Name: 虚血性腎障害マウスモデルの腎臓内microRNAの定量的検出法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 学ぶ虚血性腎障害マウスモデルにおける腎臓microRNAの定量検出法。定量リアルタイムPCRを用いて、急性腎障害のバイオマーカーとしてmicroRNA発現を解析する信頼性の高いプロトコルを確立します。

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<ol><li>Kelly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure%3A+much+more+than+a+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminas+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure: much more than a kidney disease.</a> Seminas in Nephrology. 26 (2), 105-113 (2006).</li>
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<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miR-126+is+a+potential+biomarker+to+predict+the+onset+of+type+2+diabetes+mellitus+in+susceptible+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 463 (1-2), 60-63 (2015).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-21+is+a+key+therapeutic+target+for+renal+injury+in+a+mouse+model+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).</li>
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<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Jonas, S., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+molecular+understanding+of+microRNA-mediated+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing.</a> Nature Reviews. Genetics. 16 (7), 421-433 (2015).</li>
<li>Ichii, O., Horino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+associated+with+the+development+of+kidney+diseases+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs associated with the development of kidney diseases in humans and animals.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 23-34 (2018).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+miRNA-17-5p%2C+miRNA-21+and+miRNA-106a+level+during+rat+kidney+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Changes of miRNA-17-5p, miRNA-21 and miRNA-106a level during rat kidney ischemia-reperfusion injury.</a> Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 95 (19), 1488-1492 (2015).</li>
<li>Saikumar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+circulation%2C+and+excretion+profile+of+microRNA-21%2C+-155%2C+and+-18a+following+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%3A+an+Official+Journal+of+the+Society+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Expression, circulation, and excretion profile of microRNA-21, -155, and -18a following acute kidney injury.</a> Toxicological Sciences: an Official Journal of the Society of Toxicology. 129 (2), 256-267 (2012).</li>
<li>Li, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+in+the+pathogenesis+of+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 in the pathogenesis of acute kidney injury.</a> Protein & Cell. 4 (11), 813-819 (2013).</li>
<li>Zhou, J., Chen, H., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+the+expression+profile+of+non-coding+RNAs+involved+in+ischemia%2Freperfusion-induced+acute+kidney+injury+in+mice+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of the expression profile of non-coding RNAs involved in ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury in mice using RNA sequencing.</a> Oncotarget. 8 (59), 100196-100215 (2017).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profile+by+next-generation+sequencing+in+a+novel+rat+model+of+contrast-induced+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profile by next-generation sequencing in a novel rat model of contrast-induced acute kidney injury.</a> Annals of Translational Medicine. 7 (8), 178(2019).</li>
<li>Colbert, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model-specific+role+of+microRNA-223+as+a+mediator+of+kidney+injury+during+experimental+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">A model-specific role of microRNA-223 as a mediator of kidney injury during experimental sepsis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (2), 553-559 (2017).</li>
<li>Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+body+temperature+in+a+rat+model+of+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation Proceedings. 39 (10), 2983-2985 (2007).</li>
<li>Dallas, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+levels+assessed+by+oligonucleotide+microarray+analysis+and+quantitative+real-time+RT-PCR+--+how+well+do+they+correlate%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate.</a> BMC Genomics. 6, 59(2005).</li>
<li>Rockett, J. C., Hellmann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirming+microarray+data--is+it+really+necessary%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Confirming microarray data--is it really necessary.</a> Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ベントチップテーパーピンセットフックなし</td><td>夏目製作所</td><td>MA-47</td><td></td></tr><tr><td>バッファー RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>洗浄バッファー 1</td></tr><tr><td>バッファー RWT</td><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>洗浄バッファー 2</td></tr><tr><td>C57B6 マウス</td><td>SLC</td> 歯付き鉗子<td>を割り当て</td><td></td>ない</tr><tr><td></td><td>夏目製作所</td><td>MA-49</td><td></td></tr><tr><td>歯なし鉗子</td><td>夏目製作所</td><td>MA-48-1</td><td></td></tr><tr><td>止血クリップ</td><td>夏目製作所</td><td>KN&minus;353</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical qRT-PCR用96ウェル反応プレート</td> サー<td>モフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>4316813</td><td>96ウェル反応プレート</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学粘着フィルム</td> サー<td>モフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>96ウェル反応プレート用4311971粘着フィルム</td><td></td></tr><tr><td>miRNA-132-3pプライマー</td><td>Qiagen</td><td>MS00003458</td><td>5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG</td></tr><tr><td>miRNA-17-5pプライマー</td><td>Qiagen</td><td>MS00029274</td><td>5'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG</td></tr><tr><td>miRNA-18a-5p プライマー</td><td>Qiagen</td><td>MS00031514</td><td>5'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG</td></tr><tr><td>miRNA-212-3p プライマー</td><td>Qiagen</td><td>MS00003815</td><td>5'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC</td></tr><tr><td>miRNA-21a-5p プライマー</td><td>Qiagen</td><td>MS00009079</td><td>5'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA</td></tr><tr><td>miRNA-223-3p プライマー</td><td>Qiagen</td><td>MS00003871</td><td>5'UGUCAGUUGUCAAAUACCCCA</td></tr><tr><td>miRNA-574-5pプライマー</td><td>Qiagen</td><td>MS00043617</td><td>5'UGAGUGUGUGUGUGUGUGUGU</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>シリカ膜ベースのスピンカラム</td></tr><tr><td>miScript II RTキット</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCRキット</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td></td></tr><tr><td>QIAシュレッダー</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>マイクロ遠心分離機スピンカラムでのバイオポリマーシュレッダーシステム</td></tr><tr><td>QIAzol 溶解試薬</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>フェノール/グアニジンベースの溶解試薬</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Flex リアルタイム PCR システム</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>リアルタイム PCR 装置</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex ソフトウェアバージョン 1.2.1。</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>4472380</td>リアルタイム<td>PCR装置ソフト</td></tr><tr><td>RNU6-2 プライマー</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td>非<td>公開</td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>夏目製作所</td><td>B-2</td><td></td></tr><tr><td>血管クリップアプリヤ</td><td>VITALITEC</td><td>1621420</td><td></td></tr></tbody></table>

虚血性腎障害マウスモデルの腎臓内micrornaの定量的検出法

A Quantitative Detection Method for MicroRNAs in the Kidney of an Ischemic Kidney Injury Mouse Model

ここでは、AKIマウスにおけるmiRNA発現プロファイルを調査しました。miRNAの発現プロファイルは、マウスのさまざまな臓器や組織で研究されています。MiRNAは重要な転写後調節因子であり、現在、AKIを含むさまざまな疾患の特性評価において広く研究されています。MiRNAは、病態の解明やAKI12の治療への応用に役立つ可能性を秘めています。AKIの主な原因は、IRI、腎毒性の傷害、および敗血症です。腎臓のIRIは、AKIの発症の主要な危険因子の1つです。AKI13には多数のmiRNAが関与していることが報告されています。
この研究では、敗血症モデルとIRIモデルで一般的に変更されるmiRNAを、ここで説明するプロトコルを使用して調査しました。マイクロアレイ解析によりAKIマウスの腎臓でアップレギュレーションされることが示された17種類のmiRNAを選抜し、ヒトで発現することが報告されたmiRNAのうち7種類を調べました。6 種類の miRNA(miRNA-17-5p、miRNA-18a...

虚血性腎障害マウスモデルの腎臓内microRNAの定量的検出法

MicroRNAs (miRNAs) are involved in various disease states and are effective biomarkers for the early diagnosis of diseases and treatment in mice. However, ...

AKI におけるマイクロ RNA の発現の変化は、バイオマーカーと治療に役立つ可能性があります。このプロトコルはシンプルで、ラボ間で一定の結果を達成します。腎臓の IRI は、AKI の主要な危険因子の 1 つです。IRIによって変化したマイクロRNAを定量化することで、診断につながります。腎臓サンプルから精製されたマイクロRNAは、他のシステムに適用されます。処置中は、低体温症、腸の保湿、麻酔の深さを注意深く監視してください。慣れる手作業のテクニックが多いからだ。[ナレーター]つま先つまみに反応がないことを確認した後、麻酔をかけたマウスを仰臥位で加熱した手術パッドの上に置きます。腹部正中線切開を行った後、PBSで湿らせた綿棒を使用して腸を腹腔外の左側にそっと押して右腎臓と尿管を露出させ、角度の付いた鉗子を使用して右尿管を持ち上げます。4-0の絹編み縫合糸で尿管を2か所結紮し、腎臓に近い縫合糸に長い結び目を残し、縫合糸の間を切断します。残りの縫合糸を慎重に持ち、腎臓に沿って結合組織と脂肪を鈍く解剖し、右腎臓に血液を供給する腎動脈や静脈ではない血管を特定します。血管を結紮し、右腎臓が十分に剥離したら、腎静脈と動脈を結紮します。PBSで湿らせた綿棒を使用して、腸を腹腔外の右側に向かってそっと押して左腎臓を露出させ、湿らせたドレープで腸を覆います。示されているように左腎臓を準備した後、腎臓から1センチメートルのところに腎動脈と静脈をクランプして、左腎虚血を誘発します。虚血の成功は、腎臓組織の段階的に均一に黒ずむことによって視覚的に確認できます。虚血が確認されたら、腸のねじれを避けるように注意しながら腸組織を腹腔に戻し、腹部の皮膚を一時的に閉じてドレープします。25〜45分後、クランプを取り外し、血流再灌流と腎臓の色が改善することを確認します。腸がねじれていないことを確認した後、腹腔内にPBSを点眼し、4-0ナイロン縫合糸で腹筋と皮膚を2層に閉じます。虚血性損傷誘発の 24 時間後、正中線切開を再開し、27 ゲージの針を使用して下大静脈から血液を採取します。胸壁に正中線を切開し、23ゲージの針を左心室に挿入します。針への逆流を確認したら、肝臓の右葉を切開し、PBSを20ミリリットル注入します。肝臓が赤からピンクに変わり、十分な血液が排出されたことを確認します。鉗子とハサミを使用して左腎臓を切除し、切除した組織をPBSの皿で洗浄します。次に、鉗子を使用して腎臓を乾燥させることなく腎筋膜を取り除き、垂直の正中線に沿って腎臓を半分に切ります。マイクロRNA精製の場合は、凍結腎臓サンプル30ミリグラムを、氷上の700マイクロリットルのフェニルグアニジンベースの溶解試薬を含むガラスホモジナイザーに入れ、乳棒をゆっくりと繰り返しひねってサンプルを完全に均質化します。組織が完全に解離したら、均質化されたライセートを2ミリリットルの収集チューブ内のマイクロ遠心スピンカラムのバイオポリマーシュレッダーシステムに移し、遠心分離によってサンプルをチューブの底に収集します。ライセートを140マイクロリットルのクロロホルムを含む新しいマイクロ遠心チューブに移し、キャップをしっかりと締めた状態でチューブを15秒間反転して混合します。室温で2〜3分間インキュベートした後、遠心分離によってサンプルを沈殿させ、ペレットを乱すことなく、上清を100%エタノールの1.5倍の体積を含む新しいマイクロ遠心チューブに移します。ボルテックスしてサンプルを5秒間混合してから、700マイクロリットルのサンプルを2ミリリットルの収集チューブ内のシリカ膜ベースのスピンカラムに移します。短い遠心分離の後、フロースルーを廃棄し、洗浄ごとに新しいシリカ膜ベースのスピンカラムで500マイクロリットルの洗浄バッファー2でサンプルを2回洗浄し、微量の塩分を除去します。2回目の洗浄後、シリカ膜ベースのスピンカラムを再度遠心分離し、フロースルーを廃棄した後、カラムを新しい1.5ミリリットルの収集チューブに移します。25マイクロリットルのRNaseフリー水をカラムに加え、サンプルを室温で5分間インキュベートしてから、サンプルを再度遠心分離します。次に、25マイクロリットルのマイクロRNA含有溶泡を新しいマイクロ遠心チューブに移します。本研究では、急性腎障害マウスの腎臓でアップレギュレーションされたヒトに発現する7つのマイクロRNAを調べた。実証されたように、定量的リアルタイムPCRを使用して、虚血再灌流損傷マウスの腎臓で有意に増加することが判明しました。血清血中尿素窒素およびクレアチニンレベル、および急性尿細管壊死も有意にアップレギュレートされました。IRI 診断と AKI の特定の治療のためのバイオマーカーは不明のままです。マイクロRNA研究が進歩し、AKIの診断と治療に貢献することを期待しています。

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この記事では、ホルマリン固定腎臓切片にマイクロRNA発現の比色検出のために最適化されたin situハイブリダイゼーションプロトコルについて説明します。...

マイクロRNA<em&gt;その場で</em&gt;ホルマリン固定腎臓組織のためのハイブリダイゼーション

ここで説明されている腎虚血再灌流障害のマウスモデルは、制御組織を提供する右腎摘出術と、急性腎障害をもたらす虚血を誘発するための左腎椎弓根のクランプで構成されています。このモデルは、正中線開腹術アプローチを使用しており、すべてのステップが 1...

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免疫グロブリンA腎症マウスの腎臓におけるマイクロRNA発現の検出

加齢性腎機能障害マウスの腎臓および血清におけるマイクロRNA発現を定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により評価する方法を提示する。...

加齢性腎障害マウスの腎臓および血清におけるマイクロRNA発現の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応評価

ここでは、いくつかの腎臓病モデルマウスにおいて、非ウイルスベクターとポリエチレンイミンナノ粒子の尾静脈注射 を介して 、外因性人工的に合成されたmiRNA模倣物を腎臓に送達します。これにより、腎臓における標的miRNAの有意な過剰発現がもたらされ、その結果、いくつかのマウスモデルにおいて腎臓病の進行が抑制された。...

いくつかの腎臓病モデルマウスにおけるポリエチレンイミンナノ粒子を用いた外因性人工合成miRNA模倣体の腎臓への送達

本論文では、片側腎IRIを用いた虚血性CKDモデルと、サンプル採取の前日に行われた対側腎摘出術を提示します。このプロトコルにより、血清ベースの機能評価、高い生存率、28日および42日のCKD病理の再現性が可能となり、機序的および介入的研究のための多用途なプラットフォームを提供します。...

腎虚血/再灌流障害による急性から慢性腎臓への移行のマウスモデル

マウスの右腎切除後の片側性腎虚血再灌流時の腎微小血管血流の変化を監視するために、レーザースペックルコントラストイメージングシステムを用いました。...

マウスの腎虚血再灌流損傷におけるレーザースペックルコントラストイメージングによる微小血管灌流

分離された膵島の移植は1型糖尿病の治療薬であることが提案されている。ここでは、マウスの膵臓から膵島を分離し、腎臓の被膜下のスペースにそれらを移植する方法を説明します。...

マウス膵島の単離と被膜下腎移植のための方法

学ぶ虚血性腎障害マウスモデルにおける腎臓microRNAの定量検出法。定量リアルタイムPCRを用いて、急性腎障害のバイオマーカーとしてmicroRNA発現を解析する信頼性の高いプロトコルを確立します。

虚血性腎障害マウスモデルの腎臓内microRNAの定量的検出法

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