ヒト人工多能性幹細胞から誘導されるインビトロ神経筋接合
2020年12月3日
ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)からインビトロNJを生成するプロトコルを提供します。この方法は、成熟した形態と機能を有するMJを1ヶ月で単一のウェルで誘導することができる。結果として生じるNmJは、関連する疾患のモデル化、病理学的メカニズムの研究、または治療のための薬物化合物のスクリーニングに使用される可能性がある。
このヒト神経筋接合誘導システムは、運動ニューロン、骨格筋、シュワン細胞を含むシナプス前およびシナプス後の成分の形成を誘導するために使用することができる。成熟した複雑なNMJ構造は、単一の開始細胞集団から単一の培養皿で得られるだけでなく、得られたNMJは収縮する能力も有する。この方法は、脊髄性筋萎縮症などの神経筋疾患を研究し、治療的な化合物スクリーニングを行う可能性を秘めています。
分化されたNMJは非常に厚く、複雑な組織であり、視覚化することは困難です。この手順をデモンストレーションすることで、特定の構造を特定する方法を読者に指示できます。ペトリ皿に1ミリリットルの細胞剥離液を加える前に、PBSの3ミリリットルで細胞を洗います。
摂氏37度で10分後、霊長類胚性幹細胞培地3ミリリットルを各ウェルに加え、軽くピペットを3回加えて、カバーリップから細胞を解離する。次に、分離した幹細胞含有上清を遠心分離用の50ミリリットル円錐形チューブにプールし、10マイクロモルY-27632 ROCK阻害剤を添加した新鮮な霊長類胚性幹細胞培地の3ミリリットルで幹細胞ペレットを再懸濁する。その後、ROCK阻害剤濃度を補った培地1ミリリットル当たり5細胞に細胞を2倍10倍希釈し、細胞外マトリックスコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルの各カバースリップに2ミリリットルの細胞を戻します。
24時間後、各ウェルの上澄み液を、ドキシサイクリンのミリリットル当たり1マイクログラムで補った新鮮な霊長類胚性幹細胞培地の2ミリリットルに置き換え、プレートを細胞培養インキュベーターに24時間戻す。インキュベーションの終了時に、上清を1ウェル当たりドキシサイクリンを添加した分化培地2ミリリットルに置き換え、プレートを細胞培養インキュベーターに10日間戻します。インキュベーションの終了時に、上清をウェル当たりドキシサイクリンを添加した2ミリリットルの筋原性分化培地に置き換え、さらに10日間プレートを細胞培養インキュベーターに戻す。
インキュベーションの終わりに、上清をウェルあたり2ミリリットルの神経筋接合剤培地に置き換え、プレートを細胞培養インキュベーターに30日間戻します。インキュベーションの終了時に、逆顕微鏡による分化された神経筋接合部を可視化します。筋管収縮を引き起こすには、分化した神経筋接合細胞の各ウェルに25ミリモル塩化カルシウムを加える。
そして、治療の1〜2分以内に、逆顕微鏡のステージ上にプレートを置きます。ライブ細胞顕微鏡を用いて、20秒間、筋管収縮の動画を記録する。記録の最後に、培養培地に1ミリリットル当たり300ナノグラムを添加し、ムービーを20秒間記録してから、ムービーファイルを適切なモーションベクトル解析ソフトウェアプログラムで開いて分析します。
神経フィラメントシナプス血管およびアセチルコリン受容体の免疫蛍光染色は、ニューロンを同定するために行うことができる。運動ニューロンはTUJ 1と膵門1染色によって同定することができ、シナプス後筋管はミオシン重鎖の染色によって同定することができる。シュワン細胞は、S-100抗体で標識することができる。
これらの走査型電子顕微鏡画像では、成長した軸索末端、軸索、および筋線維の明確な可視化により、成熟した神経筋接合の形態を観察することができる。透過電子顕微鏡は、シナプス小胞を有するシナプス前軸索末端およびシナプス裂裂によって分離されたシナプス後領域を含む神経筋成分の成熟した超構造を可視化するために使用することができる。接合折り目は、ニューロンと筋線維の間の接合部をマークします。
ここでは、シナプス小胞を含む成熟した軸索末端が示されている。まとめると、これらの形態学的特徴は、神経筋成分が十分に誘発され、成熟したことを示す。細胞の機能的評価は、顕著な神経筋接合運動信号が塩化カルシウムによって誘発され、これらの収縮は、運動ニューロン信号が神経筋接合部を介して伝達され、筋肉収縮を引き起こすことを確認することによって中断することができることを明らかにする。
細胞の播種密度はNMJ形成の効率に影響を与える。実験目的に従って、プロトコルに適応するように変更することができる。この神経筋接合部培養は複数の細胞タイプを含み、これらの成分は、神経筋接合の発達中または特定の疾患病理に応答してこれらの細胞間の相互作用を研究するために使用することができる。
概要
本プロトコルでは、ヒト人工多能性幹細胞（iPSC）からin vitroで神経筋接合部（NMJ）を作製する方法について説明します。この手法により、1か月以内に機能的な能力を持つ成熟したNMJを構築することが可能となり、疾患モデリングや薬物スクリーニングのための有用なツールを提供します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 再生医療
背景
- NMJ（神経筋接合部）は、筋肉の収縮と運動機能にとって極めて重要です。
- NMJの研究は、神経筋疾患に関する知見を提供します。
- ヒトiPSCは、NMJ研究のための再生可能なソースとなります。
- 現在のNMJ作製法は、複雑で時間がかかることが多いです。
研究目的
- iPSCからのNMJ形成のための効率的なプロトコルを開発すること。
- 神経筋疾患の研究を促進すること。
- 治療的介入のための薬剤スクリーニングを可能にすること。
使用した手法
- iPSCをNMJ構成要素へと分化させるための細胞培養技術。
- 成熟を促進するための特定の培地およびサプリメントの使用。
- 神経および筋肉の構成要素を同定するための免疫蛍光染色。
- NMJの活性および収縮を評価するための機能的アッセイ。
主な結果
- 機能性を備えた成熟した神経筋接合部（NMJ）が正常に形成されました。
- 塩化カルシウムにより、筋管の収縮が誘導されました。
- キュラーレによって筋肉の収縮が効果的に遮断され、NMJの機能性が確認されました。
- イメージング技術により、NMJの詳細な形態が明らかになりました。
結論
- 本プロトコルは、iPSCからNMJを生成するための信頼性の高い手法を提供する。
- 本システムは、NMJの発達における相互作用の研究に利用できる。
- 潜在的な応用例として、疾患のモデリングや治療化合物の試験などが挙げられる。
よくある質問
業界における重要性
iPSCから誘導されたこのin vitroヒト神経筋接合部（NMJ）モデルは、神経筋疾患のメカニズムの研究および治療化合物の評価に生理学的に適したシステムを提供します。シナプス前成分と後成分を機能的な結合とともに統合することで、本モデルは初期探索段階におけるターゲットのバリデーションとメカニズムの低リスク化を支援します。1ヶ月という成熟期間と堅牢な機能的リードアウトにより、リード化合物の同定に向けたスケーラブルなアッセイ開発と、トランスレーショナルリサーチにおける予測精度の向上が可能になります。
バイオファーマR&Dにおける戦略的活用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： ヒューマンリレバントなシステムで神経筋接合部（NMJ）の形成と機能をモデル化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値： 運動ニューロン、骨格筋、およびシュワン細胞の相互作用を統合的に評価し、生物学的なリスク低減を支援する。
- 予測的価値： NMJの完全性と収縮反応の定量的な読み取り値を提供することで、ポートフォリオの優先順位付けを促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： NMJ活性に結びついた機能的エンドポイントを備えた、化合物スクリーニングのための標準化され再現性のあるプラットフォームを提供します。
- 運用的価値： 1枚の培養皿内の単一のiPSC出発集団を用いて、スケーラブルなマルチウェル形式のアッセイを可能にします。
- アッセイの準備状況： ハイコンテンツスクリーニングに適した、収縮および抑制反応を検出可能な成熟したNMJを生成します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：ヒトのNMJの病態生理と薬物反応をモデル化することで、基礎研究から前臨床検証への橋渡しをします。
- メカニズムによるリスク低減：定義された遺伝的背景を用いて、脊髄性筋萎縮症などの疾患モデルにおけるNMJの破綻を研究することが可能です。
- リスク調整後の進展：in vivoでの筋肉神経支配と相関するNMJの機能的リードアウトに基づいた、Go/No-go判断を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲットバリデーションからリード化合物の同定、そして前臨床有効性試験に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、神経筋肉研究において再利用可能なヒトへの適合性が高いシステムを提供します。
- 基礎生物学研究：遺伝的または毒性物質誘発性の疾患モデルにおいて、神経筋接合部（NMJ）の形成、維持、および機能不全に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング：機能的な収縮および抑制のリードアウトを備えた、アッセイ可能なNMJを提供し、神経筋伝達に対する化合物の影響を評価します。
- 分析：筋管の運動性と薬理学的抑制に関する定量的なデータを生成し、実験条件下での比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：ヒト特有の神経筋相互作用および病理をモデル化することで、iPSC由来のNMJを前臨床段階へと繋げます。
- 企業での再利用：複数の神経筋疾患の適応症やスクリーニングキャンペーンに適用可能な、スケーラブルな多能性幹細胞由来のプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： NMJを標的とした治療薬開発におけるメカニズムの曖昧さを軽減し、予測の信頼性を向上させる。
- 運用の価値： 定義された単一ディッシュ分化プロトコルにより、標準化と再現性を高める。
- 戦略的価値： 神経筋接合部の欠陥を早期に検出することを可能にし、後期段階での失敗リスクを低減させることで、資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響： NMJの機能的アウトカムおよび標的エンゲージメントに基づき、リスク調整後の化合物の優先順位付けに寄与する。
実施上の検討事項
- ヒトiPSCの培養、分化、および神経筋生物学に関する専門知識が必要です。
- 特殊な培地、添加剤（ドキシサイクリンおよびROCK阻害剤を含む）、および細胞外マトリックスでコーティングした基質に依存します。
- 細胞の播種密度、培地の変更、および機能アッセイのタイミングに関する標準化されたプロトコルが必要です。
- 異なるiPSCラインや疾患モデルの遺伝的背景に合わせてスケールを調整する際の適応を考慮する必要があります。
- 厚い多層組織の形成によりイメージングが困難となるため、高度な顕微鏡観察が必要になるなどの実用的な制限があります。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) Culture
2:00
iPSC Differentiation
3:04
Neuromuscular Junction (NMJ) Muscle Contraction and Curare Treatment
3:47
Results: Representative NMJ Phenotypic, Morphological, and Functional Characterization
5:20
Conclusion
