Name: 一方的な尿管閉塞を有するマウス腎臓におけるマイクロRNA表現の定量リアルタイムPCR評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 学ぶマイクロRNA発現プロファイリング法。マウス腎臓における定量的リアルタイムPCRを用いて、一方性尿管閉塞モデルで腎線維症などの病態を高精度かつ高感度に評価する技術です。

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エダンツ・グループ(https://en-author-services.edanzgroup.com/)のミシェル・グッディ博士は、この原稿の草稿を編集してくれたことに感謝します。

すべての動物実験プロトコルは、吉地医科大学動物倫理委員会によって承認され、実験動物のための吉地医科大学ガイドから実験動物の使用とケアのガイドラインに従って行われました。
1. 恥の手術
<ol><li>イゾフルラン、コルクシート、脱毛剤クリーム、実験室用ワイプ、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)付きのペトリ皿、4-0ナイロン、ピンセット、外科用ハサミ、綿棒、8週齢のC57BL/6オスマウスを用意します。</li>
	<li>1.5%のイオブルランでマウスを麻酔し、1.5%に維持します。次に、脱毛クリームをマウスの腹部に塗布します。数分後、脱毛クリームをPBS浸した実験室の拭き取りで拭き取ります。</li>
	<li>マウスの腹部に70%エタノールを注入し、その後、スピーフィンの位置にコルクシートの上にマウスを置きます。</li>
	<li>手術用ハサミとピンセットを使用して、腹部の皮膚に切開を行い、膀胱から肋骨の左端に筋肉と腹膜を切断します。</li>
	<li>PBSで綿棒を2本湿らせ、腸を慎重に横に引っ張ります。湿らせた綿棒を置いて、左腎臓と尿管を識別します。</li>
	<li>腹膜を閉じ、4-0ナイロンで切開を閉じます。</li>
</ol>2. UUO手術
<ol><li>イゾフルラン、コルクシート、脱毛剤クリーム、実験室のワイプ、PBS付きペトリ皿、4-0シルク、4-0ナイロン、2.5 mLシリンジ、綿綿棒、ピンセット、外科用ハサミ、および8週齢のC57BL/ 6マウスの男性。</li>
	<li>1.5%のイオブルランでマウスを麻酔し、1.5%に維持します。次に、脱毛クリームをマウスの腹部に塗布します。数分後、脱毛クリームをPBS浸した実験室の拭き取りで拭き取ります。</li>
	<li>マウスの腹部マウスに70%エタノールを注入し、コルクシートの上の上の上の上のsupineの位置にマウスを置きます。</li>
	<li>手術用ハサミとピンセットを使用して、腹部の皮膚に切開を行い、膀胱から肋骨の左端に筋肉と腹膜を切断します。</li>
	<li>マウスの下に2.5 mLの注射器を置きます。綿棒を2本取り、PBSで湿らせる。腸をピンセットで慎重に横に引っ張り、湿らせた綿棒を適切に置いて左尿管を識別する。ピンセットを使用して、左腎臓を持ち上げます。</li>
	<li>4-0シルクを使用して、約1cm離れた2箇所で左尿管をリゲートします。2つの結紮の中心点で尿管を切り、4-0ナイロン縫合糸を使用して腹膜と切開部を閉じます。</li>
</ol>3. 腎臓サンプルの収集
<ol><li>準備:1.5 mLマイクロ遠心チューブ、イゾフルラン、コルクシート、70%エタノール、PBS付きペトリ皿、ピンセット、および外科用ハサミ。</li>
	<li>1.5%のイオブルランでマウスを麻酔し、1.5%に維持します。その腹部に70%エタノールを注入し、supine位置のコルクシートの上にマウスを置きます。</li>
	<li>手術用ハサミとピンセットを使用して、腹部の皮膚に切開を行い、膀胱から肋骨の左端に筋肉と腹膜を切断します。</li>
	<li>ピンセットで腹膜を持ち上げます。手術用はさみで、腹膜の上端に横切開を行い、肋骨の最下端に沿って切開を続ける。</li>
	<li>次に、左腎臓を特定し、腎臓が黄色白くなるまでPBSで還流して血管から血液を洗い流し、手術用ハサミで左腎動脈と静脈を切断して腎臓を取り除く。ペトリ皿に腎臓を入れ、PBSで慎重に洗います。</li>
	<li>手術用はさみとピンセットで10mgのサンプルに腎臓をカットします(10mgは次のステップに適したサイズです)。腎臓の各部分を独自の1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに入れ、チューブのキャップを閉じます。</li>
	<li>マイクロ遠心分離チューブを液体窒素に移し、使用前に長期保存のためにチューブを−80°Cに保ちます。</li>
</ol>腎臓サンプルからの全RNAの抽出
<ol><li>以下の項目を準備する:1.5 mLマイクロ遠心分離管、2.0 mLマイクロ遠心分離管、100%エタノール、 クロロホルム、ケイ素ホモジナイザー、氷、ボルテックスミキサー、2.0 mLコレクションチューブ11、12、,12膜固定スピンカラムの2.0 mLコレクションチューブ12、13、13フェノール/グアニジンベースのライシス試薬、グアニジンおよびエタノールを含む洗浄緩衝液(洗浄バッファー1)、エタノール(洗浄バッファー1)、およびエタノールを含む洗浄緩衝液(洗浄バッファー1)、およびエタノールを含む洗浄緩衝液(洗浄バッファー1)、および2.0 mLコレクションチューブ内のスピンカラム12</li>
	<li>シリコンホモジナイザーに10mgの腎臓サンプルを入れます。ホモジナイザーにフェノール/グアニジンベースのリシス試薬を700μL加えます。</li>
	<li>ホモジナイザーを準備し、ホモジナイザーの害虫を腎臓サンプルに対してゆっくりと押し/ねじり、サンプルを均質化します。腎臓サンプルがフェノール/グアニジンベースの溶解試薬に完全に溶解するまで、押し/ねじりを繰り返します。</li>
	<li>さらに試料を均質化するには、均質化したライセート(2.0 mL採取チューブ)を生体高分子スピンカラムに移します。</li>
	<li>均質化したライセートを室温(RT)で3分間14,000 x g で回転させ、沈殿したライセートを未使用の1.5 mLマイクロ遠心分離管に移します。</li>
	<li>チューブ内のライセートをクロロホルム140μLと組み合わせ、チューブキャップをしっかりと閉じます。ライセートとクロロホルムを混合するには、チューブを15回反転する。 注意:クロロホルムはフードなしで使用することができます。</li>
	<li>RTで2〜3分間各サンプルをインキュベートし、各サンプルを12,000 x g で4°Cで15分間回転させます。</li>
	<li>沈殿物を乱さずに、上澄み(通常は約300 μL)を新しい1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移し、その体積(通常は約450μL)の100%エタノールを加えます。混合物を5sの渦にする。</li>
	<li>サンプル700μLを2.0 mLのコレクションチューブの膜固定スピンカラムに積み込みます。列のキャップを閉じ、15 s の場合は 15,000 x g で 列を回転させます。集塵したライセートを回収管に捨てる。</li>
	<li>2.0 mLのコレクションチューブの膜固定スピンカラムに700 μLの洗浄バッファー1を加えてサンプルを十分に洗浄します。列のキャップを閉じ、15 s の場合は 15,000 x g で 列を回転させます。集塵したライセートを回収管に捨てる。</li>
	<li>洗浄バッファー 2 の 500 μL を 2.0 mL のコレクションチューブの膜固定スピンカラムに積み込み、微量塩を除去します。列のキャップを閉じ、15 s の場合は 15,000 x g で 列を回転させます。集塵したライセートを回収管に捨てる。 注:膜固定スピンカラムは、RNAとDNAを分離することができます。</li>
	<li>ステップ 4.11 をもう一度実行します。</li>
	<li>2.0 mLコレクションチューブ内の膜固定スピンカラムを15,000 x g で再び1分間回転させます。集塵したライセートを回収管に捨てる。</li>
	<li>膜固定スピンカラムを新しい1.5 mLコレクションチューブに移します。カラムに30μLのRNaseフリー水を加えて、総RNAを溶解します。カラムキャップを閉じ、室温で5分待ちます。次に、15,000 x g で 1 分間回転させます。</li>
	<li>全RNAを含むサンプルの総量を新しいマイクロ遠心チューブに移します。各チューブを氷の上に置き、分光光度法により全RNAの濃度を測定する。</li>
	<li>使用前に長期保管のために-80 °Cのサンプルとチューブを保ちます。</li>
</ol>5. RNA全体の逆転写を用いるcDNAの合成
注: MIQE(定量的リアルタイムPCR実験の公表のための最低限の情報)ガイドラインは、より良い実験実践を奨励し、信頼性が高く明確な結果を得るのを助けるために発行されました19.このプロトコルでは、cDNAは、逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、オリゴdTプライマーを用いた2段階の手順で、精製された全RNAの1.0 μgから合成される。
<ol><li>1.5 mLマイクロ遠心チューブ、キャップ付き8ウェルストリップチューブ、各8ストリップチューブのキャップ、蒸留水、氷、逆転写キット(材料表参照)14、15,15溶融状態、サーマルサイクラー、およびボルテックスミキサーを準備します。</li>
	<li>サーマルサイクラーを起動します。</li>
	<li>マスターミックス溶液を準備する:2.0 μLの逆転写酵素ミックス(キットに含まれる)と10x核酸ミックスの2.0 μLを5xハイスペックバッファの4.0 μLに加えます(チューブあたり合計8.0 μLマスターミックスを得る)。</li>
	<li>8ウェルストリップチューブの各チューブにマスターミックス溶液の8.0 μLを入れます。</li>
	<li>RNAの総密度を調整します。12μLのRNaseフリー水中の腎臓サンプルから1.0μgのRNAを分離するには、ステップ4.15で示した濃度データを使用して、適切な量の総RNAを蒸留水に移します。 注: DNAの汚染が存在する場合、汚染されたDNAはqRT-PCRで共同増幅されます。</li>
	<li>各チューブに12μLのRNAのアリコートを入れ、チューブのキャップを閉じます。チューブを15×の遠心分離機。</li>
	<li>チューブをサーマルサイクラーに入れ、サンプルを37°Cで60分間インキュベートします。 次に、cDNAの合成のために、95°Cで5分間サンプルをすぐにインキュベートします。</li>
	<li>インキュベーションが完了したら、cDNAを新しい1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移し、cDNAを蒸留水で10回(1:10)希釈します。5sのためのチューブをボルテックスと遠心分離機。</li>
	<li>希釈したcDNAを氷の上に一時的に保存し、使用前に長期保存のためにサンプルを−80°Cに移動してください。</li>
</ol>6. miRNAのqRT-PCR
注: インターカレーター法を用いてmiRNAのqRT-PCRを行いました。RNA用プライマーは、U6小核2(RNU6-2)、miRNA-3070-3p、miRNA-6401、miRNA-7218-5p、およびmiRNA-7219-5pが使用された。
<ol><li>以下の準備:1.5 mLマイクロ遠心分離管、 ボルテックスミキサー、qRT-PCR用96ウェル反応プレート、96ウェル反応プレート用粘着フィルム、接着フィルムアプリケーター、96ウェル遠心回転子、miRNA特異的プライマー、リアルタイムPCR機器、グリーン染料ベースPCRキット(材料表参照)14、15,15</li>
	<li>1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに混合した後、以下の項目をボルテックス:蒸留水6.25μL、ヌクレアーゼフリー水に溶解した各5μM miRNAプライマーの1.25μL、2×PCRマスターミックスの12.5 μL、および2.5μLの10xユニバーサルプライマー。</li>
	<li>ステップ5で説明したように合成したcDNAを調製し、それを溶融する。5 sの場合にcDNAをボルテックスおよび遠心分離機にする。</li>
	<li>96ウェルプレートの各ウェルに、試薬(ステップ6.2で説明したように作成)の22.5 μLアリコートを入れます。</li>
	<li>プレートの各ウェルにcDNAの2.5 μLアリコートを入れます。</li>
	<li>粘着フィルムアプリケータを使用して、96ウェルプレートに密着フィルムを固定します。96ウェル遠心回転子を1,000 x g でプレートを遠心し、各ウェルの底部で反応を落ち着かせる。</li>
</ol>7. PCR サイクリング
<ol><li>リアルタイム PCR システムを起動し、ステップ 6.6 で説明したように作成したプレートを配置します。リアルタイム PCR システムで使用できます。次に実験プロパティを設定します。実験名を識別します。システムの実験タイプとして「96ウェル(0.2mL)」、定量方法として「比較CT(ΔΔCT)」、標的配列を検出する試薬として「SYBRグリーン試薬」、システムの実行として「標準」を選択します。</li>
	<li>サンプルと標的miRNAに名前を割り当て、各ウェル内のサンプルとターゲットmiRNAに名前を割り当てます。結果を確認するための適切なデータを取得するために、サンプルを重複して割り当てる必要があります。参照サンプルと内在性コントロールを選択し、受動参照として使用する色素に対して「なし」を選択します。試薬の交差汚染を排除するために、miRNA発現に対して負の逆転写酵素および非テンプレート制御を設定してください。</li>
	<li>反応量設定が「20 μL」で、PCRサイクリング条件が95°Cで15分間、続いて94°Cで15秒で40サイクル、30秒で55°Cでアニーリング、30秒で70°Cで延長します。</li>
	<li>qRT-PCR プロセスが完了したら、システムのソフトウェアプログラムを使用して qRT-PCR データを分析します。ソフトウェア・プログラムによって自動的に選択されるしきい値行が各ウェルに適していることを確認します。</li>
	<li>各サンプルで分析した内因性制御および標的miRNAの閾値サイクル(CT)を確認します。CT値は、増幅曲線と閾値線の交点によって決定される。本研究では、標的miRNA発現レベルの内在制御としてRNU6-2を用い、ΔΔCT法を用いて各標的miRNA20の相対的発現量を決定した。</li>
</ol>

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<li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li>
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</ol>

著者らは、利益相反はないと宣言している。

qRT-PCR を用いた上記のプロトコルは、標的 miRNA の発現レベルを正常に決定しました。抽出されたmiRNAの評価は、意味のあるqRT-PCRデータを得るために重要であり、そしてqRT-PCRを行う前にmiRNAの品質を確認するために、260nmでの吸光度の比率を280nmで分光光度計で確認する必要があります。qRT-PCRでは、予想される長さおよび融点または単一性融解曲線の単一PCR増幅が得られない場合、反応板の各ウェルにDNA汚染またはプライマーダイマーが存在する可能性があります。
miRNAの発現レベルは、マイクロアレイ、ノーザンブロッティング、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法を含む、qRT-PCR以外のいくつかの方法で評価することができます。しかしながら、qRT-PCRは、正確かつ感度の高い、簡単で再現性の高い手順であり、より小さなサンプル量は、ノーザンブロッティングおよびリボヌクレアーゼ保護アッセイ22と比較してqRT-PCRに使用することができる。さらに、マイクロアレイは数万個のmiRNAの発現を同時に測定できるため...

マイクロRNA(miRNA)は、メッセンジャーRNA(mRNA)1の分解および転写阻害を引き起こす短い非コードRNAであり、生理学1と疾患(例えば、炎症、線維症、代謝障害、癌)の両方において重要な役割を果たしている様々なmRNAの発現を調節することが示されている。したがって、miRNAの一部は,、様々な疾患2、3、4、53の新しい2バイオマーカーおよび治療標的の候補である可能性がある。,45脳、心臓、肺、肝臓、腎臓を含むマウスの臓器および組織におけるmiRNA発現プロファイルは66、7、8、9、107,8,9,10と記載されているが、腎間質線維症を有するマウス腎臓におけるmiRNAの抽出および評価のための標準的な方法は存在しなかった。
腎間質線維症を有するマウスの腎臓におけるmiRNAの表現を確実に精製し、検出するプロトコルを設計した。このプロトコルには、次の 5 つの主要な手順が含まれます。(1) 8週齢のC57BL/6雄マウスは、恥ずかし操作(コントロール)を受けるマウスと、腎間質線維症に結合する一方的な尿管閉塞(UUO)を提供する手術を受けるマウスのグループに分けられる。(2)腎臓試料は、シャムマウスとUUOマウスから抽出され、ケイ素ホモジナイザーで別々にホモジナイズされ、次いでマイクロ遠心分離機スピンカラム11,12,12上の生体高分子シュレッディングシステムに移される。(3)miRNAを含む全RNAは、シリカ膜ベースのスピンカラム12、13,13によって腎臓サンプルから抽出される。(4)この抽出された全RNAを用いて、逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、及びオリゴdTプライマー14,15,15を用いて全RNAから相補的DNA(cDNA)を合成する。(5)miRNAの式は、インターカレート色素14,15,15を用いて定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)により評価される。
このプロトコル,は、様々な組織11、12、13、14、15の様々な組織11,12,13,14でmiRNAの有意義な抽出と評価を得た調査に基づいており、プロトコルで使用される生体高分子細断システムは、200612年に組織から高品質の総RNAを精製することが示された。15さらに、以前の研究では、インターカレートダイ14,15を用いてqRT-PCRによるmiRNA発現の測定に用いるプロトコルの側面(すなわち、逆転写酵素によるcDNA合成、ポリ(A)ポリメラーゼ、および抽出された全RNAからのオリゴ-dTプライマー)の正確性と15感度を確認した。新しいプロトコルは、簡便さ、時間節約、および技術的なエラーの削減の利点を有するため、このプロトコルは、マウス腎臓におけるmiRNAプロファイルの正確かつ敏感な同定を必要とする研究に使用することができる。さらに、このプロトコルは、多くの病理学的状態の調査に適用することができる。
次に、腎間質線維症に関連するUUOを有するマウスにおけるmiRNA発現プロファイルの決定について説明する。ヒトにおいて、腎間質線維症は、病因16,17,17に関係なく慢性腎疾患および末期腎疾患の両方の共通かつ重要な特徴である。この腎間質線維症は、腎不全の進行に関連しており、そして間質空間における細胞外マトリックス成分(例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、およびα平滑筋アクチン)17,18,18の表現の増加によって特徴付けられる。

<table><tbody><tr><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>ウォッシュバッファー 2</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>ウォッシュバッファー 1</td><td></td></tr><tr><td>Tokyo Laboratory Animals Science</td><td>未割り当て</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4316813</td><td>96ウェル反応プレート</td><td></td></tr><tr><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4311971</td><td>96ウェル反応プレート</td><td></td></tr><tr><td>用粘着フィルムQiagen</td><td>MS00001701</td><td>5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3'Qiagen</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MS00065141</td><td>5'-UUACACUCCAGUGGUGUGGGGGU-3'Qiagen</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MS00068067</td><td>5'-UGCAGGGUUAGUGUAGAGGG-3'Qiagen</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MS00068081</td><td>5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3'Qiagen</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>217004</td><td>膜固定スピン2.0 mL コレクションチューブ</td><td></td>内のカラム</tr><tr><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>逆転写酵素キット</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Green 色素ベースの PCR キット</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>2.0 mL コレクションチューブ</td><td></td>内のバイオポリマースピンカラム</tr><tr><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>フェノール/グアニジンベースの溶解試薬</td><td></td></tr><tr><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4472380</td><td>リアルタイムPCR装置</td><td></td></tr><tr><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4472380</td><td>リアルタイムPCR装置ソフトウェア</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>非公開</td><td></td></tr><tr><td>タカラバイオ</td><td>9790B</td><td>シリコンホモジナイザー</td><td></td></tr><tr><td>ASKUL</td><td>GA04SW</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AS ONE</td><td>ER1004NA45-KF2,62 -9968-32</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一方的な尿管閉塞を有するマウス腎臓におけるマイクロrna表現の定量リアルタイムpcr評価

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

マイクロRNA(miRNA)は、一本鎖で非コード化されたRNA分子であり、メッセンジャーRNA(mRNA)の3'非翻訳領域(UTR)の部分的に相補的な標的部位に結合することによって転写後レベルで遺伝子発現を調節するのが一般的であり、mRNAの翻訳および安定性を低下させる。マウスの様々な臓器や組織におけるmiRNA発現プロファイルは検討されているが、マウス腎臓におけるmiRNAの精製および定量のための標準的な方法は利用できなかった。我々は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)による腎間質線維化によるマウス腎におけるmiRNA発現を抽出し、評価するための効果的かつ信頼できる方法を確立した。このプロトコルには、(1)シャムと一方的な尿管閉塞(UUO)マウスの作成の5つのステップが必要でした。(2) UUOマウスからの腎臓サンプルの抽出;(3) 腎臓サンプルからのmiRNAを含む全RNAの抽出;(4) 相補的 DNA (cDNA) miRNA からの逆転写による合成;(5) cDNAを用いたqRT-PCRを用いた。このプロトコルを用いて、対照と比較してmiRNA-3070-3pの発現が有意に増加し、miRNA-7218-5pおよびmiRNA-7219-5pの発現が腎間質線維症のマウスモデルの腎臓において有意に減少したことを確認した。このプロトコルは、UUOを有するマウスの腎臓におけるmiRNA発現を決定するために使用することができる。

UUOマウスモデルは、20〜25gの体重を量る8週齢の雄マウスの21を記述した左尿管結紮によって作成された。4-0シルク縫合糸による二重結紮により、尿管は完全に妨害された。鎮痛薬(メロキシカム5mg/kg、皮下注射)は手術前および手術後2日間毎日投与された。手術後8日間で、腎臓を採取し、PBSですすいだ、解剖し、さらに分析するために液体窒素に貯蔵した。シャム作動したマウスはコントロールとして機能した。二重結紮は、左腎臓に水腎症がある場合に成功する。このUUOモデルを用いて得られたmiRNA qRT-PCRデータに基づいて、miRNA-3070-3pのレベルが有意に増加し、miRNA-7218-5pおよびmiRNA-7219-5pのレベルは、コントロールと比較してUUOマウスの腎臓において有意に減少した(図1)。
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一方的な尿管閉塞(UUO)を有するマウスの腎臓におけるマイクロRNA発現を定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により評価する方法を説明する。このプロトコルは、UUOを有するマウスおよび他の病理学的状態の文脈における腎臓マイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。

一方的な尿管閉塞を有するマウス腎臓におけるマイクロRNA表現の定量リアルタイムPCR評価

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

この方法により、腎線維症などの広範囲の病理的状態を有するマウスの腎臓にマイクロRNA発現を提供することができる。この技術の主な利点は、時間を節約し、技術的なエラーを防ぐ簡単なプロセスを使用して、高精度かつ感度でマイクロRNA発現プロファイリングを可能にすることです。恥ずかしの手術を行うには、外科的なはさみとピンセットを使用して腹部の皮膚を切開し、膀胱から肋骨の左端まで筋肉と腹膜を切断する。PBSで綿棒2本を湿らせ、腸を慎重に横に引っ張ります。湿らせた綿棒を置いて、左腎臓と尿管を識別します。腹膜を閉じ、4-0ナイロンで切開します。一方的な尿道閉塞、またはUUOを行うには、腹部の皮膚に切開を行い、恥の手術のために示されるように筋肉と腹膜を切断します。マウスの下に2.5ミリリットルの注射器を置きます。PBSで綿棒を2本湿らせ、ピンセットで腸を慎重に横に引っ張り、綿棒を置いて左尿管を識別します。ピンセットを使用して左腎臓を持ち上げます。4-0シルクを使用して、約1センチメートル離れた2つの場所で左尿管をリゲートします。2つの結紮の中心点で尿管を切り、4-0ナイロン縫合糸を使用して腹膜と切開部を閉じます。腹膜を切断した後、先に示したように、ピンセットでそれを持ち上げ、上端で横方向の切開を行うために外科用のはさみを使用し、その後、肋骨の最も低い端に沿って切開を続ける。左腎臓を識別し、腎臓が黄白になるまでPBSでそれを還流します。左腎動脈と静脈を外科用ハサミで切断して腎臓を取り除き、ペトリ皿に入れ、PBSで慎重に洗います。外科用ハサミとピンセットで腎臓を約10ミリグラムのサンプルに切り、腎臓の各部分を独自の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに入れ、チューブのキャップを閉じます。シリコーンホモジナイザーに腎臓サンプルを入れ、フェニル/グアニジンベースのリシス試薬を700マイクロリットル添加します。ホモジナイザーの害虫を腎臓サンプルに対してゆっくりと押してねじり、ホモジナイズを均質化します。サンプルが溶解試薬に完全に溶解するまで押し、ねじれを繰り返します。さらに試料を均質化するには、ホモゲン化したリセートを生体高分子スピンカラムに移し、Gを14,000回Gで3分間回転させ、沈殿したライセートを未使用の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。チューブ内のライセートと140マイクロリットルのクロロホルムを組み合わせ、チューブをしっかりとキャップします。ライセートとクロロホルムを混合するには、チューブを15回反転する。サンプルを室温で2〜3分間インキュベートし、摂氏4度で15分間Gの12,000倍に回転させます。沈殿物を乱すことなく、上澄み液を新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、100%エタノールの体積の1.5倍を加えます。混合物を5秒間渦液します。サンプル700マイクロリットルを2ミリリットルの回収チューブの膜固定スピンカラムに積み込みます。カラムキャップを閉じ、Gの15,000倍の位置で15秒間回転させ、集塵したライセートを回収管に捨てる。2ミリリットルの回収チューブの膜固定スピンカラムに700マイクロリットルの洗浄バッファー1を加えてサンプルを十分に洗浄します。その後、遠心分離を繰り返し、コレクションチューブを捨てる。洗浄ごとに500マイクロリットルの洗浄バッファー2で2回洗浄を繰り返します。最後の洗浄後、膜固定スピンカラムを2ミリリットルのコレクションチューブで15,000倍Gで1分間回転させ、沈殿したライセートを捨てる。膜固定スピンカラムを新しい1.5ミリリットルチューブに移します。カラムに30マイクロリットルのRNaseフリー水を加えてRNA全体を溶解し、カラムキャップを閉じ、室温で5分間放置します。その後、15,000回Gで1分間列を回転させます。全RNAを含むサンプルを氷上の新しいマイクロ遠心分離管に移し、分光光測定により全RNAの濃度を測定します。原稿の方向に従ってマスターミックス溶液を準備し、8ウェルチューブストリップの各チューブに8マイクロリットルを追加します。RNAの全密度を調整した後、各チューブに12マイクロリットルのRNAのアリコートを入れ、キャップを閉じます。チューブを15秒間遠心分離します。チューブをサーモサイクラーに入れ、摂氏37度で60分間インキュベートします。終了したら、すぐにcDNAの合成のために摂氏95度で5分間インキュベートします。cDNAを新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、蒸留水で10回希釈します。渦および遠心分離管を5秒間、次に、テキスト原稿に記載されているように定量的リアルタイムPCRを行う。このプロトコルは、体重20〜25グラムの8週齢の雄マウスで左尿管結紮を介して一方的な尿道閉塞マウスモデルを作成するために使用された。4-0シルク縫合糸による二重結紮により、尿管は完全に妨害された。腎臓は手術後8日間で採取された。マイクロRNA qRT-PCRデータは、マイクロRNA 3070-3pのレベルが有意に増加し、マイクロRNAのレベル、7218-5pおよびマイクロRNA 7219-5pがコントロールと比較してUUOマウスの腎臓で減少したことを示した。このプロトコルを試みるとき、腎臓サンプルがフェニル/グアニジンベースの溶解試薬に完全に溶解するまで、腎臓サンプルを繰り返して、良好なRNA抽出を達成することを忘れないでください。

quantitative-real-time-pcr-evaluation-microrna-expressions-mouse

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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