植物マイクロRNAの検出と定量のためのRNAブロット分析

こんにちは。だから、これは小さなRNA北部プロトコルです。これは、もともとラシッド・アクベルゲノフ博士によって最適化されたプロトコルの派生物です。

この方法では、20〜24ヌクレオチドの間の任意の場所の小さなRNAを非常に正確かつ非常に高い分解能で検出することができます。プロトコルは基本的に伝統的な北部分析の変更された形態ですが、ここではアクリルアミドの割合が非常に高く、15%です。この北部は、既に知られている小さなRNA、マイクロRNAまたは小さなRNAの他のセットのいずれかを検出するために使用することができ、配列が既知であるか、または次世代シーケンシングデータセットから来る小さなRNAの豊富さの確認に使用することができる。

この方法の利点は、マイクロRNAの存在量だけでなく、前駆体の豊富さも見ることができないこと、例えばマイクロRNAは、30前後の前駆体を数百ヌクレオチド長くしてもよく、これはまた、マイクロRNAと共に同時に検出することができる。プロトコルは非常に単純で、非常に単純ですが、このプロトコルの最後に記載されている重要な手順を実行する間は非常に慎重でなければなりません。10 mLゲルミックスの調製のために、尿素4.8グラム、40%アクリルアミド溶液の3.75 mL、および1 mLの新たに調製した10X TBE、pH 8.2を加え、溶液を穏やかに混合します。

尿素を完全に溶解し、水浴中に混合物を加熱することにより、溶液が透明になるまで溶解する。滅菌ミリQ水を使用して、10 mLにボリュームを構成し、室温にゲルミックスを冷却します。必要な装置を洗剤で洗い、静かにスクラブして残留TBEとアクリルアミドを除去します。

さらに、MilliQ水ですすい、乾燥させます。ガラス板を一緒に組み立て、両方が同じレベルにあることを確認します。スポンジの上にしっかりと置きます。

8マイクロリットルのTEMEDと80マイクロリットルの10%で作りたてのAPSをゲルミックスに加えます。そっと混ぜて、組み立てたプレートにゲルミックスを注ぎます。ゲルが漏れないようにします。

櫛を慎重に置きます。ゲルを約45分間重合させます。ゲルを重合した後、組み立てからガラス板を取り除きます。

グラスプレートをミリク水で洗います。そして、実行中のカセットにそれらを置きます。走行中のカセットをタンク内に置きます。

作りたての1X TBE、pH 8.2を注ぎます。櫛を慎重に取り外します。バッファーをピペット処理してゲルのウェルを十分に洗います。

このステップは、ウェルから尿素の沈殿物を除去し、ゲルを横切って均一に走るようにRNAを容易にします。装置の蓋を閉め、空のゲルを80ボルトで30分間事前に実行し、バッファ漏れを確認する。10 mLの負荷染料の調製のために、5mgのブロモフェノールブルー、キシレンシアノール5mgを量り、10mLの脱ioinedホルムアミドを加え、よく混ぜます。

アリコート染料を4度で保存して、さらに使用します。アリコート 10 マイクログラムの全 RNA を無菌 1.5 mL チューブに入る。RNAの品質、すなわち、

260:230 の比率は 2 以上または 2 に近い。チューブをspeedVacの中に入れ、サンプルを真空乾燥させます。乾燥したRNAサンプルを8マイクロリットルの負荷染料で再懸濁します。

サンプルを98度で2分間加熱します。室温で1分間冷やします。冷却されたRNAサンプルをボルテックスして、負荷染料中の適切な再懸濁液を確保する。

チューブを回転させます。自由に流れるRNAを得るために3回加熱、冷却および渦のステップを繰り返します。ゲルのプレランを停止します。

サンプルをロードする前に井戸を十分に洗い、ウェル内の尿素の堆積物を取り除きます。再懸濁したRNAサンプルを98度で1分間加熱します。毛細管の先端を使用して井戸に熱いサンプルをロードします。

気泡の導入は避けてください。すべてのサンプルの完全なローディングと蓋を組み立てます。ゲルを80ボルトで3時間、またはブロモフェノールブルーが完全に実行されるまで実行します。

正に帯電したナイロン膜を転写に使用してください。ガラス板の寸法に切ります。右上隅にある膜にラベルを付けます。

滅菌ミリQ水の表面にそっと膜を置き、ラベル側を下向きに置き、水面に面します。きれいなトレイを取り、電気転送のためのゲルサンドイッチを準備します。カセットの灰色の側を下に置きます。

カセットのレベルをわずかに上回る1X TBEを注ぎます。1X TBEでファイバーパッドをプリウェットし、それを絞って気泡を取り除きます。ブロッティング紙を2枚切って、ファイバーパッドの大きさにします。

1X TBEにブロッティングペーパーをあらかじめ濡らし、ファイバーパッドの上に置きます。プラスチック製のピペットを紙の上に転がして気泡を取り除きます。1X TBEで別のブロッティングペーパーを事前に濡らし、カセットの上に置きます。

ロールオーバーして気泡を取り除きます。これでサンドイッチのセットアップは、電気転送の準備ができています。電気泳動が完了した後、走行を停止し、装置から蓋を取り外します。

セットアップから実行中のカセットを取り外します。ランニングカセットからガラス板を取り出します。ゲルをアセンブリから慎重に取り除きます。

最初にロードされたRNAサンプルがあなたの右に向かになるように、ブロッティングペーパーの上に置きます。1X TBEに浸した膜を静かに浸し、ラベル付きの側面を下に向けてゲルの上に置きます。膜とゲルを乾燥させないでください。

気泡を取り除くために穏やかにロールオーバーします。1X TBEに1枚のブロッティングペーパーを浸し、膜の上に置きます。気泡を取り除く。

別のブロッティング紙を置き、気泡を取り除きます。アセンブリの上に繊維パッドを置くことによってサンドイッチを完了します。カセットをしっかりと閉じます。

モジュールにトランスブロットカセットを入れる。1X TBE、pH 8.2、ブロッティングマークまでタンクを充填します。装置の蓋を閉め、4度または冷たい部屋で一晩10ボルトで移します。

UVクロスリンカーを準備し、電気転送が完了する直前に1200に設定します。転送が完了したら、カセットをモジュールから取り出します。湿った膜をA4シートの上に置き、マークされた側面を上に置きます。

120ミリジュールで254ナノメートルのUV光を照射することにより、RNAを膜に架橋する。架橋ブロットは、4度で保存されるか、ハイブリダイゼーションに使用することができる。検出する必要がある小さなRNAに完全に無料のプローブを設計します。

PNK酵素を用いてプローブを5つのプライムエンドにラベル付けし、図のように成分を組み合わせます。反応混合物を37度で30分間インキュベートする。インキュベーションの30分後にG-25カラムを使用して、反応混合物から非標識プローブを分離した。

プローブのラベル付けを改善するには、使用前にG-25カラムを準備します。ブロット、RNA側向きの上部、ハイブリダイゼーションボトルの内側に置きます。使用前にハイブリダイゼーションバッファーを激しく混合します。

ハイブリダイゼーションバッファーを10 mL内部に加え、ハイブリダイゼーションボトルをハイブリダイゼーションオーブン内に置き、回転とともに35度に維持します。20~30分間の事前ハイブリダイゼーションを行います。プレハイブリダイゼーション後、オーブンからボトルを取り除きます。

標識されたプローブをハイブリダイゼーションバッファに緩やかに追加します。気泡が作成されないことを確認します。オーブン内のブロットを35度で12時間回転させてインキュベートします。

ハイブリダイゼーション後、ボトルからハイブリダイゼーションバッファーを取り除きます。洗浄バッファー I を使用して、ブロットのクイック洗浄を実行します。このステップは、過剰なハイブリダイゼーション溶液をブロットから除去するために行われる。

さらに洗浄バッファーIを使用して30分間35度でブロットをインキュベートする。35度で30分間、バッファIIを使用して別の洗浄を行います。ブロットを洗浄した後、ハイブリダイゼーションカバーの中に入れ、余分なバッファーを取り除き、密封します。

カセットの中に置き、放射線フリーのホスホイメージャースクリーンに12時間露出させます。台風バイオ分子イメージャーを用いてハイブリダイゼーション信号を検出し、ImageJソフトウェアを用いて解析します。他のプローブとのブロットのハイブリダイゼーションについては、図のようにストリッピング手順を実行します。

この技術を使用すると、マイクロRNAの豊富さと長さを推定することができます。この画像から、マイクロRNA397の発現は、全てのサンプルにおいて検出され得る。このブロットでは、サンプル1の豊富さは、次世代シーケンシングデータに従って100万回あたり約5読み取りであり、我々の技術はあまりにもあまり豊富なマイクロRNAを検出できることを示唆している。

また、ImageJ定量化ソフトウェアを用いることで、サンプルの中でマイクロ397の発現を定量することができる。ここでは、U6とマイクロRNA 168をローディングコントロールとして使用しています。実験の実行中に考慮しなければならない重要なステップについて話します。

サンプル調製には、良質のRNAを使用してください。サンプルを真空乾燥しながら、過剰に乾燥しないようにしてください。ローディング色素中のRNAの再懸濁液は非常に重要です。

自由な流れのサンプルを準備することを確認してください。ゲルを装填する間は注意が必要です。ゲルのウェルを洗浄する必要があり、サンプルはウェル内の直線にロードする必要があります。

電気移動の間、膜を水中に広げ、1XTBEに浸す直前には必須であり、転写性が向上する。ブロットのハイブリダイゼーションは35度で行う必要があります。ハイブリダイゼーションオーブンの温度を維持します。

ブロットの繰り返し使用のために、膜は4度で保存されなければなりません。彼らは2X SSEで湿った状態に保たれるべきです。他のPCRベースの方法とは異なり、この方法は、発現の定量化だけでなく、マイクロRNAのサイズの決定を保証します。