Name: 植物マイクロRNAの検出と定量のためのRNAブロット分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 41 s
Description: 学ぶ植物マイクロRNAの検出と定量のためのRNAブロット分析法。15%アクリルアミドゲルを用いて20-24ヌクレオチドの小RNAを高解像度で検出し、次世代シーケンスデータの検証に有用です。

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著者らは、ホスト研究所とBRITが提供する放射線ラボへのアクセスを認めている。PVS研究所は、国立生物科学センター、タタ基礎研究所、助成金(BT/PR12394/AGIII/103/891/2014;;BT/IN/スイス/47/JGK/2018-19;BT/PR25767/GET/119/151/2017) インド政府バイオテクノロジー省から。MPは、DBT研究アソシエイトシップ、DBT、インド政府を認めています。

1. 15%変性ポリアクリルアミドゲルの調製
<ol><li>尿素の4.8 gを加え、40%アクリルアミドの3.75 mLを加え、ビサクリアミド(19:1)溶液と10x TBE pH 8.2の1 mLを無菌50 mLチューブに加えます。</li>
	<li>60°Cにセットした水浴を用いて尿素を透明な溶液に溶かします。</li>
	<li>オートクレーブされた新しい滅菌水を使用して体積を10 mLにメイクアップし、ゲルミックスを室温まで冷却します。</li>
	<li>新鮮な10%(w/v)過硫酸アンモニウム溶液を調製します。</li>
</ol>2. ガラス板と電気泳動ユニットの組み立て
<ol><li>ゲル電気泳動と電気ブロッティングに必要な装置をすべて洗剤で洗います。柔らかいスポンジを使ってやさしくこすり、残留バッファーとアクリルアミドを取り除き、水で洗い流し、乾燥させます。</li>
	<li>両方のガラス板を一緒に組み立て、スポンジの上にしっかりと置きます。このセットアップには厚さ1mmのプレートを使用してください。漏れを避けるために、プレートが同じレベルであることを確認してください。</li>
	<li>10 mLのゲルミックスに、8 μLのTEMEDと80 μLの新鮮な10%(w/v)過硫酸アンモニウム溶液を加えます。</li>
	<li>遅滞なく、組み立てられたガラス板の間に静かに混ぜて注ぎます。櫛を慎重に置きます。このステップでは気泡の発生を避けてください。</li>
	<li>ゲルを約45分間重合します。</li>
	<li>ゲルランニングセットアップの内側に入れる前に、滅菌水で重合したゲルを洗浄してください。</li>
	<li>ランニングカセットの中にプレートを組み立て、くしをそっと取り外します。</li>
	<li>作りたての無菌1x TBE、pH 8.2をタンクに注ぎます。</li>
	<li>塩結晶を除去するためにバッファーをピペット化して井戸を慎重に洗浄します。このステップは、RNAサンプルがゲル全体を均一に実行するのに役立ちます。</li>
	<li>80 Vで30分間前走を行います。</li>
</ol>3. 積載染料とサンプルの調製
<ol><li>ゲルローディング色素の10 mLの場合、5mgのブロモフェノールブルー、キシレンシアノール5mgを量り、10mLの脱イオン化ホルムアミドを慎重に加え、よく混ぜます。</li>
	<li>アリコート10 μgの全RNAを無菌1.5 mLチューブに入れ、speedvacを使用してサンプルを乾燥させます。サンプルを過度に乾燥させないでください。</li>
	<li>8 μLの荷重でRNAサンプルを再中断します。</li>
	<li>98°Cで2分間加熱し、RTで1分間冷却し、サンプルを回転させ、3回回転させます。このステップは、適切な再懸濁のために不可欠であり、順番にこれは、サンプルの等しい負荷に役立ちます。</li>
</ol>4. ゲル電気泳動
<ol><li>事前実行を停止し、サンプルローディングの前に井戸を洗います。</li>
	<li>98°Cでサンプルを1分間加熱し、毛細管の先端を使用してサンプルを井戸に熱くロードします。サンプルがウェル内の1つの薄い層を占めるように、先端を井戸の底に挿入します。</li>
	<li>すべてのサンプルの完全な読み込み。RNA 10年マーカーをロードすることを含む。</li>
	<li>ブロモフェノールブルー染料がほぼ完全に実行されるまで、ゲルを80 Vで実行します。ブロモフェノールブルーは、15%変性アクリルアミドゲルで10 bpで実行されます。</li>
</ol>5. エレクトロブロッティングの準備
<ol><li>N+ナイロン膜をガラス板の寸法に切り、右上の隅にHB鉛筆でラベルを付けます。</li>
	<li>滅菌水の表面に静かに膜を置き、ラベル付けされた側を水面に向けます。膜を15分間あらかじめ浸します。</li>
	<li>4枚のブロッティングペーパーIをファイバーパッドの寸法にカットする。</li>
	<li>カセットのグレーの側面を清潔なトレイに入れるためのゲルサンドイッチを準備します。</li>
	<li>繊維パッドをあらかじめ濡らし、カセットの上に置きます。気泡を取り除く。</li>
	<li>1x TBEで1枚のブロッティングペーパーを事前に濡らし、ファイバーパッドの上に置きます。プラスチック製のピペットを紙の上に転がして気泡を取り除きます。別の濡れたブロッティングペーパーを置き、気泡を取り除きます。</li>
	<li>実行中のカセットからゲルを慎重に取り出し、最初にロードされたRNAサンプルが右側に向かうよう、サンドイッチのセットアップの上に置きます。</li>
	<li>1x TBEに浸した膜をそっと浸し、ラベル付きの側面を下に向けてゲルの上に置きます。ロールアウトして気泡を取り除きます。</li>
	<li>ブロッティング紙を1枚浸し、膜の上に置き、気泡を取り除きます。別のブロッティングペーパーを浸し、サンドイッチのセットアップの上に置き、気泡を取り除きます。</li>
	<li>セットアップの上にプリウェットファイバーパッドを置き、しっかりとカセットを閉じてサンドイッチを完成させます。</li>
	<li>トランスブロットカセットをモジュールに入れ、1x TBE、pH 8.2をブロッティングマークまで充填します。</li>
	<li>10 Vで、一晩4°Cで移動する。</li>
	<li>転写後、湿った膜を紙シートに置き、254nm UV光(120,000 μjoules/cm²)を照射してRNAを膜に直ちにクロスリンクします。架橋ブロットは、さらにハイブリダイゼーションのために4°Cで保存される可能性があります。</li>
</ol>6. 放射性標識プローブの調製
<ol><li>検出される小さなRNAと完全に相補的なプローブを設計します。</li>
	<li>表1に示すレシピに従ってコンポーネントを組み合わせることにより、ƳP32ATP(BRITから取得)を使用してプローブにラベルを付けます。</li>
	<li>上記の反応混合物を30分間37°Cでインキュベートする。</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従ってSephadex G-25カラムを使用して、非ラベルのƳP32ATPをプローブから分離します。</li>
</ol>7. ブロットのハイブリダイゼーション
<ol><li>交差したブロットを、RNA側はハイブリダイゼーションボトルの中に上に向けます。</li>
	<li>超高感度ハイブリダイゼーションバッファーを激しく混合し、10 mLを加え、35°Cで維持したハイブリダイゼーションオーブン内のブロットを回転でインキュベートします。</li>
	<li>20分間の事前ハイブリダイゼーションを行います。</li>
	<li>オーブンからボトルを取り出し、ラベル付きプローブをそっとハイブリダイゼーションバッファに追加します。</li>
	<li>35°Cでブロットをハイブリダイズし、12時間回転させます。</li>
	<li>ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション溶液を15 mLチューブに慎重に移します。この溶液は、再使用するまで4°Cで保存することができます。</li>
	<li>2x SSCバッファーに0.5%SDSを加えて過剰なハイブリダイゼーション溶液を除去するために、2分間のブロットのクイック洗浄を行います。ソリューションを破棄します。</li>
	<li>2x SSCバッファーに0.5%のSDSを加えた35°Cでブロットをインキュベートし、30分間回転させます。</li>
	<li>0.5x SSCバッファーに0.5%SDSを加えた35°Cで再びブロットを洗浄し、30分間回転させます。</li>
	<li>ブリダイゼーションカバーの中にブロットを入れ、余分なバッファーを取り除き、密封します。</li>
	<li>カセット内の一晩の放射線フリー蛍光体イメージャースクリーンに公開します。</li>
	<li>生体分子画像を用いてハイブリダイゼーション信号を検出し、適切なソフトウェアを用いて結果を解析する。</li>
	<li>80 °Cでインキュベートしてブロットを取り除き、0.5 X SSCバッファに0.1%SDSと0.1 X SSCバッファに加えて0.1%SDCバッファを30分間30分間回転させます。</li>
</ol>

<ol><li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431, 356-363 (2004).</li>
<li>Anushree, N., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Plant+miRNA+Biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Indian+National+Science+Academy%22%5BJournal%5D)">Regulation of Plant miRNA Biogenesis.</a> Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).</li>
<li>Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+sequence+signature+is+essential+for+robust+plant+miRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , (2020).</li>
<li>Chen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((22-Nucleotide+RNAs+trigger+secondary+siRNA+biogenesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).</li>
<li>Shivaprasad, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+superfamily+regulates+nucleotide+binding+site-leucine-rich+repeats+and+other+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs.</a> Plant Cell. 24, 859-874 (2012).</li>
<li>Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraordinary+transgressive+phenotypes+of+hybrid+tomato+are+influenced+by+epigenetics+and+small+silencing+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs.</a> The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).</li>
<li>Akbergenov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+geminivirus-derived+small+RNAs+in+different+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species.</a> Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).</li>
<li>Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR828+and+miR858+regulate+VvMYB114+to+promote+anthocyanin+and+flavonol+accumulation+in+grapes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes.</a> Journal of Experimental Botany. , (2019).</li>
<li>Li, C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Small+RNAs+by+Northern+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).</li>
<li>Swetha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+domestication-related+phenotypes+in+indica+rice+are+due+to+loss+of+miRNA-mediated+laccase+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing.</a> The Plant Cell. , (2018).</li>
</ol>

利益相反は宣言されていません。

この方法は、あまり豊富なmiRNAを含む小さなRNAの検出および定量化に広く使用することができる。プロトコルは主に、ローディングバッファー内の全RNAを変量するステップ、ゲル電気泳動によるサイズ分離、膜へのRNAの伝達、RNAを膜に架橋し、所望の放射性標識されたオリゴプローブを使用してハイブリダイズするステップを記述する。
ブロッティング実験の重要なステップは、サンプル調製のための良質のRNAの使用です。ゲルをロードする前に、サンプルが自由に流れ、負荷の先端に固執していないことを確認する必要があります。サンプルをロードする間は注意が必要ですが、サンプルがウェル内の1つの薄い層を占めているように、先端は井戸の底のすぐ上に挿入する必要があります。ハイブリダイゼーションオーブンの温度は、非常に少ない豊富なmiRNAの検出のために35°Cで維持されなければなりません。ブロットのハイブリダイゼーションを繰り返す場合は、2倍のSSCで湿気を保ち、4°Cで保存してください。
この方法は、多糖類およびポリフェノール<sup class="xr...

最近の小さな規制RNAの発見, マイクロRNA, それらを理解する研究をリードし、植物や動物でのそれらの役割1.miRNAの長い前駆体はHYL1および特異的なダイサー様タンパク質22、33によって21〜24nt成熟したmiRNAに処理される。22 nt miRNA は、二次 siRNA4を生成することによってカスケードサイレンシングを開始できます。研究は、開発におけるmiRNAおよび二次siRNAの役割を示している, 細胞の運命とストレス応答5,,6.
ノーザンハイブリダイゼーションは、特定のRNA分子を検出するために日常的に採用されている実験的方法である。このメソッドは、合計 RNA7のプールから約 19 -24 nt 長い小さな RNA の検出での使用をカスタマイズします。このデモでは、miRNAの検出と定量にこの手法を用いるための方法を示します。この方法では、放射性同位元素を使用したプローブのラベリングを使用します。したがって、サンプル中のmiRNAレベルは、感度の向上とともに検出することができる。PCRベースの方法とは異なり、この方法は、miRNAのサイズ決定だけでなく、発現の定量を保証します。このプロトコルでは、miRNA検出を改善する重要なステップを示します。miRNAの高分解能信号検出を得るためのブロッティングとハイブリダイゼーションのステップを修正しました。この技術はまた、siRNA、タシ二次RNAおよびスノRNAのような他の内因性小さいRNAを検出するために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>40% アクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液</td><td>Sigma</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム (APS)</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>あぶらとり紙</td><td>whatmann あぶらとり紙 I</td><td>1001-125</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>毛細管ローディングのヒント</td><td>BioRad</td><td>2239915</td><td></td></tr><tr><td>脱イオン化ホルムアミド</td><td>アンビオン</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>ヒーティング ブロック</td><td>エッペンドルフ</td><td>5350</td><td></td></tr><tr><td>ハイボンド N+ナイロン膜</td><td>GE</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーション ボトル</td><td>シグマ</td><td>Z374792-1EA</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーション オーブン</td><td>サーモ サイエンティフィック</td><td>1211V79</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)</td><td>シグマ</td><td>T7024-25ml</td><td></td></tr><tr><td>フォスファーイメージャーGE</td><td>-台風スキャナー</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>フォスファーイメージャースクリーンとカセット</td><td>GEヘルスケア</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr>ピ<tr><td>ペット</td><td>ギルソン、モデル:P20およびP10</td><td>FA10002M、FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックピペット</td><td>ファルコン</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>ポリアクリルアミドゲル装置</td><td>BioRad</td><td>1658003EDU</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 カラム</td><td>GE ヘルスケア</td><td>27532501</td><td></td></tr><tr><td>スピード Vac コンセントレーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>20-548-130</td><td></td></tr><tr><td>Spinwin</td><td>Tarsons</td><td>1010</td><td></td></tr><tr><td>T4 ポリヌクレオチドキナーゼ (PNK)</td> <td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>トランスブロット装置</td><td>BioRad</td><td>1703946</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAHybハイブリダイゼーション</td><td>バッファー Ambion</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>15985</td><td></td></tr><tr><td>UV架橋剤</td><td>UVP</td><td>CL-1000L</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>ターソン</td><td>3020</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>NEOLAB</td><td>D-8810</td><td></td></tr><tr><td>キシレンシアノール</td><td>Sigma</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr></tbody></table>

植物マイクロrnaの検出と定量のためのrnaブロット分析

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

マイクロRNA(miRNA)は、植物および動物の両方における遺伝子発現の調節に関与する内因的に非コード的に発現するクラスであり、〜21nt小さいRNAである。ほとんどのmiRNAは、主要遺伝子を標的とする遺伝子発現の陰性スイッチとして機能します。植物では、一次miRNA(プリミRNA)転写産物はRNAポリメラーゼIIによって生成され、プレミRNAと呼ばれる安定したステムループ構造の様々な長さを形成する。エンドヌクレアーゼ、Dicer-like1は、プレミRNAをmiRNA-miRNA*二重鎖に処理します。miRNA-miRNA*二重鎖からストランドの1つを選択し、アルゴノート1タンパク質またはそのホモログにロードして、標的mRNAの切断を仲介する。miRNAは主要なシグナル伝達分子ですが、それらの検出は、感度の高いノーザンブロット分析ではなく、最適なPCRベースの方法よりも低い方法で行われることが多い。我々は、文字通り、任意の植物組織から、非常に高感度でmiRNAレベルの定量に最適である、シンプルで信頼性の高い、非常に敏感な北部の方法を記述します。さらに、この方法は、miRNAとその前駆体のサイズ、安定性および存在量を確認するために使用することができる。

このデモでは、インディカ米の異なる組織におけるmiR397の発現を検出し、定量化した(図1)。miR397は22のnt miRNAおよび保存されたmiRNAである。miR397の発現は、テストされたすべてのサンプルで検出することができます。次世代シーケンシングデータに従って、サンプル1(苗組織)は100万回当たり5読み(rpm)でmiR397を有する。我々は、その信号を快適に検出し、この方法が非常に敏感であり、非常に低い豊富なmiRNAを検出するために使用できることを示した。今回の実験では、読み込みコントロールとして miR168 とU6を使用しました。
このブロット(図1)では、ImageJを用いて信号の強度を定量した。miR397の発現は、栄養葉鞘において最も高い。
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この方法は、全RNA抽出物からmiRNAを検出するためのノーザンハイブリダイゼーション技術の使用を実証する。

植物マイクロRNAの検出と定量のためのRNAブロット分析

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

こんにちは。だから、これは小さなRNA北部プロトコルです。これは、もともとラシッド・アクベルゲノフ博士によって最適化されたプロトコルの派生物です。この方法では、20〜24ヌクレオチドの間の任意の場所の小さなRNAを非常に正確かつ非常に高い分解能で検出することができます。プロトコルは基本的に伝統的な北部分析の変更された形態ですが、ここではアクリルアミドの割合が非常に高く、15%です。この北部は、既に知られている小さなRNA、マイクロRNAまたは小さなRNAの他のセットのいずれかを検出するために使用することができ、配列が既知であるか、または次世代シーケンシングデータセットから来る小さなRNAの豊富さの確認に使用することができる。この方法の利点は、マイクロRNAの存在量だけでなく、前駆体の豊富さも見ることができないこと、例えばマイクロRNAは、30前後の前駆体を数百ヌクレオチド長くしてもよく、これはまた、マイクロRNAと共に同時に検出することができる。プロトコルは非常に単純で、非常に単純ですが、このプロトコルの最後に記載されている重要な手順を実行する間は非常に慎重でなければなりません。10 mLゲルミックスの調製のために、尿素4.8グラム、40%アクリルアミド溶液の3.75 mL、および1 mLの新たに調製した10X TBE、pH 8.2を加え、溶液を穏やかに混合します。尿素を完全に溶解し、水浴中に混合物を加熱することにより、溶液が透明になるまで溶解する。滅菌ミリQ水を使用して、10 mLにボリュームを構成し、室温にゲルミックスを冷却します。必要な装置を洗剤で洗い、静かにスクラブして残留TBEとアクリルアミドを除去します。さらに、MilliQ水ですすい、乾燥させます。ガラス板を一緒に組み立て、両方が同じレベルにあることを確認します。スポンジの上にしっかりと置きます。8マイクロリットルのTEMEDと80マイクロリットルの10%で作りたてのAPSをゲルミックスに加えます。そっと混ぜて、組み立てたプレートにゲルミックスを注ぎます。ゲルが漏れないようにします。櫛を慎重に置きます。ゲルを約45分間重合させます。ゲルを重合した後、組み立てからガラス板を取り除きます。グラスプレートをミリク水で洗います。そして、実行中のカセットにそれらを置きます。走行中のカセットをタンク内に置きます。作りたての1X TBE、pH 8.2を注ぎます。櫛を慎重に取り外します。バッファーをピペット処理してゲルのウェルを十分に洗います。このステップは、ウェルから尿素の沈殿物を除去し、ゲルを横切って均一に走るようにRNAを容易にします。装置の蓋を閉め、空のゲルを80ボルトで30分間事前に実行し、バッファ漏れを確認する。10 mLの負荷染料の調製のために、5mgのブロモフェノールブルー、キシレンシアノール5mgを量り、10mLの脱ioinedホルムアミドを加え、よく混ぜます。アリコート染料を4度で保存して、さらに使用します。アリコート 10 マイクログラムの全 RNA を無菌 1.5 mL チューブに入る。RNAの品質、すなわち、260:230 の比率は 2 以上または 2 に近い。チューブをspeedVacの中に入れ、サンプルを真空乾燥させます。乾燥したRNAサンプルを8マイクロリットルの負荷染料で再懸濁します。サンプルを98度で2分間加熱します。室温で1分間冷やします。冷却されたRNAサンプルをボルテックスして、負荷染料中の適切な再懸濁液を確保する。チューブを回転させます。自由に流れるRNAを得るために3回加熱、冷却および渦のステップを繰り返します。ゲルのプレランを停止します。サンプルをロードする前に井戸を十分に洗い、ウェル内の尿素の堆積物を取り除きます。再懸濁したRNAサンプルを98度で1分間加熱します。毛細管の先端を使用して井戸に熱いサンプルをロードします。気泡の導入は避けてください。すべてのサンプルの完全なローディングと蓋を組み立てます。ゲルを80ボルトで3時間、またはブロモフェノールブルーが完全に実行されるまで実行します。正に帯電したナイロン膜を転写に使用してください。ガラス板の寸法に切ります。右上隅にある膜にラベルを付けます。滅菌ミリQ水の表面にそっと膜を置き、ラベル側を下向きに置き、水面に面します。きれいなトレイを取り、電気転送のためのゲルサンドイッチを準備します。カセットの灰色の側を下に置きます。カセットのレベルをわずかに上回る1X TBEを注ぎます。1X TBEでファイバーパッドをプリウェットし、それを絞って気泡を取り除きます。ブロッティング紙を2枚切って、ファイバーパッドの大きさにします。1X TBEにブロッティングペーパーをあらかじめ濡らし、ファイバーパッドの上に置きます。プラスチック製のピペットを紙の上に転がして気泡を取り除きます。1X TBEで別のブロッティングペーパーを事前に濡らし、カセットの上に置きます。ロールオーバーして気泡を取り除きます。これでサンドイッチのセットアップは、電気転送の準備ができています。電気泳動が完了した後、走行を停止し、装置から蓋を取り外します。セットアップから実行中のカセットを取り外します。ランニングカセットからガラス板を取り出します。ゲルをアセンブリから慎重に取り除きます。最初にロードされたRNAサンプルがあなたの右に向かになるように、ブロッティングペーパーの上に置きます。1X TBEに浸した膜を静かに浸し、ラベル付きの側面を下に向けてゲルの上に置きます。膜とゲルを乾燥させないでください。気泡を取り除くために穏やかにロールオーバーします。1X TBEに1枚のブロッティングペーパーを浸し、膜の上に置きます。気泡を取り除く。別のブロッティング紙を置き、気泡を取り除きます。アセンブリの上に繊維パッドを置くことによってサンドイッチを完了します。カセットをしっかりと閉じます。モジュールにトランスブロットカセットを入れる。1X TBE、pH 8.2、ブロッティングマークまでタンクを充填します。装置の蓋を閉め、4度または冷たい部屋で一晩10ボルトで移します。UVクロスリンカーを準備し、電気転送が完了する直前に1200に設定します。転送が完了したら、カセットをモジュールから取り出します。湿った膜をA4シートの上に置き、マークされた側面を上に置きます。120ミリジュールで254ナノメートルのUV光を照射することにより、RNAを膜に架橋する。架橋ブロットは、4度で保存されるか、ハイブリダイゼーションに使用することができる。検出する必要がある小さなRNAに完全に無料のプローブを設計します。PNK酵素を用いてプローブを5つのプライムエンドにラベル付けし、図のように成分を組み合わせます。反応混合物を37度で30分間インキュベートする。インキュベーションの30分後にG-25カラムを使用して、反応混合物から非標識プローブを分離した。プローブのラベル付けを改善するには、使用前にG-25カラムを準備します。ブロット、RNA側向きの上部、ハイブリダイゼーションボトルの内側に置きます。使用前にハイブリダイゼーションバッファーを激しく混合します。ハイブリダイゼーションバッファーを10 mL内部に加え、ハイブリダイゼーションボトルをハイブリダイゼーションオーブン内に置き、回転とともに35度に維持します。20~30分間の事前ハイブリダイゼーションを行います。プレハイブリダイゼーション後、オーブンからボトルを取り除きます。標識されたプローブをハイブリダイゼーションバッファに緩やかに追加します。気泡が作成されないことを確認します。オーブン内のブロットを35度で12時間回転させてインキュベートします。ハイブリダイゼーション後、ボトルからハイブリダイゼーションバッファーを取り除きます。洗浄バッファー I を使用して、ブロットのクイック洗浄を実行します。このステップは、過剰なハイブリダイゼーション溶液をブロットから除去するために行われる。さらに洗浄バッファーIを使用して30分間35度でブロットをインキュベートする。35度で30分間、バッファIIを使用して別の洗浄を行います。ブロットを洗浄した後、ハイブリダイゼーションカバーの中に入れ、余分なバッファーを取り除き、密封します。カセットの中に置き、放射線フリーのホスホイメージャースクリーンに12時間露出させます。台風バイオ分子イメージャーを用いてハイブリダイゼーション信号を検出し、ImageJソフトウェアを用いて解析します。他のプローブとのブロットのハイブリダイゼーションについては、図のようにストリッピング手順を実行します。この技術を使用すると、マイクロRNAの豊富さと長さを推定することができます。この画像から、マイクロRNA397の発現は、全てのサンプルにおいて検出され得る。このブロットでは、サンプル1の豊富さは、次世代シーケンシングデータに従って100万回あたり約5読み取りであり、我々の技術はあまりにもあまり豊富なマイクロRNAを検出できることを示唆している。また、ImageJ定量化ソフトウェアを用いることで、サンプルの中でマイクロ397の発現を定量することができる。ここでは、U6とマイクロRNA 168をローディングコントロールとして使用しています。実験の実行中に考慮しなければならない重要なステップについて話します。サンプル調製には、良質のRNAを使用してください。サンプルを真空乾燥しながら、過剰に乾燥しないようにしてください。ローディング色素中のRNAの再懸濁液は非常に重要です。自由な流れのサンプルを準備することを確認してください。ゲルを装填する間は注意が必要です。ゲルのウェルを洗浄する必要があり、サンプルはウェル内の直線にロードする必要があります。電気移動の間、膜を水中に広げ、1XTBEに浸す直前には必須であり、転写性が向上する。ブロットのハイブリダイゼーションは35度で行う必要があります。ハイブリダイゼーションオーブンの温度を維持します。ブロットの繰り返し使用のために、膜は4度で保存されなければなりません。彼らは2X SSEで湿った状態に保たれるべきです。他のPCRベースの方法とは異なり、この方法は、発現の定量化だけでなく、マイクロRNAのサイズの決定を保証します。

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Biochemistry

生物化学

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植物マイクロRNAの検出と定量のためのRNAブロット分析

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