条件付き Stat3 欠損マウスモデルの骨格表現型解析
July 3rd, 2020
このプロトコルは、生体内の破骨細胞活性を制御する重要な遺伝子を理解するための正規的方法を記述する。この方法は、トランスジェニックマウスモデルといくつかの正規の手法を用いて骨格表現型を分析する。
遺伝子改変マウスモデルは、in vivoでヒトの疾患のメカニズムを研究するための強力なツールです。マウスの骨格表現型の解析は、骨格研究の基礎です。この粒子は、骨格組織の研究に不慣れな人にとって興味深いかもしれない骨格表現型を分析するためのいくつかの典型的な手法を説明しています。
この粒子を試すときは、動物実験には時間がかかるため、短期的には必要でなくても、各実験でできるだけ多くの高品質のサンプルを採取してください。安楽死させたマウスを仰臥位に置き、手で両側の股関節をそっと脱臼させることから始めます。眼科用ハサミを使用して、遠位脛骨から皮膚を垂直に切り取り、後肢からすべての皮膚を取り除きます。
右股関節と膝関節の関節靭帯をハサミで切断し、後肢を分離します。次に、両端で骨を切断して、骨を4%PFAに完全に浸します。転子と腓骨の接合部を切断します。
後肢を4%PFAに浸し、右後肢をパラフィン切片化のために保持します。左の股関節と膝関節の関節靭帯をハサミで切断し、軟部組織をやさしく取り除きます。脛骨と大腿骨を分離し、75%エタノールに別々に浸します。
大腿骨はマイクロCTスキャン用に、脛骨はカルセインとアリザリンの赤い二重標識のために保管してください。パラフィン切片を調製するには、固定された右後肢をPBSで3回、1回の洗浄につき10分間穏やかに洗浄します。次に、骨が曲がることができるまで超音波脱灰剤を使用して15%EDTAで3〜4週間脱灰し、1日おきに脱灰液を交換します。
脱灰後、標本をPBSで3回洗浄し、摂氏4度の75%エタノールに一晩浸します。2日目に、試料を95%エタノール、100%エタノール、キシレンにそれぞれ1時間連続して浸します。試料をキシレンとパラフィンの半分に30分間浸し、次に摂氏65度のパラフィンに一晩浸します。
標本を埋め込むには、パラフィンに沈め、大腿骨と脛骨を90度の角度で置きます。パラフィンが完全に冷えたら、試料を埋め込みタンクから取り出します。番号を付けて、摂氏マイナス20度で一晩保管します。
パラフィン切片を摂氏65度で30分間焼き、次にキシレンに10分間浸してワックスを塗ります。毎回新鮮なキシレンでセクションを3回浸します。切片を100%エタノール、95%エタノール、70%エタノール、蒸留水にそれぞれ5分間連続して浸して再水和します。
TRAP染色キットを使用して染色液を調製し、37°Cに温めます。各切片に50〜100マイクロリットルの染色液を加え、摂氏37度の湿ったチャンバーで20〜30分間インキュベートします。破骨細胞の染色状態を5分おきに光学顕微鏡で確認し、赤い多核破骨細胞が見えるようにします。
その後、水で反応を終了します。切片をヘマトキシリン溶液で30秒間対比染色し、1%アンモニア溶液に1分間浸すことで安定した青色を作ります。次に、ゆっくりと流れる水道水ですすいでください。
中性バルサムのカバースリップを使用してセクションを取り付け、一晩乾燥させます。顕微鏡で3〜5つの視野をキャプチャし、画像J.直線ツールを使用してスケールバーの長さをL1として測定するために、小柱の周囲を分析します。次に、セグメント化されたラインツールを使用して、小柱の周囲の長さをL2として測定します。物理的な長さを計算し、3つ以上の核を持つTRAP陽性細胞の数をカウントします。固定後、PBSで脛骨を3回穏やかに洗浄し、標本を95%エタノール、100%エタノール、キシレンにそれぞれ5分間順次浸します。
試料をアセトンに12時間浸し、アセトンと樹脂に半分ずつ2時間浸し、乾燥オーブンで一晩純粋な樹脂に浸します。適切なシリカゲル包埋タンクに純粋な樹脂を加え、気泡を避けて試料をタンクに入れます。60°Cの乾燥オーブンで48時間重合します。
試料を回転式ミクロトームで厚さ5マイクロメートルに連続的に切断し、残りの試料を乾燥剤で室温で保存します。75%エタノールの滴にピンセットで切片を接着し、中性バルサムを使用してカバースリップでそれらをマウントします。赤と緑の蛍光標識を蛍光顕微鏡で捕捉します。
破骨細胞特異的なStat3欠失マウスを作製し、破骨細胞の分化に対するStat3欠失の影響を研究しました。大腿骨再建術とマイクロCTによる定量解析により、Stat3 Ctskマウスの骨量は野生型マウスと比較して増加したことが示されました。野生型マウスとStat3 Ctskマウスの大腿骨の組織形態をH染色とE染色により調べた。
破骨細胞形成活性は、TRAP染色を用いて検出した。破骨細胞は、複数の核を持つ大きなTRAP陽性細胞です。TRAP陽性破骨細胞の数は、野生型マウスと比較してStat3 Ctskマウスの方が少なく、Stat3欠損が破骨細胞の形成を損なっていることを示しています。
骨形成は、カルセインとアリザリンの赤色の二重標識で測定されました。カルセインとアリザリンの赤い蛍光の間の領域は、新しく形成された骨を表しています。破骨細胞で欠失したStat3は、骨同化作用に影響を与えませんでした。
軟骨が後に対称的になった矢状パラフィン切片は、ここでは明確なM字型の線が使用されていることを示しました。研究では、機械的特性など、骨格系の特性をさらに含めます。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
本研究は、遺伝子工学によるマウスモデルを使用して、破骨細胞活性における重要な遺伝子の役割を探ります。このプロトコルは、骨格表現型の分析技術を概説し、高品質の生物学的サンプルの重要性を強調しています。
主要な研究構成要素
研究分野
- 骨生物学
- 破骨細胞分化
- 骨リモデリングの遺伝子制御
背景
- 骨格健康における破骨細胞の重要性
- ヒトの疾患のモデル化にトランスジェニックマウスの使用
- 厳密な実験プロトコルの必要性
使用された方法
- 様々な組織学的技術を用いた骨格分析
- トランスジェニックマウスモデル（Stat3 Ctskマウス）
- 骨形成測定のためのTRAP染色、マイクロCTスキャン、および二重ラベリング
主要な結果
- Stat3欠損は破骨細胞形成を減少させました
- 野生型と比較してStat3 Ctskマウスの骨量増加
- この研究は、破骨細胞分化における遺伝子の役割を検証し、骨量調節のメカニズムを示唆しています
結論
- この研究は、遺伝子制御が破骨細胞の挙動と全体的な骨の健康にどのように影響するかを示しています。
- これらの知見は、骨損失に関連する疾患の治療アプローチに重要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding osteoclast-specific gene function enables mechanistic de-risking in bone-targeted therapeutic development. Conditional knockout models provide predictive confidence for target validation by isolating cellular contributions to bone remodeling. This approach supports preclinical assessment of anabolic versus catabolic pathway modulation in osteoporosis drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis regarding STAT3's role in osteoclast differentiation and bone resorption.
- Operational Value: Enables functional target validation through cell-specific genetic ablation in vivo.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by linking STAT3 loss to reduced osteoclast formation and increased bone mass.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (bone tissue) for downstream assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Generates quantitative outputs (TRAP+ cell count, bone area, microCT metrics) for reliable compound evaluation.
- Scientific Value: Facilitates screening readiness through standardized histology and imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant system continuity from genetic target modulation to skeletal phenotype.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by measuring both resorption (TRAP) and formation (calcein/alizarin) endpoints.
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into bone mass regulation via osteoclast-specific pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports discovery biology through hypothesis testing of osteoclast-intrinsic gene function and pathway clarification in bone homeostasis.
- Discovery Biology: Explains how conditional deletion supports hypothesis testing of STAT3 in osteoclasts and biological de-risking of resorption targets.
- Screening: Describes assay readiness via standardized tissue preparation and quantitative histomorphometry for compound screening.
- Analytics: Highlights microCT, TRAP staining, and dual-labeling as quantitative readouts that enable cross-condition comparison of bone phenotype.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to preclinical continuity through integrated resorption and formation analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for validating osteoclast-specific targets in bone disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in osteoclast regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of skeletal phenotyping workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in bone therapeutics.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on on-target mechanism validation.
Implementation Considerations
- Required expertise in mouse genetics, bone histology, and microCT analysis.
- Instrumentation needs include microtome, fluorescence and light microscopes, microCT scanner, and decalcification equipment.
- Cross-team standardization requires harmonized staining protocols and imaging analysis between histology and in vivo teams.
- Adaptation considerations across model systems include verifying Cre specificity and compensatory pathways in other osteoclast models.
- Practical limitations include time-intensive decalcification and sectioning, and potential developmental compensation in constitutive models.
