Name: 機能性および偏極性胆道上皮嚢胞の生成と定量的特徴付け (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 学ぶ ハイドロゲルベースの胆道嚢胞生成法を用いた上皮細胞の三次元培養と定量的評価。正常ラット胆管上皮細胞を用いて嚢胞形成効率とサイズを時系列解析し、胆道疾患の病態理解と治療標的発見に貢献します。

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NRC細胞株を提供してくれたニコラス・ラルッソ博士(メイヨークリニック、ロチェスター、ミネソタ州、米国)に感謝します。
この作業は、iLite RHUプログラム(ANR-16-RHUS-0005を付与)とDHUヘパティノフの両方の財政的支援を受けました。
イザベル・ガルシンとレソー・デ・イメージリー・セルライア・パリ・サクレーのイメージング支援に感謝します。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

3D細胞構造の有機生成および維持を研究するために、様々な組織がモデル化され、異なる細胞起源を用いて、合成ヒドロゲル8、9、10、21を含む異なる種類の細胞外マトリックスも使用している。しかし、オルガノイドの形成や機能性の観点から方法を比較できる3D定量分析の欠如のため、7、8、9、10、15、18、ヒドロゲルまたは薬物スクリーニングのさらなる標準化は手の届かないところに残っています。
...

過去30年間で、インビトロ研究の分野は3D培養システムに向けて進歩してきました。スキャフォールド/マトリックスの存在下または存在下でのスフェロイドまたは凝集体として細胞を3Dで培養するためのプロトコルの数が出現している、ドロップで、撹拌中、微小流体デバイス、または浮遊1。3D培養法の使用は、特に嚢胞またはアキニと呼ばれる3D構造で自己組織化することが示された上皮細胞に対して、2次元(2D)培養よりも利点を証明している。この場合、細胞は内腔を囲む単層を形成し、そこで細胞は生理学的特異的機能を改善した完全な上皮表現型を獲得する2。
多くの研究は、天然マトリックスでこれらの上皮オルガノイドを形成するための方法の開発に貢献しています。.これにより、生体細胞および細胞微小環境相互作用において再現化を図り、上皮表現型3、4、5、6、7の確立および安定性を得ることを可能にした。近年、特に移植可能なオルガノイドの開発や、上皮プログラムを調整するための微小環境の要件を解読することを目的として、上皮アチーニ8、9、10の形成を高める合成ヒドロゲルが開発されている。残念ながら、これらの研究は、定性的なデータに関する報告、または2D平面8、9、10における非嚢胞に対する嚢胞の比率などの内部参照を使用して計算方法を提示する。これは、上皮オルガノイドの効率、安定性、または形態学的および生理学的特徴の点で異なる研究間の比較を排除する。
マイクロ流体デバイスを用いたビーズ中の上皮細胞のマイクロカプセル化により、より現実的な定量的および比較的な結果が得られました。この技術を用いて、様々な細胞型のオルガノイドが形成され、異なる3D細胞構造11、12の形態に基づいて分化された。しかし、この技術は、マイクロ流体デバイスを製造するためにクリーンルームを使用する必要があり、作業することは容易ではありません。この技術は、いくつかのタイプのヒドロゲルのために確立されていますが、その汎用性を制限し、他のヒドロゲルに適用する技術的な適応を必要とします。したがって、上皮オルガノイドを開発することを意図したほとんどの研究は、ヒドロゲルバルク中の上皮細胞の埋め込みに依存しています。これらの方法では、3D培養全体の中でのゲル構造および細胞分布の高い不均一性は、しばしば無視される。したがって、ほとんどの解析は単一の 2D 画像に関連しており、これは 3D ボリューム全体におけるさまざまなセルラー オブジェクトの分布を大まかに表しています。
胆管、胆管閉鎖、原発性硬化性胆管炎などの胆管に影響を及ぼす疾患は、とりわけ、死亡率および罹患率の主な原因である。肝臓移植を除いて、これらの状態13に対する有効な治療法はない。胆管の形成、疾患原因、および進行を調査する努力は、新しい治療法の開発を可能にする14.
嚢胞、スフェロイドまたはチューブ様構造の胆道性組織モデルは、正常または患者由来、分化、または前駆細胞由来の胆管球細胞株を用いて15、16、17、18、19、20を開発した。様々な研究は、コリンギオライト極性、コリンギオライトマーカーの発現、繊毛の存在、胆管形成および吸収能、および管腔形成および閉塞を再現している。そのすべてが、胆管球表現型、形態、および機能15、17、19の重要な特徴を表す。他の人は、長期間の患者由来胆様オルガノイドの維持を長期間20に報告している。最近、我々は、胆嚢の有機生成における生化学的および生物物理学的手掛かりの役割を調べた。重要なことに、胆道閉鎖症の病因は胆道球形体および管7,22において研究された。さらに、胆管球老化、炎症促進性サイトカインの分泌、ならびにマクロファージの採用などの原発性硬化性胆管炎の主要な特徴は、胆道スフェロイド15,20を用いて研究に成功した。しかしながら、これらの質問に対処できる、生理的にcholangiocyte表現型、生理学、および微小環境を調節するvitro 3D定量モデルで再現性が依然として必要とされている。さらに、少数の出版物は、嚢胞形成効率21、23を報告している。これは、特に、有機的な生成、疾患原因、および薬物応答とコリンギョ球機能および分極の相関を調査する際に確立する重要なポイントです。さらに、プロトコル間で使用されるスキャフォールド/マトリックスの違いにより、システム間で比較することは困難です。これらの問題を解決するために、内腔形成、胆管状分極、胆管形成機能を模倣した胆嚢胞を生成する定量的、信頼できる普遍的な方法を提案する。重要なことは、時間の経過に伴う、嚢胞形成効率、サイズ、生存率、分極性、および機能性を評価する際に、3Dゲルを横切ってZ軸に沿って行われる体系的な分析を提示することです。さらに、天然ヒドロゲルおよび正常ラット胆管球(NRC)sをプロトコルの例として使用したが、他の天然または合成ヒドロゲル、ならびに上皮細胞は3D嚢胞構造の形成に使用することができた。

<table><tbody><tr><td>10 &micro;l- ピペット Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000020</td><td></td></tr><tr><td>100 & micro;l - ピペット Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000046</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro;l - ピペット Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;l - ピペット Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;,5-Triiodo-L-thyronine ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td>NRC 完全中期最終濃度 = 3.4 & μ;g / mL</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>VWR</td><td>20104-298</td><td>0.02N最終</td></tr><tr><td>エアロゾルバリアピペットのヒント10 &micro;l (フィッシャーブランド)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>2707439</td><td></td></tr><tr><td>エアゾールバリアピペットチップ 1000 & マイクロ;l (フィッシャーブランド)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>2707404</td><td></td></tr><tr><td>エアロゾルバリアピペットチップ 200 & マイクロ;l (フィッシャーブランド)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>2707430</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質 Antimicotic Solution (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>NRC 完全中濃度 最終濃度 = 1:100 希釈ウ</td></tr><tr><td>シ下垂体抽出物</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13028-014</td><td>NRC 完全中濃度 最終濃度 = 30 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>1:1000 希釈</td></tr><tr><td>Chemically Defined Lipid Concentrate (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11905-031</td><td>NRC 完全中期最終濃度 = 1:100 希釈</td></tr><tr><td>コラーゲン高濃度、ラットテール</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>354249</td><td>50 & micro;g/mL 最終濃度</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>NRC 完全中期最終濃度 = 0.393 & μ;g/mL</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21331-020</td><td>NRC 完全培地 最終濃度 = 1X</td></tr><tr><td>E-カドヘリン ウサギ 抗ヒト、ラット、ポリクローナル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PA5-32178</td><td>1:400</td></tr><tr><td>希釈 Eclipse TE300 倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td>イメージング</td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td>NRC 完全培地 最終濃度 = 0.32 mM</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10270-106</td><td>NRC 完全培地 最終濃度 = 5:100 希釈</td></tr><tr><td>フルオロシールド DAPI(封入剤)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド 16% (W/V)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>28906</td><td>4% (W/V)</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16210-064</td><td>1:10希釈</td></tr><tr><td>浜松カメラ(デジタルカメラC11440 ORCA-フラッシュ4.OLT)</td><td>浜松</td><td></td><td>イメージング</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1155</td><td>5 & micro;g/mL 最終濃度</td></tr><tr><td>IgG (H+L) 高交差吸着ヤギ 抗ウサギ、Alexa Fluor Plus 647</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A32733</td><td>1:500 希釈</td></tr><tr><td>ImageJ バージョン 2.0.0-rc-69/1.52n</td><td></td><td></td><td>オープンソース画像処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>インスリントランスフェリン-セレン (100X)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>51300-044</td><td>NRC 完全培地最終濃度 = 1:100 希釈</td></tr><tr><td>L-グルタミン (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td>NRC 完全中期最終濃度 = 1:100 希釈</td></tr><tr><td>Matrigel GFR (ストック濃度 9.7 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>356231</td><td>4:10 希釈</td></tr><tr><td>NIS Elements ソフトウェアバージョン 4.50.00</td><td>Nikon</td><td></td><td>画像取得および表示</td></tr><tr><td>Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11140-035</td><td>NRC 完全中速最終濃度 = 1:100 希釈</td></tr><tr><td>対物レンズ プラン Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (&infin;/1.2 WD 15.2)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold 退色防止剤</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>20 &micro;g/mL 最終濃度</td></tr><tr><td>ローダミン ファロイジン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R415</td><td>16.2 nM 最終濃度</td></tr><tr><td>Sir-Actin / ベラパミルキット</td><td>スピロクローム</td><td>SC001</td><td>10 & マイクロ;M 最終濃度</td></tr><tr><td>大豆トリプシン阻害剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17075-029</td><td>NRC 完全中濃度 最終濃度 = 50 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>滅菌セルストレーナー 40 & マイクロ;m (フィッシャーブランド)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ピペット 10 mL (フィッシャーブランド)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ピペット 5 mL (フィッシャーブランド)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>滅菌チューブ 1.5 mL (フィッシャーブランド)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>サイエン</td>ティフィック 11926955 <td></td></tr><tr><td>滅菌チューブ 15 mL (フィッシャーブランド)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>7200886</td><td></td></tr><tr><td>滅菌チューブ 50 mL (フィッシャーブランド)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>553913</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>5:100 希釈</td></tr><tr><td>組織培養処理フラスコ 25cm2 (ファルコン)</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>353108</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>5:1000希釈</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.05%) フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25300-054</td><td>1X</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>5:10000 希釈</td></tr><tr><td>ビタミン (100X)</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11120-037</td><td>NRC 完全中濃度 最終濃度 = 1:100 希釈</td></tr> &<tr><td>mu;-スライド 8 ウェル ibiTreat, Ibidi</td><td>Clinisciences</td><td>80826</td><td></td></tr></tbody></table>

機能性および偏極性胆道上皮嚢胞の生成と定量的特徴付け

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

胆管球は、肝臓の胆管を並べ、胆汁の形成と修飾を監督する上皮細胞である。過去20年間、肝臓病の文脈では、嚢胞、スフェロイド、チューブ状構造などの胆管組織に基づく3次元(3D)モデルが出現し、組織トポロジーを模倣して有機生成、疾患モデリング、薬物スクリーニング研究が行われています。これらの構造は、主に、ヒドロゲルにコリンジクサイトを埋め込むことによって得られた。主な目的は、上皮の極性、機能的、形態学的特性に対処することによって自己組織化を研究することであった。しかし、嚢胞形成効率に焦点を当てた研究はほとんどありません。この場合、効率は単一平面の画像から定量化されることがよくあります。機能アッセイおよび構造解析は、ヒドロゲル重合不均一性および副作用に起因する嚢胞分布の潜在的不均一性を表すことなく行われる。したがって、定量分析は、ある記事から別の物品への比較に使用できません。さらに、この方法論では、異なるマトリックスと細胞タイプの3D成長ポテンシャルの比較はできません。さらに、免疫染色嚢胞の実験的なトラブルシューティングについては言及されていない。本稿では、初期細胞分布が嚢胞形成の異種垂直分布に関連していることを示す、信頼性の高い普遍的な方法を提供する。ヒドロゲルに埋め込まれた胆管球細胞は、10日間の時間経過に沿ってヒドロゲル深度に沿ってZスタック分析を続ける。この方法により、嚢胞形成効率および成長の強い運動が得られる。また、嚢胞極性と分泌機能を評価する方法も紹介する。最後に、イメージングのための嚢胞崩壊を制限するために、免疫染色プロトコルを最適化するための追加のヒントが提供されます。このアプローチは、他の3D細胞培養研究に適用することができ、したがって、あるシステムを別のシステムと比較する可能性を開くことができます。

嚢胞の形成と特徴付け 3D細胞培養システムは、有機生成および疾患モデリング25を研究するための重要なツールである。残念ながら、これらの方法のほとんどは、様々な研究間の嚢胞形成効率の点で、嚢胞の数と非嚢胞の数を比較することによって単一の平面上で行われる内部定量化を使用する定性的である7、8、9、10、15、18、23。このプロトコルで提案された方法は、実験の時間にわたって嚢胞の全数およびそれぞれのサイズを記録することによって、嚢胞形成および成長の進化の分析を可能にする(<strong clas...

3次元(3D)細胞系は、有機生成を調査するための関連モデルです。胆嚢の生成とその特性評価のためのヒドロゲルベースの方法が提案されている。このプロトコルは、嚢胞形成効率、サイズを評価し、その機能をテストするための簡単で信頼性の高い方法で、3D特性評価の障壁を解明します。

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

これは、胆嚢胞を生成するための最初のプロトコルであり、時間の経過とともに嚢胞の形成、効率、およびサイズの評価を可能にする体系的な分析を提供する。この方法は、上皮性嚢胞形成の定量的評価を可能にし、上皮細胞またはヒドロゲルの種類の関数としてこのプロセスを評価することを可能にする。胆道障害の治療オプションは限られているため、このプロトコルは、薬物研究を標準化し、正常な治療目標を特定し、疾患メカニズムを理解するための扉を開きます。この単純な方法により、管状構造分野の生体工学における新しい情報のメカニズムに関する重要な疑問に対処することができます。実験を開始する前に、適切なヒドロゲル溶液を摂氏4度で解凍し、ピペットチップを予め冷却し、8つのウェルチャンバースライドをマイナス20°Cで一晩スライドさせます。翌朝、ヒドロゲルと8つのウェルチャンバースライドを氷の上に置き、適切な量のヒドロゲルを冷常ラット胆管支化剤完全培地に加え、40%ヒドロゲル溶液の500マイクロリットルを得る。次に、冷たいピペットチップを使用して、チャンバースライドの各ウェルの中央に50マイクロリットルのヒドロゲル溶液を追加し、ピペットチップを使用して、泡なしで可能な限り均一にウェルボトムの表面全体に溶液を広げます。実験のために細胞を調製し、ヒドロゲルが重合している間に、70%コンフルエント正常ラットコリンギオライト培養から細胞を事前に温めたPBSで洗浄し、細胞培養インキュベーターで5ミリリットルの新鮮な温めたPBSを5ミリリットルで培養する。インキュベーションの終了時に、PBSをプリウォームドトリプシン-EDTAの1ミリリットルに置き換え、フラスコを細胞培養インキュベーターに5〜10分間戻します。細胞が剥離したら、4ミリリットルの完全な正常ラットの胆管球培地で反応を中和し、遠心分離のために細胞を15ミリリットルチューブに移す。その後、ペレットを5ミリリットルの事前温めた培地に再び懸濁し、40ミクロンのストレーナーを通して細胞を50ミリリットルのチューブにフィルターして数えます。嚢胞を生成するには、適切な量のヒドロゲルを冷たい正常ラット胆管軟骨細胞質培地に加えて、氷上で1,600マイクロリットルの80%ヒドロゲル溶液を得て、1ミリリットル当たり5倍の細胞に希釈し、培地の1,600マイクロリットルで正常ラット胆管軟菌体培地濃度を5倍に希釈する。すぐに細胞とヒドロゲル細胞溶液を混合し、400マイクロリットルの細胞をヒドロゲルコーティングされたチャンバースライドの各ウェルに加え、気泡を避けるように注意してください。再現性と有意な結果の獲得を確実にするため、ヒドロゲルを慎重に処理し、初期細胞の水素溶液を十分に混合して均一な溶液を得るようにしてください。すべての細胞が播種されたら、細胞培養インキュベーターにスライドを置きます。培養で2日後、各ウェルの片隅から培地の250マイクロリットルを取り出し、ヒドロゲルを洗い流さないので、廃棄した上清を250マイクロリットルの新鮮な培養培地にゆっくりと置き換える。嚢胞イメージングの場合、培養の適切な日に、画像取得ソフトウェアを搭載した位相コントラスト顕微鏡で10 Xの目的を選択し、白いランプをオンにして、明視野イメージングオプションを選択します。カメラのスイッチをオンにし、嚢胞のフィールドに焦点を当てるために再生を選択します。露光時間を設定し、自動キャプチャフォルダウィンドウを開いて画像を自動保存できるようにします。キャプチャZシリーズウィンドウを開き、デフォルトの位置をリセットし、Zねじを使用してZスタックの上と下の平野を定義し、目的と解像度のレベルに応じてZステップを調整します。次に、[今すぐ実行] をクリックして、取得を開始します。イメージングの後、フィジーでZスタックを開きます。スタックを複製するには、画像、複製、重複スタックをクリックします。複製されたスタックから最小の強度投影を作成するには、イメージ メニューの [スタック] と [Z プロジェクト] を選択します。投影タイプの最小強度を選択し、[大丈夫]をクリックします。プロジェクションから背景を減算するには、プロセスメニューで[背景を減算]を選択し、ローリングボール半径と光の背景の500ピクセルを選択して、嚢胞を背景よりもコントラストを高めます。おおよその嚢胞径を測定するには、対象となる嚢胞をズームし、直線ツールを選択し、キーボードのTボタンを押します。最終投影の各嚢胞の直径を横切って線を引きます。各嚢胞のために作成された関心のある次の領域は、関心のあるマネージャーの領域に追加されます。すべての嚢胞がカウントされたら、Zスタックウィンドウをクリックして選択し、[すべてを表示]をクリックして、カウントされた嚢胞を確認します。Zスタックに沿ってカーソルを動かして、すべての嚢胞が各画像でカウントされていることを確認し、必要に応じて関心のあるマネージャーの領域に新しい嚢胞を追加します。すべての嚢胞がカウントされたら、関心のある領域を選択し、さらにクリックして保存してデータを保存します。各嚢胞のサイズを決定するには、関心のある領域がまだ選択されたままで、測定をクリックします。各嚢胞とその推定サイズをリストするウィンドウが表示されます。その後、データを CSV 形式で保存します。実証されているように、時間の経過とともに嚢胞の数とそれぞれのサイズを記録することで、嚢胞の形成と成長の進化の分析が可能になります。開始細胞集団および10日齢の嚢胞の生存率は、生きた/死んだ染色によって評価することができる。死んだ細胞は10日目の細胞集団の3%未満を表し、主に嚢胞の外に孤立した細胞として、または小さな凝集体の一部として位置するが、いくつかの壊死細胞破片の蓄積はいくつかの大きな嚢胞内で観察される。フルオレセインジアセテートとHoechstとのインキュベーションは、基礎から座端の明るい空間へのフルオレセインの形成と分泌の評価を可能にする。特に、フルオレセインの分泌は、多剤耐性阻害剤による前処理によって阻害され、内腔内の蛍光フルオレセイン蓄積は多剤耐性トランスポーターを介した分泌によるものであり、細胞間空間からの漏出はないことを示している。Eカドヘリン発現の染色は、正常なラットの胆管球体が少なくとも10日間ヒドロゲル中の上皮表現型を維持することを明らかにする。免疫蛍光評価のために嚢胞を調製する場合、より高い濃度は嚢胞の引き込みおよび内腔の崩壊をもたらすので、飽和の間に牛血清アルブミンを0.1%以下に保つことが嚢胞の完全性を維持するための鍵である。一晩のヒドロゲル、解凍、ピペットチップおよびチャンバースライド記録、氷上での作業、培養チャンバースライド上に均一に均一に広げる均質な細胞ヒドロゲル混合物はすべて実験的な成功のために重要です。この方法は、他の上皮細胞またはヒドロゲルから嚢胞を生成するために使用することができ、上皮偏光のより良い理解のための比較を可能にする。この定量的方法は、胆道機能および器官形成に対する薬物または遺伝子変異の影響を試験するために使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

新生仔マウスの肝臓外胆管から胆管を単離するための技術が記載されている。ダクトは細心の注意を払って解剖し、その後、細胞が厚いコラーゲンゲル中で成長することによって単離される。この方法では、肝外胆管の開発および病理学を研究するための有用なツールを提供しています。...

新生児肝外胆管細胞を単離する

尿細管上皮細胞で発現するイオンチャネルは、多発性嚢胞腎疾患の病理において重要な役割を果たす。ここでは、新たにげっ歯類の腎臓から単離された胆嚢上皮におけるパッチクランプ分析を行うために使用される実験プロトコルおよび細胞内カルシウムレベルの測定を説明します。...

新たに単離したPKD上皮の機能的特性を監視するためにパッチクランプし、ライブ蛍光顕微鏡を実装

線虫 c. エレガンスの排泄管はde novo偏光膜生合成の視覚的生体内解析のためのユニークな単一細胞モデルです。このプロトコルでは、標準的な遺伝学的/RNAi とアプローチ、同定と解析分子単細胞 tubulogenesis...

細胞内の内腔の形態形成と単一細胞におけるIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫排泄管: GFP 融合、RNAi 操作画面やイメージングによるラベリング

ここで人間の鼻粘膜上皮細胞の三次元回転楕円体文化を生成する手法について述べる。回転楕円体は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) ドライブに刺激される-依存イオンと液分泌、「CFTR...

個別の嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ研究のひと鼻腔上皮細胞スフェロイドの生成

このプロトコルでは、マウス肝外胆管内 3 次元におけるシステムの運用について説明します。これらの肝オルガノイド cholangiocyte 生物を勉強する文化で維持できます。胆道 organoids...

マウス肝外胆管からオルガノイドの生成

マウス肝臓における胆管密度を正確に定量するための、かなりシンプルで敏感な方法を提示する。この方法は、遺伝的および環境修飾子の効果と胆汁病のマウスモデルにおける潜在的な治療法の有効性の決定に役立ちます。...

マウス肝臓における胆管密度の決定

このプロトコルは、マウスから実行可能な精密カット肝スライスを製造するための簡単で信頼性の高い方法を提供します。このエクスビボ組織サンプルは、ラボ組織培養条件下で複数回維持することができ、肝臓病理生物学を調べる柔軟なモデルを提供する。...

肝臓生物学のEx Vivoモデルとしてのマウス精密カット肝臓スライス

マウス新生児胆管障害の観察には、無傷の胆管と効率的な準備が必要です。したがって、マウス新生児の肝外胆管系全体を分離するための新しいアプローチは、胆管の完全性を維持しながら首尾よく開発されました。...

9日齢マウス新生児における肝外胆管および胆嚢郭清

整列心筋組織の生成が臨床的に有用な目的のために、幹細胞生物学の最近の進歩に適応させるための重要な要件です。ここに我々は、細胞の形や機能の正確な制御のためのマイクロコンタクトプリントのアプローチについて説明します。心臓前駆細胞由来の胚性幹細胞の高度に精製された集団を使用して、我々はそれから異方性、機能心筋組織を生成します。...

マイクロコンタクトプリントスルーアライン機能心筋組織の生成

アデニリルシクラーゼシグナル伝達の増感における抑制性Gタンパク質共役型の受容体の持続的活性化。本質的な分子経路を同定するために、偏りのないアプローチが必要であるが、この戦略は、スケーラブルな細胞ベースのcAMP増感アッセイの開発を必要とする。ここで、我々は、小分子およびsiRNAスクリーニングのために作アッセイを説明します。...

アデニリルシクラーゼの薬物誘発性感作：アッセイは、小分子およびsiRNAスクリーニング用途のために合理化·小型化

学ぶ ハイドロゲルベースの胆道嚢胞生成法を用いた上皮細胞の三次元培養と定量的評価。正常ラット胆管上皮細胞を用いて嚢胞形成効率とサイズを時系列解析し、胆道疾患の病態理解と治療標的発見に貢献します。

機能性および偏極性胆道上皮嚢胞の生成と定量的特徴付け

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