Name: 銀の鯉、眼圧軟化モリクスにおけるギル・レイカー粘液のマクロ・レオロジー特性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学ぶ銀の鯉の鰓耙粘液のマクロレオロジー特性評価法。小サンプル量での非ニュートン型生物流体の粘弾性と降伏応力を正確に測定し、濾過摂食メカニズムの理解に貢献します。

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著者らは、GWバイオミメティクスバイオインスピレーション工学センターからの支援と資金援助を認めている。ジョージ・ワシントン大学生物科学科のL・パトリシア・ヘルナンデス教授は、調査にインスピレーションを与え、継続的なコラボレーションを行い、銀鯉の生理学に関する生物学的専門知識を提供し、粘液サンプルを提供してくれたことに感謝します。私たちは、デビッド・パルンボ氏、カーリー・コーエン氏、アイザック・フィンバーグ氏、ドミニク・ペトロシーノ氏、アレクシス・レンデロス氏、プリシラ・ヴァルゲーゼ氏、カーター・テゲン氏、ラガフ・パイジュル氏の研究室での支援、トーマス・エヴァンス氏とTAインスツルメンツのトーマス・エヴァンス氏とジェームズ・トーマス氏に感謝します。図5A,Cの画像は、ジョージワシントン大学生物科学科のL.パトリシア・ヘルナンデス教授が行った解剖中に撮影されました。

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</ol>

利益相反は宣言されていません。

このプロトコルを開発する主な目的の1つは、非常に小さなサンプル量が利用可能な場合にGR粘液のレオロジー特性に適していることを確立することです。我々は、GR粘液のレオロジー特性を完全に特徴付けるために銀鯉の群れからのより多くのサンプルが必要であり、ここに提示されるデータは銀鯉の集団全体の一般化ではないことを認める。我々の技術は、少量のサンプルのレオロジー特性と粘液サンプルのより大きなアンサンブルを含む拡張調査との有効性のために正当化される。
プロトコル内の重要なステップは、様々な濃度の粘液溶液の調製、回転式の回転計を用いた測定とデータ取得、および物理的な洞察のためのグラフィカルな表現とデータ分析です。
GR 粘液データに関する物理的な洞察は、 図 3 および 図 4に示すグラフィック表現から引き出され、予想される材料の動作の属性で示されています。ゼロ剪断歪み率粘度(η o)値は、材料分子の...

銀の鯉、眼圧性モリトリックスは、プランクチボラスフィルターフィーダーであり、米国のいくつかの自然水路に浸透している侵略的な種です。この種は、最初は藻類の花1、2、3を制御するために、ミシシッピ川の上流域で導入されました。銀の鯉は非常に有効なフィーダーである。通常、その消耗品の粒子サイズは4〜20μmから約80μm3、4、5の大きな動物プランクトンまで及ぶ。この種は他の在来魚と競合しており、利用可能な資源1、2、6を制限することで、ネイティブの水路に甚大な被害を与える可能性があります。したがって、銀の鯉や大きな頭の鯉などの魚を餌にするフィルターは、五大湖1、2、6、7、8に大きな脅威を与えます。
魚の餌付けフィルターは、その表面に存在する粘液の薄い層を持つギルレーカー(RS)と呼ばれる特別な器官を持っています。これらの器官は入ってくる液体からの小さい粒子のろ過および凝集の効率を改善する。本明細書に提示されるプロトコルの目標は、銀の鯉の中のギルレーカーの内面から取得した非ニュートン、剪断間薄化材料特性および降伏応力を特徴付ける。GR粘液の降伏応力の値は、回転式の表現力計を用いて確認され、この研究で注目されている。測定された降伏応力は、「見かけの降伏応力」とも呼ばれ、定常せん断速度や動的振動歪型タイプ9、10などの試験方法に依存します。せん断間化の「降伏応力流体」は、重要な加重応力9,11において固体状から液体様の挙動への移行を受ける。見かけの降伏応力は、流れを開始するために必要な最小せん断応力、または粘液がゲル状の材料から流体状の材料に移行するときに、不可逆的な塑性変形が最初に観察される最小せん断応力です。この挙動は、構造化粘弾性材料で観察することができます。GR粘液のゲル状から流体状の挙動への移行には、食品微粒子を収集する接着的役割と、粒子状の送達および濾過プロセスを支援する輸送車両の役割の2つの機能が必要です。粘液の拡張機能は、疾患耐性および呼吸における拡散障壁の作成、栄養因子の制御放出、毒性成分および排泄の制御放出、摂食および入れ子のための代謝経路の作成、捕食者保護の支援、および移動および推進効率12、13、14を改善する境界層改変を生み出すことである。
単純な流体とは異なり、粘液のような複雑な流体は、流れの条件によって異なる特性を持ち、バルクスケールの物理的挙動を定義するために追加の測定パラメータを必要とします。GR粘液の粘度と降伏応力を監視するために、回転レオメーターを使用してレオロジー測定を行います。回転式の回転計は、流体サンプルに接触する回転ディスクを使用して、安定したまたは振動性のせん断応力または歪みを適用し、その応答を測定します。この装置と技術を使用する背後にある根拠は、この測定器は、密度だけでは定義できない銀の鯉のGR粘液の材料特性を記述するための一連の測定値を提供することができるということです。
粘液は粘弾性材料であり、強制変形に対する機械的反応は、純粋な固体(フックの弾性法則によって支配される)と純粋な液体(ニュートンの粘性法則によって支配される)の間にある15,16である。粘液内に含まれる複雑な高分子ネットワークは、外力や変形に応じて伸縮し、方向を変えることができます。回転式の回転計は、図 1と図 2に示すように、円錐形状とペルチェプレートで構成されます (計測仕様については表1を参照)。本研究の目的は、GR粘液のレオロジー特性を決定するプロトコルを開発することであった。粘度計よりも回転式の回転計の利点は、少量のサンプルを使用して動的測定を行う能力です。この研究におけるGR粘液サンプル容積は約1.4mLであった。一方、粘度計は一定のせん断速度に制限されており、大量のサンプルを必要とします。
粘液のレオロジー特性は、銀の鯉の解剖学内で大きく変化することが期待される。例えば、GR表面に存在する粘液の特性は、エピブランチ器官と異なってもよい。魚の異なる領域における粘液特性の潜在的な変動性を考慮して、獲得したGR粘液サンプルを希釈し、回転リオメーターを用いて3つの濃度の溶液を作成し、試験した。プロトコルを実行した後に報告された粘液の変性に関するデータと結果は、測定技術の有効性を示した。この論文で示す例示的なデータは、銀の鯉の集団全体にわたって一般化されることを意図したものではありません。本明細書に提示されるプロトコルは、他の仮説をテストするために、より大きなサンプルセットにわたる粘液学を調査するために拡張することができる。
本研究の目的は、3つの異なる粘液濃度(400mg/mL、200mg/mLおよび100mg/mL)を有するGR粘液学のレオロジー特性の変動を実証することにある。400mg/mL濃度は、魚グラムから採取した生粘液サンプルを表し、除イオン水(DI)を使用して、生の粘液サンプルを200mg/mLおよび100mg/mL濃度に希釈した。粘液サンプルを希釈することで、濃度の関数としての剪断薄化および明らかな収量応力の評価と、GR粘液が非ニュートン行動に移行する濃度の決定が可能となった。シェーカーは、不均一性によるレオロジーデータの誤差を軽減するために、サンプル内の粘液の大きな塊を分解するために使用されました。
魚を含むほとんどの脊椎動物において、主な粘液形成高分子は、絡み合いや化学的架橋によって水中に膨れ込み、ゲル状物質12、13、17、18、19、20を生成する傾向がある糖タンパク質(ムチン)である。高分子、ゲル形成高分子および高含水率は、粘液13における滑りやすさを反映する。高い高い高分子間相互作用はゲル形成をもたらすが、高分子間相互作用または結合の崩壊のレベルが低いと、高粘度流体21が得られる。
魚を供給するフィルターにおける食品微粒子濾過のプロセスは、接着性およびタック22の可能性を決定する凝集および粘度などのGR粘液関連の特性によって助けられている。粘液ベースの接着の強さは、特定の分子間、静電または疎水性相互作用23に依存する。サンダーソンら24 は、粘液ベースの接着の証拠を発見したブラックフィッシュで懸濁液試験を行った。彼らは、粘膜表面を有する浮遊食品微粒子の接着が続いて、それに作用する指向水流によって粘液と結合した粒子の凝集塊の輸送が続くと述べた。水流から発生するせん断ひずみ速度にさらされた粘液は、食物粒子を消化器官に送り込むのを促進する。内視鏡的手法は、ろ過粒子24を観察するために用いた。
GR粘液のレオロジー検査におけるせん断速度と実用的限界の範囲に関する文献は乏しい。そこで、胃、鼻、子宮頸管および肺粘液、サケの皮膚粘液、ハグフィッシュスライム、および骨関節表面潤滑剤に関するレオロジー研究から指導を求め、その後、レオロジー特性と非ニュートン属性を11、12、25、26、27、28、29、30、31に求めた。最近では、魚の皮膚粘液が移動や推進効率に及ぼす影響を、一定のせん断速度粘度測定を用いて検討されている。シーブリーム、シーバスおよびミーグレに関する皮膚粘液の分析研究(希釈または均質化なし)は、典型的には低い剪断速度14で非ニュートンの挙動を示した。 別の関連研究では、セネガルソールの側側および腹側からの生の皮膚粘液サンプルは、非ニュートン的な挙動を示すことが判明し、32と考えられるすべてのせん断速度で腹側粘液のより高い粘度を示した。ヒドロゲル足場の発達に関する他のレオロジープロトコルおよび一定の剪断速度粘度計を用いた高濃度懸濁液についても文献33,34に報告されている。
本研究では、GR粘液特性を、複雑な生体流体25に対する流動学実験で広く使用されている歪速度制御、回転式流動計を用いて調べた。ニュートン流体の場合、見かけの粘度は一定のままで、せん断速度に依存しない、せん断応力はせん断応力率で線形に変化する(図3A、B)。非ニュートン流体(剪断間薄化流体など)の粘度は、せん断速度依存または変形履歴依存である(図3A、B)。損失係数(G")は、材料が流れる傾向に抵抗する程度を表し、流体粘度を表す(図4)。貯蔵弾性率(G')は、応力によって引き起こされた変形に続いて元の形状を回復する材料の傾向を表し、弾性に相当する(図4)。位相角度(δ)または損失接線値は、G"/G'の逆正接から計算されます。これは、エネルギー損失と貯蔵のバランスを表し、粘弾性材料(δ =フック固体の場合は0°、粘性液体の場合はδ=90°、粘弾性固体の場合はδ <45°、粘弾性液体の場合は45°をδ >)を特徴付けるための一般的なパラメータでもあります(図4)25。構造化流体における見かけの降伏応力(σ y)は、定常状態スイープおよび動的応力歪スイープ10からのレオロジーデータで観察できる状態の変化を表す。外部適用応力が見かけの降伏応力よりも小さい場合、材料は弾性的に変形します。応力が見かけの降伏応力(図3Bで「平均応力」としてマーク)を超えると、材料は弾性から塑性変形に移行し、液体状態35で流れ始める。振動応力(または歪み)条件下での粘液サンプルの貯蔵弾性率(G')と損失率(G")を測定すると、ゲル状から粘弾性性の液体状の挙動に物質状態の変化を定量化します。
貯蔵弾性率(G')、損失率(G")および見かけの粘度(η)に関するデータを監視するために実行されるレオメータ試験の種類をここに説明します。ダイナミック振動試験(歪みスイープと周波数スイープ)は、コーンジオメトリの制御された振動の下でG'とG"を監視しました。動的歪みスイープ試験では、固有の材料応答を監視することによって粘液の線形粘弾性領域(LVR)を決定した(図4)。歪みスイープは、一定の振動周波数と温度での降伏動作を決定するために使用されました。動的周波数スイープテストでは、一定の振幅(ひずみまたは応力)と温度での周波数の増加(変形率)に対する材料の応答を監視しました。ひずみは、動的周波数スイープ試験のために線形粘弾性領域(LVR)で維持された。定常せん断率テストでは、コーンジオメトリの安定した回転下での見かけの粘度(η)を監視しました。GR粘液を段階的な応力ステップを行い、見かけの粘度(η、Pa.s)を、せん断速度(ý,1/s)の変化をモニタリングした。
本論文では、GR粘液を、ある線形粘弾性応答範囲を持つ未知の粘弾性の複雑な構造化材料として扱う。魚の粘液は、L.パトリシア・ヘルナンデス教授(ジョージワシントン大学生物科学科)によってミズーリ川のハートクリークの場所での釣り遠征中に銀の鯉のDRから抽出されました1,2,36. Silver 鯉の口の中にある一連の GRs を図 5Aに示し、図5Bに概略図を示します。切除された GR を図5Cに示します。 銀色の鯉のGRsからの粘液の抽出は、図5D、図5D、Eの図の一例として提示される。すべてのレオメータ試験は、22±0.002°Cの一定の制御温度で行われ、漁場1、2、36で記録された温度。 各粘液サンプルを、その測定結果を3回測定し、平均結果を統計的誤差棒と共に提示した。

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>VWR</td><td>470224-038</td><td>プレートからサンプルをきれいにするため</td></tr><tr><td>手袋</td><td>VWR</td><td>89428-750</td><td>サンプルの汚染を防ぐため</td></tr><tr><td>ピペット</td><td>VWR</td><td>89079-974</td><td>バイアルからレオメーターにサンプルを輸送するには</td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>Thermo Scientific</td><td>72830-042</td><td>バイアルからレオメータにサンプルを輸送するには</td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>VWR</td><td>89032-094</td><td>粘液バイアルのサンプルを均一に混合するには</td></tr><tr>バイ<td>アル</td><td>VWR</td><td>66008-710</td><td>測定されたサンプルボリュームが含まれています</td></tr><tr><td>重量計</td><td>Ohaus</td><td>Scout &ndash;</td><td>粘液サンプルの質量を秤量するための</td>SPXバランス</tr><tr><td><強い>化学試薬</強い></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱イオン水(H20)</td><td>-</td><td></td><td>-液体</td></tr><tr><td>滅菌70%イソプロパノール(C3H8O)</td><td>VWR</td><td>89108-162</td><td></td></tr>液体<tr><td><>強いGR粘液</強い></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100mg/mL濃度、2mL</td><td>-</td><td>-</td><td>粘弾性材料</td></tr><tr><td>400 mg/mL 濃度、1mL</td><td>-</td><td>-</td><td>粘弾性材料</td></tr><tr><td>200 mg/mL 濃度、1mL</td><td>-</td><td>-</td><td>粘弾性材料</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2017a</td><td>データ解析、後処理、グラフ表現</td></tr><tr><td>Trios</td><td>TA Instruments</td><td>v4.5.042498</td><td>レオメータ機器制御および分析ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

銀の鯉、眼圧軟化モリクスにおけるギル・レイカー粘液のマクロ・レオロジー特性

Macro-Rheology Characterization of Gill Raker Mucus in the Silver Carp, Hypophthalmichthys molitrix

銀の鯉 、眼圧動性モリトリクスは、その非常に効率的なフィルター供給機構のために、ミシシッピ川の上流域の自然の水路がはびこる侵襲的なプランクチボラスフィルターフィーダー魚です。ギルレーカー(DR)と呼ばれる特徴的な器官は、多くのそのようなフィルターフィーダーに見られる、数ミクロンの大きさの植物プランクトンのような食品粒子の効率的なろ過を促進する。
GR粘液のレオロジーを調査する動機は、銀の鯉のフィルター供給プロセスを支援する役割を理解したいという私たちの願望に由来します。粘液が豊富な流体は、「厚くて粘着性のある」状態で、食品微粒子の付着を促進し得る。GR膜を通る浸透および輸送は、様々なせん断歪速度を誘発する外部せん断力の作用によって促進される。したがって、粘液の手引きは、魚を供給するフィルターのプール内の銀の鯉の驚異的な競争の性質に重要な手がかりを提供することができます。これに基づいて、GR粘液は、食品粒子に接着機能を提供し、フィルター供給プロセスを支援する輸送手段として作用し得ることを示唆した。
プロトコルの主な目的は、粘液の降伏応力を決定することです, 不可逆塑性変形が構造化された粘弾性材料を介して最初に観察される流れを開始するために必要な最小せん断応力に起因します.従って、GR粘液のレオロジー特性、すなわち、粘度、貯蔵、および損失モジュライは、回転レオメータを用いてその非ニュートン、剪断薄膜性について調べた。
ここで提示されたプロトコルは、ミズーリ川のハートクリークの場所で釣られた銀鯉のギルレーカーから抽出された粘液のレオロジー特性を分析するために使用されます。このプロトコルは、構造粘弾性材料と想定される粘液のレオロジー試験および物質的特性化のための効果的な戦略を開発することを目的としています。

このセクションでは、円錐形状(直径40mm、1°0'11')とペルチェプレートを持つ回転式流圧計を用いたGR粘液の実験結果を紹介します。実験は、GR粘液の非ニュートン、せん断間の挙動と、ゲル状物質から流体状の材料への粘液の移行を表す明らかな収量応力を特徴付けるのに役立った。代表的な結果は、低トルク限界と回転式流量計の二次流れ効果の定量的記述を伴う。計測限界と定常および動的歪み率の測定により、GR粘液の粘弾性行動動向と明らかな降伏応力を正確に確認できます。見かけの収率の測定は、GR粘液の不可逆塑性変形に必要な最小応力を観察し、流れを開始する手段を提供した。GR粘液の流動開始傾向は、食品粒子状の密着性および輸送機能に起因する可能性がある。GR粘液の接着および輸送機能は、プロトコル実験におけるレオロジー測定によって知らされた巨視的な物質属性であった。そこで、GR粘液のマクロ・レオロジー特性評価を、このプロトコルで行った。
実験で使用された粘液は、最大3匹の銀の鯉の数個のギルレーカーから取得され、血液1、2の<sup c...

このプロトコルは、銀の鯉のギルレーカー(の)上に存在する粘液のレガロジー特性を実行する方法を提示します。粘度、保存および損失モジュライを測定して得られるGR粘液の粘弾性特性は、見かけの収量応力について評価され、GRにおけるフィルタ供給機構を理解する。

The silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, is an invasive planktivorous filter feeder fish that infested the natural waterways of the upper Mississippi ...

このプロトコールの重要性は、特に非常に少量のサンプルしか利用できない場合に、粘液などの非ニュートン体液の正確なレオロジー特性評価を可能にすることです。この手法は、鰓レイカー粘液などの複雑な構造の生物学的流体の見かけの降伏応力と粘弾性の特性評価を容易にします。この方法により、鰓掻爬粘液の降伏応力推定が可能になり、ヒト、動物、植物の分泌物などの同様の生体液のレオロジー特性評価とプロトコル開発が容易になります。Kartik Bulusuによる手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の大学院生であるSamantha Racanです。100ミリグラム/ミリリットルの濃縮魚粘液を約2ミリリットル調製するには、脱イオン水を1対2の比率で2回加えることにより、400ミリグラム/ミリリットルの濃度の2ミリリットルの段階希釈を行います。粘液溶液のバイアルをシェーカーに置き、溶液が適切に均質化され、粘液粒子の凝集が軽減されるまで待ちます。レオメータを校正するには、レオメータ機器制御ソフトウェアを起動し、校正タブと機器タブを選択します。「キャリブレーション」および「キャリブレーション」をクリックして、キャリブレーション値が互いに 10% 以内にあることを確認し、「受け入れる」をクリックします。レオメータの上部にあるシャフトを回して、コーン角度ジオメトリを取り付けます。ソフトウェアは、直径40ミリメートル、1度、ゼロ分、11秒の円錐角形状を検出します。レオメータの形状キャリブレーションを実行するには、慣性の下のキャリブレーションをクリックし、キャリブレーションをクリックします。[同意する] をクリックして、キャリブレーションを受け入れます。「摩擦」の下の「キャリブレーション」をクリックし、「キャリブレーション」をクリックします。[同意する] をクリックして、キャリブレーションを受け入れます。ジオメトリの慣性と摩擦のキャリブレーション値は、適切な単位で記録する必要があります。ゼロギャップの初期化を実行するには、オプションのギャップをクリックします。ポップアップウィンドウで、軸力を1ニュートンに設定してOKをクリックし、ゼロギャップアイコンをクリックします。初期化は、ジオメトリが受ける軸力がペルチェプレートに触れたときに1ニュートン以上になったときに完了します。レオメータのギャップをゼロにして基準位置が正確になるようにするには、上矢印と下矢印を使用して、ジオメトリを任意の高さまで上げます。レオメータ機器の制御画面とレオメータ機器制御ソフトウェアのコントロールパネルの両方にギャップ高さが表示されます。レオロジー実験と目的の粘液の線形粘弾性範囲を実行するには、約300マイクロリットルの魚粘液を1ミリリットルのピペットチップにロードし、溶液をペルチェプレートにロードします。[go to t

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Engineering

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