Name: インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学ぶ FRETを用いてATP結合をリアルタイムで測定する方法。膜タンパク質へのヌクレオチド結合を高感度でモニタリングし、ATP感受性カリウムチャネルの動態を解析する技術を習得できます。

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優れた技術支援を提供してくれたラウル・テロン・エクスポジトに感謝します。この研究は、バイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会(BB / R002517 / 1;MCPおよびFMA)およびウェルカムトラスト(203731 / Z / 16 / A;SGU)

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<li>Puljung, M., Vedovato, N., Usher, S., Ashcroft, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+mechanism+of+ATP-sensitive+K%28%2B%29+channels+explored+with+real-time+nucleotide+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Activation mechanism of ATP-sensitive K(+) channels explored with real-time nucleotide binding.</a> Elife. 8, 41103(2019).</li>
<li>Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+inhibition+of+the+pancreatic+ATP-sensitive+K%2B+channel+explored+with+patch-clamp+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Nucleotide inhibition of the pancreatic ATP-sensitive K+ channel explored with patch-clamp fluorometry.</a> Elife. 9, 52775(2020).</li>
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<li>Gordon, S. E., Senning, E. N., Aman, T. K., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+metal+ion+FRET+to+measure+short-range+distances+at+the+intracellular+surface+of+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transition metal ion FRET to measure short-range distances at the intracellular surface of the plasma membrane.</a> Journal of General Physiology. 147 (2), 189-200 (2016).</li>
<li>Heuser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+%27cell+cortices%27+for+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The production of 'cell cortices' for light and electron microscopy.</a> Traffic. 1 (7), 545-552 (2000).</li>
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<li>Colquhoun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding%2C+gating%2C+affinity+and+efficacy%3A+the+interpretation+of+structure-activity+relationships+for+agonists+and+of+the+effects+of+mutating+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Binding, gating, affinity and efficacy: the interpretation of structure-activity relationships for agonists and of the effects of mutating receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 125 (5), 924-947 (1998).</li>
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<li>Zheng, J., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+rearrangements+in+cyclic+nucleotide-gated+channels+revealed+by+patch-clamp+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry.</a> Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).</li>
<li>Zheng, J., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+fluorometry+recording+of+conformational+rearrangements+of+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+STKE%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels.</a> Science's STKE. 2003 (176), 7(2003).</li>
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<li>Kusch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdependence+of+receptor+activation+and+ligand+binding+in+HCN2+pacemaker+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels.</a> Neuron. 67 (1), 75-85 (2010).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-dependent+cAMP+binding+to+functioning+HCN+channels+studied+by+patch-clamp+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">State-dependent cAMP binding to functioning HCN channels studied by patch-clamp fluorometry.</a> Biophysical Journal. 100 (5), 1226-1232 (2011).</li>
<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K%2B+channel+with+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).</li>
<li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+internal+pore+opening+in+K%28V%29+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8272-8277 (2013).</li>
<li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S4-S5+linker+movement+during+activation+and+inactivation+in+voltage-gated+K%28%2B%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">S4-S5 linker movement during activation and inactivation in voltage-gated K(+) channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), 6751-6759 (2018).</li>
<li>Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HCN+channel+voltage+sensor+undergoes+a+large+downward+motion+during+hyperpolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 686-694 (2019).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+fluorometry-based+channel+counting+to+determine+HCN+channel+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp fluorometry-based channel counting to determine HCN channel conductance.</a> Journal of General Physiology. 148 (1), 65-76 (2016).</li>
<li>Hwang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanisms+of+CFTR+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structural mechanisms of CFTR function and dysfunction.</a> Journal of General Physiology. 150 (4), 539-570 (2018).</li>
<li>Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+structures+and+progress+toward+a+dynamic+understanding+of+KATP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy structures and progress toward a dynamic understanding of KATP channels.</a> Journal of General Physiology. 150 (5), 653-669 (2018).</li>
<li>Kasuya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+competitive+inhibition+of+the+ATP-gated+P2X+receptor+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the competitive inhibition of the ATP-gated P2X receptor channel.</a> Nature Communications. 8 (1), 876(2017).</li>
<li>Virginio, C., Robertson, G., Surprenant, A., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinitrophenyl-substituted+nucleotides+are+potent+antagonists+selective+for+P2X1%2C+P2X3%2C+and+heteromeric+P2X2%2F3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors.</a> Molecular Pharmacology. 53 (6), 969-973 (1998).</li>
<li>Bhargava, Y., Nicke, A., Rettinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+Alexa-647-ATP+as+a+powerful+tool+to+study+P2X+receptor+ligand+binding+and+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Validation of Alexa-647-ATP as a powerful tool to study P2X receptor ligand binding and desensitization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 438 (2), 295-300 (2013).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

我々は、インタクトな膜タンパク質へのアデニンヌクレオチド結合をリアルタイムで測定する方法を開発しました。私たちの方法は、アンバー終止コドン抑制12、セルアンルーフ14、電圧クランプ蛍光測定/ PCF 19,20,21,22,23,24,25を使用したANAPによるタンパク質の標識など、他のいくつかの確立された技術に基づいています.これらのアプローチの合成により、高い空間分解能および時間分解能でヌクレオチド結合の測定が可能になります。実際、以前の研究では、このアプローチを使用して、同じタンパク質複合体上の異なる結合部位を区別することができました10,11。重要なことに、この技術は、タンパク質機能を維持する条件下で、細胞環境中の少量のタンパク質に直接適用することができます。当社の結合法をイオンチャネル電流の直接的な電気生理学的読み出しと組み合わせて使用 することで、チャネルゲーティング11の分子基盤に関する豊富な洞察を得ることができます。
分光計は非標準の実験装置であるため、バンドパスフィルターを使用してANAP強度を相対的に絶縁して監視することもできます。 図5B は、このような2つのフィルタのスペクトル特性を示しています。470/10 nmバンドパスフィルターは、TNP-ATPからの蛍光シグナルを効果的に遮蔽し、ピークANAP蛍光とよく重なります。ただし、このフィルターのピーク透過率は約50%に過ぎないため、薄暗いメンブレン(または電圧クランプ下の切除メンブレンパッチ)から良好な信号を得ることが困難になる可能性があります。別のオプションは、460/60nmバンドパスフィルタです。470/10 nmフィルターと比較して、460/60 nmフィルターとTNP-ATP発光ピークの足の間にはわずかに多くのオーバーラップがあります。しかし、460/60nmのバンドパスは、ANAPピークの広い範囲で90〜95%の透過率を有し、蛍光発光シグナルを後押しすることが期待される。
ANAPは、環境に敏感な蛍光色素12、26、27です。ピーク発光および量子収率は、目的のタンパク質上の取り込み部位によって異なり、タンパク質の立体構造が変化するにつれて変化する可能性があります。このような変化は、発光スペクトルからすぐに明らかになりますが、フィルターを使用してANAP強度を測定する場合ほど明白ではありません。いずれにしても、ヌクレオチド結合後のANAP周辺の局所環境の変化のために蛍光シグナルが変化しないことを実証するには、適切なコントロールが必要です。非標識ヌクレオチドを用いた対照実験は、ANAP強度の変化がANAPとTNPヌクレオチドの間のFRETの結果であることを確認するのに役立ちます。TNPヌクレオチドは、トランスフェクトされていない細胞由来の膜(原形質膜または天然の膜タンパク質)に非特異的に結合することができます10。このシグナルは標識チャネルに特異的であるため、ドナー蛍光の減少として結合を定量化します。ただし、ドナー蛍光の変化が実際に標識受容体11への直接結合の結果であることを確認するために、各アゴニスト/受容体ペアに対して追加の対照実験(既知の場合はヌクレオチド結合部位を変異させるなど)を行うことをお勧めします。最後に、ANAPラベルに加えて蛍光タンパク質タグを含むコンストラクトを使用することをお勧めします。これは、標識された受容体蛍光をバックグラウンド/自家蛍光と区別するのに役立ちます。バックグラウンド蛍光は、発光スペクトル10のピークおよび形状によってANAPと区別することができるが、そのような決定は、フィルタセットのみが使用される場合、非常に困難であり得る。さらに、蛍光受容体を発現する細胞および屋根のない膜は、ANAPを励起することなく、過度の光退色のリスクなしに蛍光タンパク質タグを使用して識別できます。
PCF記録の多くでは、高いTNP-ATP濃度でスペクトルに強い負のピークが観察されました(図4C)。この負のピークは、バックグラウンド減算プロトコルのアーティファクトです。 図4D は、1 mM TNP-ATPに曝露したパッチピペットの明視野および蛍光画像を示す。ピペット壁の体積からTNP-ATPが排除されたためにピペットチップに影が見え、焦点面内で最も顕著になります。 図4E のスペクトル画像は、この影に対応する暗いバンドを示しています。この暗いバンドの上または下の領域をバックグラウンド減算に使用すると、負のピークが生成されます。重要なことに、このピークはTNP-ATP発光に対応する波長範囲で発生し、ANAPクエンチングの測定に影響を与えませんでした。
私たちの実験の主な制限は、蛍光を測定するためにANAPタグ付きコンストラクトの適切な原形質膜発現を得ることでした。パッチが一度に1つしか取得できないPCFとは異なり、サイズが大きく、屋根のないメンブレンをディッシュ全体をすばやくスキャンできるため、PCFよりも屋根のないメンブレンから高品質のスペクトルを取得するのは一般的に簡単でした。我々の実験では、屋根のない膜とPCF実験のデータは類似していましたが、同等ではありませんでした(図6)11。しかし、パッチピペット内のタンパク質は、屋根のない膜内のタンパク質とは異なる機能状態にある可能性があるため、これが普遍的な観察であるべき先験的な理由はありません。
ここでは、我々のANAPタグ付きコンストラクトの発現を最大化する試み、特に細胞培養温度を33°Cに下げる試みがなされている10、11、16。我々の経験では、ANAPが保存的置換となるタンパク質中の部位を同定しようとしても、一貫して良好に発現するコンストラクトが得られなかった。タンパク質領域全体を系統的にスキャンしてANAP取り込み部位を探し、表面発現候補をスクリーニングすることに成功しました10。ANAPラベリングシステムはアフリカツメガエル卵母細胞でも機能し、はるかに大きな膜パッチを切除できるため、シグナル対ノイズが増加します26,27,28。
発現レベルが高いほどシグナルが明るくなると予想されますが、蛍光の測定に必要な最小チャンネル数は、蛍光色素の輝度、光退色の程度、励起光の強度、焦点面など、いくつかの要因によって異なります。理論的には、推定は、前に示したように蛍光強度とチャネル電流を相関させることによって行うことができます28,29。ただし、このような推定値の信頼性を高めるには、単一チャネルのコンダクタンスとチャネルのオープン確率に関するある程度の知識が必要です。上記の要因に加えて、蛍光シグナルは、電圧クランプされていないピペットガラスに付着した小胞または原形質膜のセクションに関連するチャネルによっても影響を受けます。
この方法は、他のヌクレオチド感受性イオンチャネルの研究に容易に適合する。CFTRは、KATP30、31の副スルホニル尿素受容体サブユニットと構造的に類似している。KATPと同様に、CFTRゲーティングはヌクレオチド結合によって制御されており、我々の方法7の明らかな将来の標的となっています。プリン作動性P2X受容体は、細胞外ATP9によってゲートされるイオンチャネルである。TNP-ATPは、P2X受容体32,33のアンタゴニストとして作用する。したがって、P2Xアゴニストとの競合アッセイで使用される可能性がありますが、P2X活性化の研究には役立ちません。あるいは、ANAP発光と十分なスペクトルオーバーラップを有する他の蛍光ATP誘導体を使用して、活性化を研究してもよい。Alexa−647−ATPは蛍光P2Xアゴニスト34である。Alexa-647とANAPの間で計算されたR0は~85 Åであり、これはP2Xへの直接結合がチャネルに組み込まれたANAPの実質的な消光をもたらすことを意味する。しかしながら、そのような長いR0はまた、隣接するサブユニットに結合したAlexa−647−ATPからの消光をもたらし、非特異的ヌクレオチド結合がFRETをもたらす可能性を高める。P2X受容体のリガンド結合部位は細胞外であるため、結合測定は無傷の細胞、全細胞電圧クランプ、または外側の膜パッチで行われます。私たちの方法は、反応サイクルをATPに依存する電気発生および非電気発生トランスポーターおよびポンプ、およびGタンパク質共役型P2Y受容体の結合および活性化の研究にも拡張できます。最後に、アデニンヌクレオチド結合(TNP-ATP、TNP-ADP、TNP-AMP)を測定するためにこの方法を開発しましたが、同じアプローチを使用して、適切な蛍光リガンドが同定されたほぼすべての受容体への結合を研究することができます。

タンパク質のいくつかの重要なクラスは、リガンド結合によって直接制御されています。これらは、可溶性酵素から、受容体チロシンキナーゼ、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、およびイオンチャネルを含む膜埋め込みタンパク質にまで及びます。GPCRとチャネルは、現在のすべての創薬標的のそれぞれ~34%と~15%を占めています1,2。したがって、リガンド-受容体相互作用に関する機構的な洞察を提供する方法の開発には、かなりの生化学的および医学的関心があります。光親和性標識や放射性リガンド結合研究など、リガンド結合を測定するための従来の方法は、大量の部分的に精製されたタンパク質を必要とし、通常、非生理学的条件および時間スケールで実行されます。理想的な方法は、少量のタンパク質のみを必要とし、細胞または膜環境で発現されたインタクトなタンパク質に対して実行でき、リアルタイムで監視でき、タンパク質機能の直接読み取りと互換性があります。
フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、蛍光でタグ付けされた2つの分子3間の近接を検出する方法である。FRETは、励起されたドナー蛍光色素が非放射方式でアクセプタ分子(通常は別の蛍光色素)にエネルギーを伝達するときに発生します。エネルギー移動は、ドナー蛍光発光の消光およびアクセプター発光の増感(アクセプターがフルオロフォアの場合)をもたらす。伝達効率は、ドナーとアクセプターの間の距離の6乗 に依存する。さらに、FRETが発生するためには、ドナーとアクセプターが近接(通常は10nm未満)になければなりません。そのため、FRETを利用して、蛍光標識されたタンパク質受容体と蛍光リガンドとの間の直接結合を測定することができます。
いくつかの異なるタンパク質は、細胞内または細胞外のアデニンヌクレオチド(ATP、ADP、AMP、cAMP)に結合することによって調節または活性化される。多くのトランスポータータンパク質は、ATP結合カセットトランスポーターやNa+/K+ポンプ4,5のようなP型ATPアーゼなど、反応サイクルにATP加水分解を必要とします。ATP感受性K+(KATP)チャネル、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子(CFTR)、および環状ヌクレオチド調節チャネルはすべて、細胞内アデニンヌクレオチドの結合によってゲートされるイオンチャネルであり、細胞代謝およびシグナル伝達の変化に非常に敏感です6,7,8.プリン作動性P2XおよびP2Y受容体は、神経伝達物質として、または組織損傷の結果として放出され得る細胞外ATPの変化に応答する9。膜タンパク質に結合するアデニンヌクレオチドをリアルタイムで測定するためのFRETベースのアッセイを開発しました。我々は以前、この方法をKATPチャネル10,11へのヌクレオチド結合を研究するために適用した。
FRETを介したヌクレオチド結合を測定するには、まず目的のタンパク質を蛍光色素でタグ付けする必要があります。蛍光タグは、FRETが発生するリガンド結合部位に十分近くなるように、目的のタンパク質に部位特異的に挿入する必要があり、タグがタンパク質の全体的な構造と機能に影響を与えないように特別な注意が払われます。これを達成するために、我々はChatterjeeらによって開発された技術を採用し、アンバー終止コドン抑制を使用して蛍光非標準アミノ酸(l-3-(6-アセチルナフタレン-2-イルアミノ)-2-アミノプロピオン酸;ANAP)を目的のサイトで12。ANAP標識タンパク質と蛍光性トリニトロフェニル(TNP)ヌクレオチド誘導体との間のヌクレオチド結合をFRETとして測定します(図1A)。ANAPの発光スペクトルはTNPヌクレオチドの吸光度スペクトルと重なり、FRETが発生するために必要な条件です(図1B)。ここでは、2つの異なるタイプの結合実験の概要を説明します。第1に、ANAP標識KATPチャネルの細胞内側へのヌクレオチド結合は、ガラスカバースリップ10、11、13、14上に原形質膜の付着断片を残して超音波処理によって屋根を外した細胞において測定される。
第2の方法では、ANAP標識KATP チャネルへのヌクレオチド結合をメンブレンパッチ中で電圧クランプ下で測定し、イオン電流と蛍光の同時測定を可能にする。これら2つの実験的アプローチを組み合わせることにより、結合の変化をチャネル機能の変化と直接相関させることができる11。典型的な結果、潜在的な落とし穴、およびデータ分析について説明します。

<table><tbody><tr><td>T75 組織培養処理フラスコ</td><td>StarLab</td><td>CC7682-4875</td><td></td></tr><tr><td>0.1% w/v poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>30 mm ホウケイ酸カバー ガラス スリップ</td><td>VWR</td><td>631-0174</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 未処理滅菌皿</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-3340</td><td></td></tr><tr><td>35 mm カバーガラス底皿</td><td></td><td>WPI FD35-PDL-100</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコModified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Foetal wevine serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE select (tryosin)</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>Trypsin/EDTA reagent</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure蒸留水</td><td>Invitrogen</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T細胞</td><td>ATTC</td><td>CRL-3216</td><td>継代 5-30</td></tr><tr><td>ANAP-TFA</td><td>AsisChem</td><td>ASIS-0014</td><td>30 mM NaOH で再構成され、最終濃度が 1 mM</td></tr><tr><td>pANAP 発現プラスミド</td><td>Addgene</td><td>プラスミド #48696</td> ANAP タグ付きタンパク質 peRF1-E55D <td>の発現のために tRNA/tRNA 合成酵素ペアをエンコードします</td></tr><tr><td></td><td>Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK)</td><td>Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728</td><td>Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2300</td><td>Lipopolyplex transfection reagent</td></tr><tr><td>厚肉ホウケイ酸ガラス毛細血管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC150F-15</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine-5-maleimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94506</td><td></td></tr><tr><td>TNP-ATP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-221L</td> 水中 <td>10 mM で供給</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U 倒立顕微鏡</td><td>顕微鏡 Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60x 水浸対物レンズ (1.4 NA)</td><td>Nikon</td><td>MRD07602</td><td></td></tr><tr><td>4 波長ハイパワー LED ヘッド</td><td>ThorLabs</td><td>LED4D245</td><td>385/490/565/625 nm LED</td></tr><tr><td>4チャンネルLEDドライバー</td><td>ThorLabs</td><td>DC4100</td><td></td></tr><tr><td>390/18 nm バンドパス励起フィルタ</td><td>ThorLabs</td><td>MF390-18</td><td>ANAP励起用</td></tr><tr><td>400 nm ロングパス発光フィルタ</td><td>ThorLabs</td><td>FEL0400</td><td>ANAPスペクトル</td></tr><tr><td>416 nm エッジダイクロイック</td><td>ThorLabs</td><td>MD416</td><td>ANAPスペクトル</td></tr><tr><td>460/60 nmバンドパス発光フィルタ</td><td>ThorLabs</td><td>MF460-60</td><td>ANAP蛍光イメージング用のワイドバンドパスフィルターの提案 (図4B)</td></tr><tr><td>470/10 nmバンドパス蛍光フィルター</td><td>ThorLabs</td><td>FB470-10</td><td>ANAP蛍光イメージング用のナローバンドパスフィルターの提案 (図4B)</td></tr><tr><td>531/40 バンドパス励起フィルター</td><td>Brightline</td><td>FF01-531/40-25</td><td>オレンジ蛍光タンパク質(OFP)励起用</td></tr><tr><td>540/25 nmバンドパス励起フィルター</td><td>Chroma</td><td>D540/25X</td><td>テトラメチルローダミン-5-マレイミド(TMRM)励起</td></tr><tr><td>用 562 nm エッジダイクロイック</td><td>Semrock</td><td>FF562-Di03</td> イメージング<td>用 OFP蛍光</td></tr><tr><td>565 nm エッジダイクロイック</td><td>Chroma</td><td>565DC</td><td>イメージング用 TMRM 蛍光</td></tr><tr><td>593/40 nm バンドパス励起フィルター</td><td>Brightline</td><td>FF01-387/11-25</td> イメージング<td>用 OFP 蛍光</td></tr><tr><td>605/55 nm バンドパス発光フィルター</td><td>Chroma</td><td>D605/55M</td><td>イメージング用 TMRM 蛍光</td></tr><tr><td>IsoPlane-160 イメージング分光計</td><td>プリンストン・インスツルメンツ</td><td>IsoPlane-160</td><td></td></tr><tr><td>PIXIS 400BR_eXcelonカメラ</td><td>プリンストン・インスツルメン</td>ツ <td>PIXIS: 400BR_eXcelon</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B アンプ</td><td>モレキュラー・デバイス</td><td>Axopatch 200B-2</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A デジタイザー</td><td>モレキュラーデバイス</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>プローブソニケーター</td><td>ソニックス &材料</td><td>VC-50</td><td>屋根外し用</td></tr><tr><td>REGLO デジタル蠕動ポンプ</td><td>Ismatec</td><td>ISM 832</td><td>入浴灌流用</td></tr><tr><td>微量灌流システム</td><td>ALA サイエンティフィック・インスツルメンツ</td><td>ALA &mu;Flow-8</td><td>TNP-ATP灌流用</td></tr><tr><td>pClamp 10.6.2</td><td>分子デバイス</td><td></td><td>電流の記録と分析</td></tr><tr><td>Lightfield 5.20.1507</td><td>Princeton Instruments</td><td></td><td>画像とスペクトル用の取得ソフトウェア</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>データ解析用</td></tr><tr><td>Python 3.8.1</td><td>Python Software Foundation</td><td></td><td>データ解析用</td></tr></tbody></table>

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

私たちは、細胞または膜環境におけるアデニンヌクレオチドの無傷の機能的な膜貫通受容体への結合を測定する方法を開発しました。この方法は、蛍光性非標準アミノ酸ANAPでタグ付けされたタンパク質の発現、およびANAPと蛍光(トリニトロフェニル)ヌクレオチド誘導体との間のFRETを組み合わせたものです。ANAPタグ付きKATP イオンチャネルへのヌクレオチド結合の例を、屋根のない原形質膜および切除した裏返しの膜パッチで電圧クランプ下で測定した例を紹介します。後者は、リガンド結合とチャネル電流の同時測定を可能にし、タンパク質機能を直接読み取ることができます。データの処理と分析は、潜在的な落とし穴やアーティファクトとともに、広範囲に議論されています。この方法は、KATP チャネルのリガンド依存性ゲーティングに関する豊富な機構的洞察を提供し、他のヌクレオチド調節タンパク質または適切な蛍光リガンドを同定できる任意の受容体の研究に容易に適応させることができる。

このプロトコルは、細胞環境において受容体に結合するアデニンヌクレオチドをリアルタイムで測定する方法を提示する。結合は、トリニトロフェニルヌクレオチド誘導体と非標準的な蛍光アミノ酸で標識されたタンパク質との間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)として測定されます。

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

ATPは重要な細胞メッセンジャーであるため、ATPの受容体への結合を高精度に測定できる方法を開発しました。ヌクレオチド誘導体と蛍光標識タンパク質間のFRETを用いることで、インタクトな機能的受容体へのヌクレオチド結合をリアルタイムかつ優れた空間分解能でモニタリングすることができます。この方法を使用して、特定の形態の糖尿病に関係するATP感受性カリウムチャネルに対する細胞代謝の影響を理解します。屋根のない膜実験を設定するには、まず鉗子を使用して、トランスフェクトされた細胞でカバースリップから小さな断片を破り、その断片をPBSですすぎます。カバースリップがポリリジンでプレコーティングされている場合は、2ミリリットルのPBSを含む35ミリメートルの皿の底に断片を置き、サンプルの3〜5ミリメートル上に3ミリメートルのプローブ超音波処理器を保持し、50ワットと20〜40%の振幅で200〜500ミリ秒パルスしてセルの屋根を外します。カバースリップが事前にコーティングされていない場合は、PBSですすいだ後、0.1%ポリ-L-リジンを含むチューブに約30秒間フラグメントを浸してから、示されているように短い超音波処理で細胞を屋根を外します。超音波処理された断片を、2ミリリットルの浴液を含む覆われたガラス底35ミリメートル皿に移し、高開口60倍水浸対物レンズを備えた倒立顕微鏡に皿を取り付けます。顕微鏡のカメラポートが高感度CCDカメラと直列に分光器に接続されていることを確認し、蠕動ポンプを使用して、毎分0.5〜1ミリリットルのバッファーの流量でバッファーでバスチャンバーを灌流します。ANAP標識チャンネルを発現する屋根のないメンブレンフラグメントを特定するには、サンプルを表示して、蛍光チャンネルを持つメンブレンを見つけます。顕微鏡のカメラポートと分光器の間に分光器マスクを部分的にかみ合わせます。マスクの影がカメラ画像に表示されます。屋根のない膜の明視野と蛍光画像を取得して、分析する対象領域を選択できるようにします。マイクロボリューム灌流システムの先端を屋根のない膜に近づけます。ANAP蛍光の画像を取得するには、390/18ナノメートルのバンドパス励起フィルターと416ナノメートルのエッジダイクロイックを介して385ナノメートルのLEDでメンブレンを励起し、400ナノメートルのロングパス発光フィルターを介して放出された光を収集します。分光器のマスクをかみ合わせ、放出された光が通過することを確認します。関心領域を分光器マスクのスリットに合わせます。分光器の格子をかみ合わせます。格子を配置すると、分光器によって回折された光がCCDカメラのチップに投影され、スペクトル画像が生成されます。画像は Y 次元の空間情報を保持します。X次元は波長に置き換えられます。ヌクレオチドフリー緩衝溶液で灌流しながら、実験の残りの部分を通して収集されたデータのダウンストリーム補正および正規化のために、1つ以上の0.1〜10秒の曝露を得る。次に、浴溶液にTNP ATP濃度の範囲を適用して濃度応答曲線を確立し、各溶液を少なくとも1分間灌流して定常状態に到達し、各濃度の曝露を取得します。各濃縮後、TNP ATPをヌクレオチドフリーバス溶液で少なくとも1分間洗い流してから、治療後の露光画像を取得します。パッチクランプ蛍光測定実験を行うには、まずパッチピペットを厚肉のホウケイ酸ガラスキャピラリーからピペット溶液で満たしたときに1.5〜2.5メガオームの抵抗まで引き抜きます。次に、細胞をトランスフェクトしたカバースリップを2ミリリットルの入浴液を入れたガラス底35ミリシャーレに移し、倒立顕微鏡に装着します。浴チャンバーを浴液で灌流し、ANAP標識チャネルを発現する細胞を同定します。パッチピペットに穏やかな陽圧を加え、ピペットをバスチャンバーに入れます。ピペットを細胞の膜に押し付け、穏やかな吸引を加えてギガオームシールを実現します。パッチを切除するには、ピペットホルダーをパッチを当てた細胞からすばやく離します。パッチピペットの先端を灌流システムの先端に近づけ、パッチが分光器マスクのスリット内にあることを確認します。次に、TNP ATPを適用し、画像スペクトルを収集します。これらの画像では、オレンジ色の蛍光タンパク質でタグ付けされたATP感受性カリウムチャネルを発現するHEK293T細胞からの典型的な屋根のない膜断片を観察することができます。5マイクロモルのTNP ATPに曝露されたHEK293T細胞からの屋根のない膜におけるANAPタグ付きATP感受性カリウムチャネルのこのスペクトル画像では、ANAPおよびTNP ATPのピーク発光に対応する高強度の2つの領域が観察され得る。最終的なスペクトルは、平均化された関心領域スペクトルから平均化されたバックグラウンドスペクトルを差し引くことによって得ることができる。ここで、多重露光後のピークANAP蛍光の減少が観察できる。TNP ATPの非存在下での数回の曝露からのピーク蛍光は、単一の指数関数的減衰に適合した。次に、これらのデータを使用して、光退色アーチファクトを修正しました。ここでは、TNP ATPの非存在下およびTNP ATP存在下でANAPタグ付きATP感受性カリウムチャネルを発現する細胞から得られた屋根のない膜からの代表的なスペクトル画像が示されている。補正された発光スペクトルを観察すると、ドナーとアクセプターの蛍光発光の間に明確な分離が明らかになります。この図では、典型的なパッチクランプ蛍光測定実験からのANAPタグ付きATP感受性カリウムチャネルからの代表的な電流とスペクトルが示されています。発光スペクトルは、屋根のない膜で示されているように、バックグラウンドと漂白について補正されています。コントロールに注意して、蛍光シグナルが受容体に特異的であることを確認してください。あなたの滲出が速く、効率的で、完全であることを確認し、あなたの露出をできるだけ短くしてください。この方法は、受容体の占有率とそれが機能にどのように関連しているかについての質問に答えます。同様のセットアップで使用される他のFRET技術は、受容体におけるリガンド誘導性確認変化をプローブすることができる。

measuring-nucleotide-binding-to-intact-functional-membrane-proteins

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

規制エンドサイトーシスは、膜タンパク質の大部分の細胞表面発現レベルを制御します。ここでは、ドーパミントランスポーター（DAT）、ポリトープ膜​​タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するために還元、膜非透過性ビオチン化試薬を利用する。メソッドは、ほとんどの細胞膜タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するための直接的なアプローチを促進する。...

リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

我々は単一細胞の蛍光を用いて立体構造変化の部位特異的解析と並んで膜タンパク質のイオン輸送の動態を測定する方法を説明します。この手法は、イオンチャネル、トランスポーター、イオンポンプに適応可能であり、タンパク質サブユニット間の距離の制約を決定するために利用することができます。...

膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

無機表面へのタンパク質の非特異的吸着を監視するための固体ナノ細孔を用いる方法が説明されています。方法は、リアルタイムで、単一分子レベルで検出対象にする吸着を可能に、抵抗パルスの原理を採用しています。単一タンパク質吸着のプロセスがはるかに平衡からなので、我々は同様にタンパク質吸着の定数見かけ一次反応速度の定量測定と一定のラングミュア吸着のために可能にする、合成ナノ細孔の並列配列の雇用を提案する。...

ソリッドステートナノ細孔を持つ監視タンパク質吸着

表面プラズモン共鳴（SPR）は、リアルタイムでの生体分子相互作用を検出するためのラベルフリー法である。ここで、膜タンパク質のためのプロトコル：技術の長所と短所を議論しながら、受容体相互作用の実験は、記載されている。...

膜タンパク質のリアルタイム測定：受容体相互作用は、表面プラズモン共鳴を使用した（SPR）

私たちは、単一のTリンパ球におけるカルシウムシグナル伝達のリアルタイムイメージングと、力制御された単一の受容体-リガンド結合速度の測定を同時に行うための技術について説明します。...

蛍光生体膜フォースプローブ：単一細胞上の受容体 - リガンド速度論の同時定量との結合によって誘導される細胞内シグナル伝達

この原稿では、T細胞抗原受容体(TCR)と抗原性ペプチドをロードしたMHC分子との間の結合ダイナミクスを測定するための(単一分子)フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)ベースのアッセイの実施方法について説明します。これらの機能化された平面支持脂質二重層と接触しているT細胞の免疫学的シナプス内で発生します。...

TCR-のpMHCが結合を測定します<em&gt;その場で</em&gt; FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して

提示されたプロトコルは、細孔スパンの溶媒を含まない脂質二重層を使用した単一トランスポーターレベルでの膜タンパク質媒介輸送の分析を説明しています。これは、大量生産されたナノポアアレイチップの作成と、高度に並列化されたデータ取得および分析を組み合わせることで達成され、膜タンパク質エフェクタースクリーニングの将来の確立が可能になります。...

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

多くのタンパク質は、膜表面に付着するとその機能を果たします。ナノディスク膜上の外因性タンパク質の結合は、透過型電子顕微鏡によって間接的に画像化することができます。我々は、ネガティブ染色のリンスホタングステン酸ナトリウムによって誘発されるナノディスクの特徴的なスタッキング(rouleau)が、外部タンパク質の結合によって防止されることを示す。...

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

蛋白質蛋白質の相互作用、生物学的システムにとって重要と拘束運動の研究は、ダイナミクスとタンパク質複合体の機能に対する洞察を提供します。蛋白質の蛍光共鳴エネルギー移動ストップト...

ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用

この論文は、脂質近位環境におけるin vitroでの内在性膜タンパク質とさまざまなパートナー因子との相互作用と集合を評価する方法を説明しています。...

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成しますインビトロ

学ぶ FRETを用いてATP結合をリアルタイムで測定する方法。膜タンパク質へのヌクレオチド結合を高感度でモニタリングし、ATP感受性カリウムチャネルの動態を解析する技術を習得できます。

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

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