Name: 主培養海馬ニューロンを用いた軸索初期セグメントの組み立て研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学ぶ軸索初期セグメントの組み立てと構造解析の手法。主培養海馬ニューロンを用いて、巨大アンキリンG欠損状態でのAIS形成を定量的に評価し、神経発達と機能のメカニズム解明に貢献します。

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神経培養プロトコルに関する提案をしてくれたゲイリー・バンカー博士に感謝します。この研究は、ハワード・ヒューズ医学研究所、NIHからの助成金、ジョージ・バース・ゲラーが教授職(V.B.)によって支えられている。

注:このヒマチニューロンの培養法は、出生後0日ANK3-E22/23f/fマウスから、ゲイリー・バンカーのグリア/ニューロン共培養系から適応される。 従って、殺菌された用具を使用してきれいなフードで解剖した後のすべてのステップを行うことが重要である。このプロトコルは最大 1 か月かかります。図3にワークフローが表示されます。プロトコルはデューク大学の動物のガイドラインに従います.
1. カバーリップと神経メッキ料理の準備
<ol><li>培養日の少なくとも1週間前に、カバースリップラックにカバースリップを積み込み、硝酸(70%W/W)に一晩浸します(数日延長することができます)。</li>
	<li>硝酸処理されたカバーリップを、ガラス瓶の低速シェーカーに蒸留水で2回、それぞれ1時間洗浄します。</li>
	<li>飽和KOH中のカバーリップを一晩100%エタノールに溶解するインキュベート。溶解しなくなるまで、KOHをエタノールに加えます。</li>
	<li>蒸留水で洗浄工程を繰り返します。100%エタノールで10分間に1回のカバーリップをすすいすります。</li>
	<li>カバースリップをラックからガラスビーカーに移します。ビーカーをアルミホイルで覆います。カバーリップを一晩225°Cのオーブンで焼き、カバーリップを殺菌します。(カバーリップは何週間もビーカーに保存することができます)。</li>
	<li>ペトリ皿にカバースリップを入れ、カバースリップに3〜4ワックスドットを適用して足として機能させます。パスツールピペットを使用して、ガラス瓶にゆでたワックスを浸します。その後、カバースリップに素早く触れてドットを作成します。60 mm ペトリ皿は4つのカバーリップを握ることができる。10mmペトリ皿は~10個のカバーリップを保持できます。</li>
	<li>培養日の2日前に、カバースリップ(ワックスドット付きの側)を塗布し、フィルターを1 mg/mLポリL-リジンを0.1Mホウ酸(pH 8.5)で最低6時間塗布し、水で2回、1時間ずつすすをする。カバースリップは同じペトリ皿に残っています。</li>
	<li>めっき培地(MEMはグルコース0.6%(wt/vol)と10%(vol/vol)馬の血清を補充)をカバーリップを邪魔することなくゆっくりとプレートに加えます。培養日まで培養器にプレートを入れてニューロンをシードします。</li>
</ol>2. グリア細胞フィーダー料理の準備(培養日の2週間前)
<ol><li>出生後1日齢のマウスの脳から皮質を解剖し、髄液を剥がす。</li>
	<li>きれいなベンチできれいなペトリ皿にきれいなはさみで皮質組織をできるだけ細かく刻みます。</li>
	<li>刻んだ組織をHBSSの12 mLに移し、2.5%トリプシンと1%(wt/vol)DNaseの1.5 mLを加えます。37°Cの水浴で15分間インキュベートし、5分ごとにスイングします。よく消化された組織は粘着性になり、大きなクラスターを形成します。10 mLピペットで10-15回トリチュレートして組織を分解し、より良い消化を得る。</li>
	<li>ほとんどのチャンクが消え、媒体が曇りに変わるまで、5 mLピペットでよく消化された組織を10〜15回トリチュレートします。細胞ストレーナーを通過して残りの塊を取り除き、グリア培地(最小必須培地(MEM)にグルコース(0.6%wt/vol)、10%(vol/vol)馬血清、ペニシリン・ストレプトマイシン(1x)を加えて消化を止めます。</li>
	<li>細胞を120xgで5分間遠心し、上清を吸引する。新鮮なグリア培地で細胞ペレットを再懸濁し、細胞培養皿に種子を入れ替えます(約105細胞/cm2)。</li>
	<li>翌日、培地を新鮮なグリア培地に置き換え、未接続の細胞を除去します。</li>
	<li>3~4日ごとにグリアの新鮮なグリア培地でグリア料理を食べさせてくれ。フラスコを手で5~10回平手打ちし、緩やかに付着した細胞を取り除いてから培地を変える。</li>
	<li>10日間の培養後、グリア細胞はほぼコンフルエントであるべきである。0.25%トリプシン-EDTAでグリア細胞を取り外し、新しい60mm細胞培養皿に約105 個の細胞を播種します。残りのセルは、将来の使用のために凍結することができます。</li>
	<li>培養日の3日前に、グリア培地を神経細胞培地(1x GlutaMAX-Iおよび1x B27サプリメントを有するニューロバサル-A培地)に変更する。</li>
</ol>3. 培養海馬ニューロン
注: すべてのステップは室温で行われます。
<ol><li>部屋温帯でペトリ皿にHBSS培地を持つ ANK3-E22/23f/f マウスからの出生後1日齢の子犬から6-8カバピケを解剖する。解剖はさみで海馬を小さく刻みます。ペトリ皿から15mLチューブに海馬を移します。</li>
	<li>管のHBSSの5 mLと海馬2倍を洗う。海馬は洗浄後、1x HBSSの4.5 mLに放置します。</li>
	<li>2.5 mLのトリプシンを4.5mLのHBSSに加え、37°Cの水浴で15分間インキュベートします。チューブを5分ごとに反転します。よく消化された海馬は粘着性になり、クラスターを形成する必要があります。必要に応じて、消化をさらに5分間延長します。</li>
	<li>HBSSで海馬を3回、それぞれ5分間洗います。HBSSを取り外す場合は、真空を使用 しないでください 。海馬を取り除くのは非常に簡単です。</li>
	<li>洗浄後にHBSSの2 mLを追加し、パスツールピペットでカバカンピを上下にピペット15回追加します。</li>
	<li>火で研磨されたパスツールピペット(開いた直径が半分に狭い)で組織を10回トリチュレートします。まだチャンクが残っていても、10回を超 えないでください 。オーバーヒアリングはニューロンを殺す。</li>
	<li>すべてのチャンクが底に設定されるまで5分間チューブを休ませます。1 mL ピペットチップを使用して、解約したニューロンを含む上清をメッキ皿(105 細胞/60 mm皿)に移します。事前にインキュベートしためっき媒体に直接加え、プレートを軽く振ります。</li>
	<li>残りのチャンクの大部分が消えるまで、ステップ 3.6~3.7 を繰り返します。</li>
	<li>播種後2~4時間、めっき皿を軽顕微鏡で確認します。ニューロンの大半はカバースリップに取り付けられているはずです。接続されたセルは丸く明るいです。細かい先端鉗子を使用して、前もって調整された神経細胞培養培地を下向きのワックスドットで覆う。</li>
	<li>ニューロンは、グリア細胞フィーダー皿で最大1ヶ月間成長することができます。新鮮な神経培養培地の1 mLで7日ごとにニューロンを供給します。</li>
	<li>任意ステップ:播種後1週間、シトシンアラビノシド(1-β-D-アラビノシルシトシン)を5μMの最終濃度に加えてグリア増殖を抑制する。</li>
</ol>4. ニューロン開発初期段階におけるAnkyrin-GのノックアウトによるAISの破壊
<ol><li>3 div(in vitro)で、ワックスドット側を向いたカバーリップを、ニューロン培養培地を条件付きのグリア細胞フィーダー皿にひっくり返します。</li>
	<li>1.7 mLチューブに0.5μgのアンキリンG-GFP(WT/変異型)DNAを0.5 μgと混ぜて4つのカバーリップをトランスフェクトします(DNAコピー数の割合は~2:1)。100 μL の培養培地 (Opti-MEM など) を加え、ラックに混ぜて休みます。Cre-BFP のみがトランスフェクトされた場合、GFP プラスミドバックボーンを使用して DNA の総量に一致します。</li>
	<li>3 μLのトランスフェクション試薬(例えば、リポフェクトアミン2000)を100μLの培養培地と100μLの新しい1.7 mLチューブに混合します。RTで5分間インキュベートします。</li>
	<li>ステップ4.2のDNA溶液100μLをステップ4.3から100μLのトランスフェクション試薬と混合します。ラックの上で5〜10分間休みます。</li>
	<li>ステップ4.4からステップ4.4から50 μLのDNAミックスを、カバーリップに触れることなく、先端を媒体のすぐ下に挿入して追加します。DNAミックスの拡散を避けるためにゆっくりとピペット。</li>
	<li>ゆっくりと皿をインキュベーターに戻し、30〜45分間インキュベートします。</li>
	<li>カバースリップをホームグリアフィーダー皿に戻し、ワックスドットを下に向け、プレートをインキュベーターに戻します。</li>
</ol>5. 軸索初期セグメントの定量化
<ol><li>興味深いタンパク質の標準的な免疫細胞化学プロトコルに従って、7-10 div上のニューロンを修正し、AISマーカーで染色します。</li>
	<li>希望の顕微鏡で蛍光画像を収集します。<ol>
<li>Zシリーズセクションを取り、AIS全体の信号を収集します。すべての画像に同じ Z 深度を保ちます。</li>
		<li>最高のピクセル強度ダイナミックレンジに到達するためにレーザー強度を調整します。</li>
		<li>すべてのAIS写真が同じ顕微鏡設定で撮影されていることを確認してください。</li>
		<li>常にクレBFPの信号を確認してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>AIS の定量化<ol>
<li>フィジー(https://fiji.sc)と一緒に写真を開きます。</li>
		<li>Z シリーズ画像の最大投影を生成します。</li>
		<li>画像から空のカバースリップのバックグラウンド信号を引きます。</li>
		<li>AIS に沿って線を引きます。線の幅は AIS を完全にカバーする必要があります。AIS 信号がバックグラウンドの上に上がる前にラインを開始し、バックグラウンドにドロップした後で停止します。</li>
		<li>平均ピクセル強度をラインだけで測定し、スプレッドシートにエクスポートします(~10~15個のAIが必要です)。</li>
		<li>ベルガーらから適応MATLABスクリプトを使用してAISの平均強度曲線を生成します。</li>
		<li>各実験に対して、Cre onlyとCreプラスワイルドタイプ480 kDa ankyrin-Gトランスフェクションニューロンを陰性および陽性対照として含め、AISのノックアウトが効率を高め、救助が成功することを確認します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction%3A+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li>
<li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li>
<li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li>
<li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332(2017).</li>
<li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li>
<li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+activity+regulates+Na%28%2B%29+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li>
<li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li>
<li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li>
<li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Made+for+%22anchorin%22%3A+Kv7.2%2F7.3+%28KCNQ2%2FKCNQ3%29+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li>
<li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li>
<li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+ankyrin-G%3A+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li>
<li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

AISの組み立ては480 kDaアンキリン-Gによって組織される。しかし、ankyrin-Gは野生型ニューロンのAISを標的とすることができる短いアイソフォームを有し、AISアセンブリの構造機能解析の解釈が困難になる可能性がある。ここでは、AISのデノボアセンブリの研究を可能にするANK3-E22/23-floxマウスのニューロンを用いた方法を提示する。 3 divでCre-BFPでトランスフェクトすることにより、アンキリンGの内在性アイソフォームをすべて排除します。また、AISの形成を救うために480 kDa ankyrin-Gを共同トランスフェクトすることもできます。これにより、クリーンなシステムにおけるAIS形成の研究が可能になります。グリア細胞の過剰増殖を伴わずに生存率を向上させるバンカー培養システムをさらに採用することで、高いトランスフェクション効率に達し、AIS寸法の定量測定に十分なニューロンを提供することができました。
このプロトコルには、いくつかの重要な手順があります。最初の重要なステップは、AISの組み立てを防ぐのに十分早く、最...

軸索初期セグメントは、ほとんどの脊椎動物ニューロンの近位軸索に位置する。機能的には、AISは、この領域の電圧ゲートナトリウムチャネルの高密度のためにアクション電位が開始される場所です。いくつかの興奮性ニューロンのAISはまた、GABAergicシナプス1、2、3を形成することによって阻害性インターニューロンによって標的にされる。したがって、AISは細胞シグナル伝達を統合し、ニューロンの興奮性を調節する重要な部位である。AISは通常20~60μmの長さで、細胞体から20μm以内に位置しています。AIS の長さと位置は、脳領域全体のニューロンで異なります, 同様に同じニューロンの異なる発達段階で 4,5.蓄積された証拠は、AISの組成と位置が神経活動4、5、6、7の変化に応答するに動的であることを示唆した。
480 kDaアンキリンGはAISのマスターオーガナイザーです。480 kDa ankyrin-G は、電圧ゲート付きナトリウムチャネルに直接結合する膜関連アダプタタンパク質であり、β4-spectrin、KCNQ2/3 チャネルを含む他の主要な AIS タンパク質に直接結合し、ナトリウムチャネル活性8、9、および 186 kDa ニューロファスシンをAIS10に誘導する L1CAM である。480 kDa ankyrin-Gは、短い190kDaアンキリンGアイソフォーム(ANK反復、スペクトリン結合ドメイン、調節ドメイン)に見られる正規アンキリンドメインを共有するが、脊椎動物にのみ見られ、特にニューロンで発現している巨大なエキソンによって区別される(図1A)11、12。AIS形成12には、480kDaアンキリン-Gニューロン特異的ドメイン(NSD)が必要である。190 kDa ankyrin-G は、AIS アセンブリを促進したり、アンキリン-G-ヌルニューロン12で AIS を標的としたりしません。しかし、190kDaアンキリン-Gは480kDaアンキリン-G12を含むAISに集中している。野生型ニューロンの組み立てられたAISを標的とする190 kDa ankyrin-Gのこの能力は、文献の混乱の原因であり、AISアセンブリにおける480 kDa ankyrin-Gの重要な特殊機能の評価を遅らせてきた。したがって、組み立て済みのAISを欠いているankyrin-G-nullニューロンでAISアセンブリを研究することが重要です。
ここでは、ANK3-E22/23-floxマウスの培養海馬ニューロンを用いてAISの組み立てと構造を研究する方法を提示し、アンキリン-G13のアイソフォームをすべて排除する(図1B)。 AISが組み立てられる前にCre-BFP構造を持つニューロンをトランスフェクトすることによって、AISを完全に欠けているアンキリンG欠損ニューロンを生成した(図1B、図2)。AISのアセンブリは、クレBFPプラスミドを用いた480kDaアンキリン-G-GFPプラスミドの共同トランスフェクションに続いて完全に救出される。この方法は、事前にアセンブルされていない AIS 環境で AIS アセンブリを調査する方法を提供します。我々はまた、出生後マウスニューロンに適用するために、以前は胚性18ニューロンのために設計された抗生物質を使用せずにゲイリー・バンカーからグリアニューロン共培養システムを改変し、AIS14,15の変動を正常化するために複数のニューロンからのAIS測定を平均化するAIS定量法を適応した。

<table><tbody><tr><td>10xHBSS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>18mm カバーガラス (1.5D)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545-84-1D</td><td></td></tr><tr><td>190kDa アンキリン-G-GFP</td><td>Addgene</td><td>#31059</td><td></td></tr><tr><td>2.5% トリプシン フェノールレッドなし</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>480kDa アンキリン-G-GFP</td><td>ラボ ご要望</td><td>に応じて</td><td>提供</td></tr><tr><td>ANK3-E22/23f/fマウス</td><td>JAX</td><td>品番:029797</td><td>B6.129-ANK3TM2.1Bnt/J;</td></tr><tr><td>B27 無血清サプリメント</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>70 mmメッシュ付きセルストレーナー</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>セラミックカバースリップ染色ラック</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Cre-BFP</td><td>Addgene</td><td>#128174</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1286001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>MEM with Earle'塩とL-グルタミン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>ニューロベースルミディアム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>硝酸 70%</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>225711</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 還元血清培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31985062パラ</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26124-78-7</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr></tbody></table>

主培養海馬ニューロンを用いた軸索初期セグメントの組み立て研究

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

ニューロン軸索初期セグメント(AIS)は、作用電位の開始部位であり、分子構造、組立および活動依存性の可塑性について広く研究されている。AISのマスターオーガナイザーであるジャイアントアンキリンGは、膜をまたぐ電圧ゲート付きナトリウム(VSVG)およびカリウムチャネル(KCNQ2/3)、ならびにL1CAM細胞接着分子である186kDaニューロファシンと直接関連付けます。ジャイアントアンキリン-Gはまた、β-4-スペクトリン、および微小管結合タンパク質EB1/EB3およびNdel1を含む細胞質AIS分子に結合し、募集する。巨大なアンキリンGは、アンキリンG欠損ニューロンにおけるAIS形成を救うのに十分である。Ankyrin-Gはまた、AISの代わりに樹状脊椎に位置する小さな190 kDaアイソフォームを含み、AISに標的化したり、アンキリンG欠損ニューロンでAISを救出することができない。ここでは、ANK3-E22/23-floxマウスからの培養海馬ニューロンを用いたプロトコルについて説明し、Cre-BFPにトランスフェクトすると、アンキリンGのすべてのアイソフォームの喪失を示し、AISの形成を損なう。修飾されたバンカーグリア/ニューロン共培養システムを組み合わせて、AISの形成を救うのに十分な480 kDaアンキリンG-GFPプラスミドを持つアンキリンGヌルニューロンをトランスフェクトする方法を開発しました。さらに、サルザーと同僚が開発した定量方法を採用し、海馬ニューロン培養で起こるニューロン細胞体からのAIS距離の変動に対処する。このプロトコルは、AISのデノボアセンブリと動的挙動の定量的研究を可能にする。

実験の完全なセットは、陰性対照としてクレ-BFPのトランスフェクションのみを含む必要があります, Cre-BFPプラス 480 kDa ankyrin-Gは、正のコントロールとして、非トランスフェクションの状態を技術制御として.Cre-BFPのみ制御において、トランスフェクトされたニューロンは、AnkG(ankG)、β4-スペクトリン(β4)、ニューロファシン(Nf)および電圧ゲートナトリウムチャネル(VSVG)を含むAISマーカーの蓄積を欠いている(図4A)16。対照的に、Creと480 kDaアンキリン-G共トランスフェクションニューロンは、AISマーカーの存在によって明らかにされたAISを完全に組み立てている(図4B)。非トランスフェクションされた料理と比較して、培養の質を確認することが重要です。不健康なニューロンは、中止または異所AISのような異常なAIS構造を示す傾向がある(図4C)。
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ここでは、巨大なアンキリンGがないために組み立て済みのAISを欠く海馬ニューロンの軸索初期セグメント(AIS)の組み立てと構造を定量的に研究するプロトコルについて説明した。

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

このプロトコルは、巨大なアンキリンGがないために組み立てられたAISを欠いている海馬ニューロンの軸索初期セグメントの組み立てと構造を定量的に研究するために使用される。まず、出生後6~8匹の海馬、ペトリ皿にHBSS培地を持つ1日齢の子犬を解剖する。解剖はさみで海馬を小さく刻み、皿から15ミリリットルのチューブに移します。5ミリリットルのHBSSで海馬を2回洗い、洗浄後に4.5ミリリットルのHBSSに残します。2.5%トリプシンの0.5ミリリットルを4.5ミリリットルのHBSSに加え、37°Cのウォーターバスで15分間インキュベートし、5分ごとにチューブを反転させます。よく消化された海馬は粘着性になり、クラスターを形成する必要があります。必要に応じて、消化をさらに5分間延長します。HBSSで海馬を1回5分間3回洗います。洗浄後、HBSSを2ミリリットル加え、パスツールピペットでカバカンピを上下にピペットします。火でティッシュを磨いたパスツールピペットを10回トリチュレートし、すべての塊が底にセットされるまで5分間チューブを休ませます。残りのチャンクの大部分が消えるまで、分割を繰り返します。次に、1ミリリットルのピペットチップを使用して、解体したニューロンを含む上清をめっき皿にそっと移します。事前インキュベートされためっき媒体に直接加え、プレートを軽く振ります。播種後2~4時間、めっき皿を軽顕微鏡で確認します。ニューロンの大部分は、カバースリップに取り付けられているはずです.細かい先端鉗子を使用して、カバースリップを、前もって調整された神経細胞培養培地を含むグリア細胞フィーダーディッシュに反転させ、ワックスドット側を下向きにします。ニューロンは、グリア細胞フィーダー皿で最大1ヶ月間成長することができます。新鮮な神経細胞培養培地の1ミリリットルで7日ごとにニューロンを供給します。インビトロで3日目に、ワックスドット側を上に向けてカバースリップを、調節された神経細胞培養培地を備えたグリア細胞フィーダー皿に反転させます。CRE BFP DNAの0.25マイクログラムと0.5マイクログラムのアンキリンGFP DNAを1.7ミリリットルチューブに混ぜて、4つのカバースリップをトランスフェクトします。最適な100マイクロリットルを加えます。その後、チューブを混合し、ラックの上に置いた。CRE BFPのみがトランスフェクションされた場合、GFPプラスミックバックボーンを使用してDNAの総量に一致します。新しい1.7ミリリットルチューブに最適な100マイクロリットルのトランスフェクション試薬を3マイクロリットル混合し、室温で5分間チューブをインキュベートします。次に、以前混合したDNAの100マイクロリットルを100マイクロリットルのトランスフェクション試薬ミックスと混合し、ラックに5〜10分間放置します。カバースリップに触れることなく、先端を媒体のすぐ下に挿入して、各カバースリップの上にDNAミックスの50マイクロリットルを追加します。ピペットはゆっくりとDNAミックスを拡散しないようにします。ゆっくりと皿をインキュベーターに戻し、30〜45分間そこに置いておきます。カバースリップをホームグリアフィーダー皿に戻し、ワックスドット側を下に向け、皿をインキュベーターに戻します。AIS の定量化の場合は、フィジーで Z シリーズ画像を開き、画像の最大投影を生成します。空のカバースリップの背景信号を画像から引いた後、AIS に沿って線を引き、線の幅が AIS を完全に覆っていることを確認します。AIS 信号がバックグラウンドの上に上がる前にラインを開始し、バックグラウンドにドロップした後で停止します。線に沿って平均ピクセルの強度を測定し、スプレッドシートにエクスポートします。次に、MATLAB スクリプトを実行して、最終的な図を生成します。実験には、陰性対照としてトランスフェクションのみを含むCre-BFP、正の対照としてCre-BFPプラス480キロダルトンアンキリンGコトランスフェクション、および技術制御として非トランスフェクション状態を含める必要があります。Cre-BFPのみのコントロールでは、トランスフェクトされたニューロンは、アンキリンG、β4スペクトリン、ニューロファシン、および電圧ゲートナトリウムチャネルを含むAISマーカーの蓄積を欠いている。対照的に、Creと480キロダルトンアンキリン-G共トランスフェクションニューロンは、AISマーカーの存在によって実証されたAISを完全に組み立てています。非トランスフェクションされた料理との比較を通じて、培養の質を確認することが重要です。不健康なニューロンは、中止または異所AISのような異常なAIS構造を示す傾向がある。アンキリン-Gヒト神経発達障害突然変異がAIS集合体に与える影響を評価するために、平均AIS強度を相馬から遠位軸索にプロットした。AISの富化タンパク質は、通常、近位軸索からのシグナルの速い増加と遠位軸索への信号のゆっくりとした減少を示す。非トランスフェクトAISと整列すると、変異曲線は広く、曲線のピークは低く、AISの構造変化を示唆している。野生型アンキリンGは、非トランスフェクトされたものと密接に一致するAISを組み立てた。

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JoVE Journal

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