿って腎臓を半分に切ります。マイクロRNA精製の場合は、凍結腎臓サンプル30ミリグラムを、氷上の700マイクロリットルのフェニルグアニジンベースの溶解試薬を含むガラスホモジナイザーに入れ、乳棒をゆっくりと繰り返しひねってサンプルを完全に均質化します。組織が完全に解離したら、均質化されたライセートを2ミリリットルの収集チューブ内のマイクロ遠心スピンカラムのバイオポリマーシュレッダーシステムに移し、遠心分離によってサンプルをチューブの底に収集します。ライセートを140マイクロリットルのクロロホルムを含む新しいマイクロ遠心チューブに移し、キャップをしっかりと締めた状態でチューブを15秒間反転して混合します。室温で2〜3分間インキュベートした後、遠心分離によってサンプルを沈殿させ、ペレットを乱すことなく、上清を100%エタノールの1.5倍の体積を含む新しいマイクロ遠心チューブに移します。ボルテックスしてサンプルを5秒間混合してから、700マイクロリットルのサンプルを2ミリリットルの収集チューブ内のシリカ膜ベースのスピンカラムに移します。短い遠心分離の後、フロースルーを廃棄し、洗浄ごとに新しいシリカ膜ベースのスピンカラムで500マイクロリットルの洗浄バッファー2でサンプルを2回洗浄し、微量の塩分を除去します。2回目の洗浄後、シリカ膜ベースのスピンカラムを再度遠心分離し、フロースルーを廃棄した後、カラムを新しい1.5ミリリットルの収集チューブに移します。25マイクロリットルのRNaseフリー水をカラムに加え、サンプルを室温で5分間インキュベートしてから、サンプルを再度遠心分離します。次に、25マイクロリットルのマイクロRNA含有溶泡を新しいマイクロ遠心チューブに移します。本研究では、急性腎障害マウスの腎臓でアップレギュレーションされたヒトに発現する7つのマイクロRNAを調べた。実証されたように、定量的リアルタイムPCRを使用して、虚血再灌流損傷マウスの腎臓で有意に増加することが判明しました。血清血中尿素窒素およびクレアチニンレベル、および急性尿細管壊死も有意にアップレギュレートされました。

IRI 診断と AKI の特定の治療のためのバイオマーカーは不明のままです。マイクロRNA研究が進歩し、AKIの診断と治療に貢献することを期待しています。