Name: 髄膜炎菌 人工多能性幹細胞由来脳内皮細胞の感染 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶiPSC由来脳内皮細胞を用いた髄膜炎菌感染モデルの構築法。血脳関門における宿主病原体相互作用を解析し、中枢神経系感染症の治療戦略開発に貢献する。

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L.M.E.は、A.S-U.に授与された「ヒト病原体による微生物感染を研究するための3D組織モデル」と題されたDFG研究トレーニングプログラムGRK2157によってサポートされています。B.J.K.は、アレクサンダー・フォン・フンボルト財団のポスドク研究員の支援を受けています。さらに、培養におけるiPS細胞-BECの作製における技術支援を行ったLena Wolter氏に感謝します。

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著者は何も開示していません。

BECとBBBのモデリングには課題があり、一次および不死化ヒトBECは、in vitroでは頑健なバリア表現型を欠く傾向があります。ヒト幹細胞技術の出現により、内皮マーカー、タイトジャンクション発現、バリア特性、他のCNS細胞タイプへの応答、機能的排出トランスポーターなどの期待される特徴的なBBB表現型を保持するiPS細胞由来のBEC様細胞の作製が可能になりました12,13,14,15, 22, 24, 25。これにより、研究者はin vivo BECを厳密に模倣したin vitroでBECを利用し、BBB機能障害が報告さ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61400">Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Leo M. Endres1 
Alexandra Schubert-Unkmeir1 
Brandon J. Kim1,2 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of W&#252;rzburg 
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
to:
Leo M. Endres1 
Sarah F. Hathcock2 
Alexandra Schubert-Unkmeir1 
Brandon J. Kim1,2 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of W&#252;rzburg 
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61400">Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

血液脳関門(BBB)と髄膜血液CSF関門(mBCSFB)は、循環と中枢神経系(CNS)を分離する非常にタイトな細胞関門であり、主に高度に特殊化された脳内皮細胞(BEC)で構成されています1,2。BECは、多くの毒素、薬物、病原体を排除しながら、脳内外の栄養素や老廃物を調節することで、適切な脳の恒常性を維持しています1,2。細菌性髄膜炎は、血液媒介細菌がBECによって形成されたバリアと相互作用して貫通し、炎症を引き起こすことができる場合に発生します。髄膜炎菌(Nm、髄膜炎菌)は、健康な人の10〜40%の鼻咽頭にコロニーを形成するグラム陰性菌ですが、場合によっては重篤な全身性疾患を引き起こす可能性があります3。罹患した個人では、Nmは血流にアクセスして紫斑病の劇症を引き起こしたり、髄膜炎を引き起こす中枢神経系へのアクセスを得るBECに侵入したりする可能性があります3。Nmは世界中の細菌性髄膜炎の主な原因であり、ワクチン接種の努力にもかかわらず、依然として髄膜炎の主な原因です4。抗生物質治療などの現代の医学的介入により、これらの状態は生存可能になりましたが、髄膜炎に罹患した人は、多くの場合、永続的な神経学的損傷が残ります5,6。
これまでの研究では、Nm-BEC相互作用に寄与する細菌因子と宿主シグナル伝達が特定されています7,8,9,10,11。同定されたアドヒシンや、混濁タンパク質Opc、IV型線毛などの侵入因子、およびCD147などの受容体は、in vitroでさまざまなBECモデルで実施されていますが、これらのモデルには多くの決定的なBBB特性がありません7,9,11,12。Nm-BEC相互作用の完全な理解は、in vivoモデルを利用できないこと、ワクチン接種防御が不完全であること、in vitroで頑健なヒトBECモデルがないことなどにより、依然としてとらえどころのないままです。
in vitroでのhBECのモデリングは、BECのユニークな特性のために困難でした。末梢内皮細胞と比較して、BECは、複雑なタイトジャンクション12による高い経内皮電気抵抗(TEER)など、バリア特性を強化する多くの表現型を有する。一旦脳微小環境から取り除かれると、BECは急速にバリア特性を失い、弱いバリアしか形成しない一次モデルや不死化in vitroモデルの有用性が制限される12,13。Nm感染のヒト特異性、頑健なin vivoモデルの欠如、およびin vitroでのヒトBECのモデリングの課題が組み合わさることで、NmとBECの間の複雑な宿主と病原体の相互作用を理解するためのより良いモデルの必要性が生じています。最近では、モデルヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)技術を用いて、in vivoでBECをよりよく模倣したiPS細胞からBEC様細胞が作製されています12,13,14,15。iPS細胞-BECはヒト由来であり、拡張が容易であり、一次または不死化の対応物と比較して予想されるBEC表現型を持っています12,13,14,15。さらに、iPS細胞-BECは、宿主と病原体の相互作用、ハンチントン病、アラン・ハーンドン・ダドリー症候群の原因となるMCT8欠損症など、中枢神経系の様々な疾患のモデル化に有用であることを実証しています16,17,18,19,20,21.ここでは、再生可能なiPS細胞からiPS細胞BECを誘導する方法と、iPS細胞BECにNmを感染させることで自然免疫応答が活性化する様子を紹介します。このモデルは、他のin vitroモデルでは再現できない宿主と病原体の相互作用を調べるのに有用であり、Nmなどのヒト特異的な病原体との相互作用を調べる場合に特に有用であると考えています。

<table><tbody><tr><td>Accutase (1x)</td><td>Sigma</td><td>A6964</td><td>酵素細胞解離試薬</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>オールトランスレチノイン酸 (RA)</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>抗CD31 (PECAM-1)</td><td>Thermo Scientific (Labvision)</td><td>RB-10333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Claudin-5</td><td>Invitrogen</td><td>4C3C2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Glut-1</td><td>Thermo Scientific (Labvision)</td><td>SPM498 (MA5-11315)</td><td></td></tr><tr><td>抗オクルージン</td><td>Invitrogen</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>抗VE-カドヘリン</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-52751</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>33-9100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Proteose Peptone</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>b-メルカプトエタノール</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレートおよびフラスコ</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Class II バイオセーフティキャビネット</td><td>Nuaire</td><td>NU-437-400E</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター(DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator)</td><td>Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>コロンビアエイジャー+ 5%羊の血液</td><td>Biomerieux</td><td>43049</td><td></td></tr><tr><td>Costar Transwellポリエステルフィルター(12ウェルまたは24ウェル)</td><td>Corning</td><td>3460、3470</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Merck(Sigma-Aldrich)</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ROTH</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>上皮電圧オーム計 (Millicell ERS-2) with STX electrode</td><td>Merck (Millipore)</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NO3)3</td><td>ROTH</td><td>5632.1</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>シグマ</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡 (Eclipse Ti)</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤 (Neubauer)</td><td>A. Hartenstein</td><td>ZK06</td><td></td></tr><tr><td>ヒト基本線維芽細胞増殖因子 (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM)</td><td>Gibco</td><td>11111-044</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡 (Wilovert)</td><td>Hund (Will Wetzlar)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iPS(IMR90)-4 cells</td><td>WiCell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ケロッグのサプリメント</td><td></td><td></td><td>110mlを調製するには、100mlの4g / mlグルコース、0.1g / mlグルタミン、0.2mg / mlのチアミンピロリン酸と10mlの5mg / mlFe(NO3)3を準備し、溶液を組み合わせます。フィルター滅菌し、-20°Cで分注して保存します。</td></tr><tr><td>ノックアウト血清置換 (KOSR)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン (GlutaMAX)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kit</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>cDNA synthesis kit</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ROTH</td><td>4627.5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ROTH</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット (Research Plus)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>ROTH</td><td>6329</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA Isolation kit</td><td>Machery-Nagel</td><td>740955</td><td>RNA isolation kit</td></tr><tr><td>Pipette boy (Accu-Jet Pro)</td><td>ブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血小板乏血漿由来血清、ウシ (PDS)</td><td>Fisher</td><td>50-443-029</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25742</td><td>qPCR Master mix</td></tr><tr><td>qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4211971</td><td></td></tr><tr><td>qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>ROCK阻害剤、Y27632 二塩酸塩</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR サーモサイクラー (StepOnePlus)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StemFlex 基礎培地 + 50x StemFlex サプリメント</td><td>Gibco</td><td>A3349401</td><td>幹細胞維持培地</td></tr><tr><td>スイングバケットローター (Heraeus #2704)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チアミンピロリン酸</td><td>シグマ</td><td>C8754-5G</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液、0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-033</td><td>非酵素細胞解離試薬(EDTA)</td></tr></tbody></table>

髄膜炎菌 人工多能性幹細胞由来脳内皮細胞の感染

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

髄膜炎菌性髄膜炎は、髄膜炎菌(髄 膜 炎菌、Nm)が高度に特殊化された脳内皮細胞(BEC)を貫通することにより中枢神経系(CNS)にアクセスできるときに発生する生命を脅かす感染症です。Nmはヒト特異的な病原体であるため、堅牢な in vivo モデルシステムがないため、NmとBEC間の宿主と病原体の相互作用の研究は困難であり、ネイティブBECを模倣するヒトベースのモデルの必要性が確立されています。BECは、複雑なタイトジャンクションと高い経内皮電気抵抗(TEER)を特徴とする末梢内皮細胞と比較して、より厳しいバリア特性を持っています。しかし、一次BECや不死化BECなどの多くの in vitro モデルは、天然の神経微小環境から除去した後、バリア特性を欠くか、急速に失われます。近年のヒト幹細胞技術の進歩により、人工多能性幹細胞(iPS細胞)から脳様内皮細胞を誘導する方法が開発され、他の in vitro ヒトモデルと比較して表現型コピーBECが優れています。iPS細胞由来BEC(iPS細胞-BEC)を用いてNm-BEC相互作用をモデル化すると、BECバリア特性を持つヒト細胞を利用できるという利点があり、バリア破壊、自然免疫活性化、細菌間相互作用を調べることができます。ここでは、iPS細胞からiPS細胞-BECを誘導する方法と、細菌の調製、感染、解析のためのサンプル採取の方法を紹介します。

ここで説明するプロトコルは、Stebbinsらから採用され、iPS細胞をBBB特性を持つ脳様内皮細胞に分化させるプロセスと、このモデルをNm19,22のiPSC-BECを用いた感染症研究に利用する方法に焦点を当てています。iPS細胞-BECは、適切に分化すれば、TEERで測定した2000 Ωcm2を超えるタイトなバリア特性を示し、VEカドヘリンやCD31(PECAM)などの内皮マーカーを発現します(図1A\u2012C)。さらに、タイトジャンクションマーカーであるクローディン-5、オクルジン、ZO-1(図1 D-2012F)、およびGlut-1(図1G)などのトランスポーターを発現および局在化します。Nmに感染すると、iPS細胞-BECは、IL-8(<em...

ここに記述されているプロトコルは伝染のための Neisseriaの髄膜炎 の準備、および他の分子分析のためのサンプル収集を分化させる誘導された多能性幹細胞によって得られる脳そっくりのendothelialセル、準備の主要なステップを強調する。

Meningococcal meningitis is a life-threatening infection that occurs when Neisseria meningitidis (meningococcus, Nm) can gain access to the central ...

このプロトコルは、iPSC由来の脳様内皮細胞を使用して、髄膜血液CSF関門などの血液脳関門での宿主病原体の相互作用を、in vivoで脳内皮細胞をよりよく模倣できるモデルで調べる方法を示しています。脳内皮細胞のバリア特性やヒト特異的な病原体との相互作用のin vitro試験は、モデリングの限界により困難な場合があります。iPS細胞由来の脳内皮細胞は、優れたバリア表現型を持ち、ヒト由来であるため、これらのアプリケーションに特に有用です。人工多能性幹細胞(iPSC)を、2ミリリットルの幹細胞維持培地を備えた6ウェルプレートで摂氏37度、二酸化炭素5%に維持します。細胞を継代するには、コンフルエントでないウェルから培地を吸引し、1ミリリットルの非酵素的細胞解離試薬を添加します。次に、プレートを摂氏37度で7分間インキュベートします。その間、新しい6ウェルプレート上のマトリックスゲル溶液を、ウェルあたり2ミリリットルの新鮮な幹細胞維持培地と交換します。細胞解離試薬は、プレートに付着したままの細胞を吸引しないように注意して吸引します。ウェルの底を6ミリリットルの幹細胞維持培地ですすいで、すべての細胞が完全に剥がれるまで洗い流します。新しい6ウェルプレートに、さまざまな密度(通常は1〜6、または通常のメンテナンスの場合は1〜12)で播種します。プレートを前後左右に振って、媒体が落ち着くまで交互に振る動作の合間に一時停止します。それからそれをインキュベーターに入れます。各ウェルに1ミリリットルの酵素細胞解離試薬を加え、プレートを摂氏37度で7分間インキュベートします。細胞解離試薬を不活性化するには、細胞懸濁液の1ミリリットルを、少なくとも2ミリリットルの新鮮な幹細胞維持培地を入れた15ミリリットルのチューブに移します。細胞懸濁液を1500 Gで5分間スピンダウンします。次に、細胞ペレットを1ミリリットルの幹細胞維持培地に再懸濁し、血球計算盤で細胞をカウントします。12ミリリットルの幹細胞維持培地および10マイクロモル岩石阻害剤に第5細胞に10の7.5倍を再懸濁する。T75フラスコからマトリックスを吸引し、細胞懸濁液をフラスコに移します。フラスコを振って細胞を分散させ、インキュベーターに入れます。次の2日間は毎日培地をリフレッシュして、岩石阻害剤を除去し、幹細胞コロニーの成長をサポートします。3日目に、メディアを無条件のメディアに変更して差別化を開始します。次の 5 日間は、媒体を毎日交換します。分化開始から6日後、20ナノグラム/ミリリットルのbFGFと10マイクロモルのレチノイン酸を含む内皮細胞またはEC培地に切り替えて、内皮細胞集団を選択的に拡大します。細胞を2日間インキュベートします。原稿の指示に従ってIV点滴コラーゲンとフィブロネクチン溶液を調製し、細胞培養プレー

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

この方法では、マウスの脳から微小血管内皮細胞を分離し不死化する方法について説明します。我々は、脳組織、消化手順、播種し、細胞の不死化の均質化から始まるステップ·バイ·ステップのプロトコルを記述します。通常、それは均質、不死化血管内皮細胞株を得るために約5週間かかります。...

として不死化マウス脳微小血管内皮細胞株の生成<em&gt; in vitroで</em&gt;血液脳関門モデル

このビデオは、人工多能性幹細胞の脳内皮細胞への分化を誘導するプロトコルを示しています。...

人工多能性幹細胞からの脳内皮細胞の作製

このビデオでは、ヒトiPS細胞を脳の微小血管内皮細胞に分化するための多段階のプロセスを示しています。得られた分化細胞は、タイトジャンクションを特徴とする脳の微小血管内皮細胞に密接に類似しているため、脳疾患の研究に最適です。...

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出典: Parajuli, B., et.al.非侵襲的経鼻経路を経由する免疫担当マウス脳におけるヒト人工多能性幹細胞由来ミクログリアの移植J. Vis. 経験。(2022)。このビデオは、人工多能性幹細胞由来ヒトミクログリア(iPSMG)細胞のマウス脳への経鼻移植を示しています。ヒアルロニダーゼは、ミクログリアが枯渇したマウスの鼻孔に適用され、透過性を高めます。iPSMG懸濁液を鼻腔内に投与し、マウスを回復させます。成長因子が豊富な培地は、脳組織における iPSMG...

人工多能性幹細胞由来ヒトミクログリア細胞のマウス脳への経鼻移植

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インタビセナーリナーリ注射によるレプトメニンゲ細胞改変の誘導

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ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価

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ヒト人工多能性幹細胞由来ミクログリアの免疫適格マウス脳への非侵襲的経鼻経路による移植

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ヒト人工多能性幹細胞の成熟免疫表現型を有する脳微小血管内皮細胞様細胞への分化

学ぶiPSC由来脳内皮細胞を用いた髄膜炎菌感染モデルの構築法。血脳関門における宿主病原体相互作用を解析し、中枢神経系感染症の治療戦略開発に貢献する。

髄膜炎菌人工多能性幹細胞由来脳内皮細胞の感染

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