Name: 特注送達システムを用いた磁性ナノ粒子温熱療法のin vitroおよびin vivo送達 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 学ぶ磁性ナノ粒子温熱療法の正確な送達法。B16 F10マウス黑色素腫細胞を用いたin vitroおよびin vivo実験において、標的組織への局所加熱と熱線量モニタリングにより、再現性と安全性を確保する前臨床モデルでの治療手法です。

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この研究は、助成金番号(NCI P30 CA023108およびNCI U54 CA151662)によって資金提供されました。

ダートマス大学のアニマルケアおよび使用プログラムは、米国実験動物ケア認定協会(iAAALAC)の認定を受けており、すべてのUDSAおよびNIH(実験動物福祉局)のガイドラインおよび規制に準拠しています。すべてのin vivo研究は、ダートマス大学施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。安楽死の手順は、動物の安楽死に関する2020年のAVMAガイドラインに準拠しています。
1. システムの計装/設計
<ol><li>カスタムAMFアンテナ(コイル)を閉ループになるように設計し、目的の磁場を作成するための形状を選択します。発電機の選択によるインダクタンス式と特性を使用して、互換性のあるコイルを設計し、目的のフィールドを生成します。in vitro実験とin vivo実験に異なるデザインを使用してください。</li>
	<li>AMFアンテナのインダクタンスが発電機の許容範囲内にあることを確認してください。コンデンサを加算または減算して、アンテナを発電機に一致(調整)します。</li>
	<li>in vitro実験では、内径2 cm、長さ14 cmの14ターンヘリカルコイルを設計し、1.5 mLチューブを含めることができ、複数のサンプルを同時に処理できます。コイルをビニールポリマーで絶縁し、ポリスチレンスペーサーを使用してコイルをチューブから分離します。設計仕様と考慮事項の詳細は、 補足ファイル1に記載されています。</li>
	<li>in vivo実験では、独自の設計情報を持つメーカーからカスタムメイドの全身ヘリカルコイルを入手してください。8 mm角のチューブ(コイルのボア内でより均一な磁場を作成するため)と、目的の治療領域にコンセントレータを使用します。コンセントレーターを長さ5.0cmにし、合計5回転させて内径3.6 cm、外径5.2 cmにし、目的の治療領域にその位置を配置します。コイルをポリカーボネートシェルで囲みます。</li>
	<li>電源として定格10kW以上の調整可能な電力と周波数を備えたAMF発電機を使用してください。インダクタンスは、電源とアンテナ/コイルを0.62〜1.18μHenries(μH)の範囲に一致させ、30〜300kHzの範囲の周波数を可能にします。50psiに調整された圧力ブーストポンプを介してリサイクル水を使用して発電機を冷却します。</li>
	<li>AMFアンテナを介して水で希釈された5.6%エチレングリコールベースの熱伝達流体をポンプで送る25トンの冷却能力チラーでコイルを冷却します。チラーの温度を、アンテナがサンプルを加熱または冷却しないように設定します。</li>
	<li>動物の収容のために、ホルダーとコイル表面の間に0.5cmのエアギャップがあるコイルの中央に吊り下げることができる管状ホルダーを構築します。コイルの周りのシェルを通して空気を循環させる調整可能な調整済みエアポンプを接続し、通常の動物のコア温度を維持するように設定します。麻酔器を動物の頭の近くの管状の動物ホルダーに接続して、麻酔が適切に行われるようにします。</li>
	<li>セル封じ込めのために、水浴からの水をチューブが配置されているスペーサーを通して循環させる装置を作成します。チューブが水に囲まれるようにこのウォーターバスの温度を37°Cに設定します。</li>
	<li>光ファイバープローブを使用して、腫瘍、動物のコア、および動物環境内の温度を監視したり、in vitro研究のために、細胞ペレットの温度とチューブの周囲の水をモニターしたりします。</li>
	<li>すべての実験で100nmサイズの磁性酸化鉄ナノ粒子を使用してください。 注:濃度と比吸収率(SAR)は、可能な加熱と熱線量に直接影響するため、ナノ粒子を選択する際に考慮しなければならない2つの特性です18。</li>
</ol>2.インビトロでの温熱療法
<ol><li>B16F10マウスメラノーマ細胞をRPMI培地で10%FBSおよび1%ペン/連鎖球菌で培養します。150, 000細胞/ウェルを6ウェルプレートにプレートし、2mLの完全培地を入れます。</li>
	<li>各ウェル、すなわち、mNPがなくAMFがない細胞、mNPがなくAMFがない細胞、mNPがなくAMFがない細胞、mNPとAMFがある細胞など、適切な治療法を決定します。 注:さらに、温熱療法を別の治療法と組み合わせる場合は、適切なコントロールがあることを確認してください。AMFは、必要な電力および冷却機能を備えた標準的な研究ベンチラボで実行されます。</li>
	<li>めっきの24時間後、前のステップで決定したように、mNPを適切なウェルに追加します。mNPを3 mgの鉄/ mLの濃度に添加します。.ストック培地/mNP溶液を作成するか(古い培地を除去し、この溶液を追加する)、またはmNPを直接穏やかに旋回させるプレートを追加して均質に分配することにより、mNPがウェル全体に分布していることを確認します。</li>
	<li>mNPを添加してから48時間後、ウェルが~80%コンフルエントになったら、培地を除去し、ウェルを新鮮な培地で洗浄して処理を開始します。メディアを取り出します。</li>
	<li>処理する各ウェルに0.5 mLのトリプシンを加え、穏やかに渦巻きます。顕微鏡を使用して、細胞が剥離していることを確認します。</li>
	<li>各ウェルに1 mLの培地を加えて、細胞を1.5 mLチューブに回収します。ウェルからすべての細胞を採取します(~1 x 106 細胞)。ウェルごとに明確にラベル付けされた個別のチューブを使用してください。</li>
	<li>チューブを60 x g で2〜3分間スピンして、細胞をペレット化させます。ペレットを培地に保持します。</li>
	<li>コイル内の水で満たされたスペーサーにチューブを配置します。培地および細胞ペレットが37°Cに維持されるように水浴の温度を設定する。 別々の光ファイバー温度プローブを使用して、チューブとウォーターバス内の温度を監視します。</li>
	<li>チラーの電源を入れ、クーラントがコイルを通って流れていることを確認します。電源をオンにし、目的のフィールドに対する最大値のパーセントを調整します。10 kWの発電機を動力源とする14ターンソレノイドコイルを165 kHzおよび23.87 kA / m(300 Oe)で操作します。</li>
	<li>別の光ファイバー温度プローブをチューブの1つに配置します。以前に決定されたプロトコル熱線量まで細胞を処理する。例は、43°Cで30分です(CEM43の30)。</li>
	<li>チューブ内の培地に細胞を再懸濁し、新しい6ウェルプレートに再プレートします。新しいプレートに明確なラベルを付けます。目標は、収集されたすべての細胞(~1 x 106 セル)を再プレートすることです。 注:新しい6ウェルプレートを使用して、培養する細胞が処理を受けていることを確認する必要があります。古いプレートを使用した場合、トリプシン処理に成功しなかった細胞がプレートに残っている可能性があります。</li>
	<li>必要に応じて、次の実験手順のために、RNAまたはタンパク質発現分析のために細胞を溶解します。</li>
</ol>3.生体内温熱療法
<ol><li>細胞培養と接種<ol><li>B16F10マウスメラノーマ細胞をRPMI培地で10%FBSおよび1%ペン/連鎖球菌で培養します。希望する数の動物を接種するのに十分な細胞を提供するプレート/皿を使用してください。例えば、100, 000細胞で播種された10, 100 mmディッシュは、48時間以内に20匹のマウス注射に十分な細胞とコンフルエントになります。</li>
		<li>細胞をトリプシン処理し、純粋なRPMI培地(FBSまたはペン/連鎖球菌を含まない)を使用して収集します。</li>
		<li>細胞をカウントし、接種量とマウス数に基づいて、所望の細胞濃度の溶液を作成します。</li>
		<li>気化したイソフルランと酸素を使用して、6週齢の雌C57Bl / 6マウスを麻酔します。誘導されるまで、動物を5%イソフルランと95%酸素を含むプレキシガラスボックスに入れます。.誘導されたら、動物を取り除き、2%イソフルランでフェイスコーンを使用して、ステップ3.1.5-3.1.7および3.3.3-3.3.6を完了します。 注:治療中の麻酔には、内蔵の麻酔封じ込めを使用してください。マウス麻酔のための標準的な施設プロトコルに従ってください。動物実験の前に、適切なIACUCの承認を確認してください。麻酔後、動物をケージに戻し、回復を監視して合併症がないことを確認します。</li>
		<li>右反射神経に対する反応の欠如を確認します。</li>
		<li>電気かみそりを使用して右脇腹を剃ります。</li>
		<li>アルコールワイプで注射部位を清掃します。1〜2 x 106 細胞を注入し、28 G針を備えた100 μLのガラスシリンジを使用して、麻酔をかけた右脇腹の皮内に50 μLの培地に分散させます。</li>
	</ol></li>
	<li>腫瘍増殖/ナノ粒子注入<ol><li>ノギス(長さ、幅、深さ)を使用して腫瘍を3次元で測定し、(長さx幅x深さx深さx π)/ 6で体積を計算します。</li>
		<li>腫瘍体積が120 mm 3(+/- 20 mm3)に達したら、動物を研究対象にします。併用療法コホート(すなわち、対照、mNPH、放射線、および組み合わせ)を含む適切な対照群と治療群があることを確認して、研究を設計します。</li>
		<li>3.1.4で説明されているように、mNPを投与されるマウスを麻酔します。</li>
		<li>アルコールワイプでその領域をきれいにします。AMF治療の3時間前にmNPを腫瘍に注射します。用量が7.5mgの鉄/ cm3 の腫瘍であるような量を注入する。 注:ラボからの未発表データは、最大mNP取り込みが3〜6時間で起こることを示唆しています。</li>
	</ol></li>
	<li>AMF治療<ol><li>マウスを麻酔し、コア温度を維持するために加熱パッドに置きます。</li>
		<li>右反射神経に対する反応の欠如を確認します。マウスのイヤータグまたはその他の金属物を取り外します。</li>
		<li>潤滑された光ファイバー温度プローブをマウスの直腸にそっと置きます。</li>
		<li>カテーテルを腫瘍に挿入し、針を取り除きます。腫瘍からあまり突き出ないようにカテーテルを切断します。 注:光ファイバー温度カテーテルは、マウスが全身麻酔下にある間、つまり、腫瘍加熱手順中にのみカテーテルが所定の位置にある間に配置および除去されます。マウスには、手順時にNSAID鎮痛薬であるケトプロフェン(5 mg / kg)の単回皮下投与が与えられます。カテーテルの留置に関連する短期または長期の不快感または罹患率は観察されていません。</li>
		<li>3センサーの光ファイバー温度プローブをカテーテルに挿入します。カテーテルは、光ファイバー温度プローブセンサーを保護します。</li>
		<li>直腸および腫瘍内プローブを動物の尾にテープで固定して、それらが所定の位置に留まるようにします。</li>
		<li>マウスを50 mLチューブに入れ、頭を下に向けてください。チューブには、麻酔が接続されて配信される頭の近くに穴が必要です。</li>
		<li>セットアップされたコイル内にチューブを配置し、麻酔を再接続します。</li>
		<li>光ファイバー温度プローブをチューブに緩く配置して、環境温度を測定します。</li>
		<li>チラーの電源を入れ、クーラントが循環していることを確認します。</li>
		<li>コンピュータソフトウェアがさまざまな温度を表示していることを確認し、CEM43計算をリアルタイムで表示できるように記録を開始します。必要なCEM43は、以前に決定された用量です。 注意: 磁石をオンにする前に、金属物が急速に熱くなるため、動物に金属物が付着していないことを確認してください。さらに、部屋の全員がペースメーカーを持っていないこと、そして彼らがそこにいても安全であることを確認してください。</li>
		<li>低電力パーセンテージで磁石をオンにします。</li>
		<li>光ファイバー温度プローブが温度変化を記録していることを確認します。フィールドが増加するにつれてAMFがアクティブになると、温度は上昇します。動物のコア温度が38°Cのままであることを確認してください。 調整されたエアジャケットを使用してコア温度を調整します。</li>
		<li>腫瘍の温度レベルを制御する内蔵の制御ダイヤルを使用して、発電機の電源を変更することにより、磁場の強さを調整します。</li>
		<li>AMFを一度所望の用量で遮断することは、使用者によって予め決定されるように(例えばCEM43 40)、腫瘍内で達成される。</li>
		<li>AMFがシャットダウンしたら、コイルからチューブを取り外します。</li>
		<li>マウスをチューブから取り外し、さまざまなプローブとカテーテルを抽出します。必要に応じて、新しい金属製の耳タグで動物にタグを付けます。</li>
		<li>処理が完了したら、チラーをシャットダウンします。</li>
		<li>動物を麻酔から回復させ、合併症がないことを確認します。彼らの行動を監視して、正常に戻ることを確認します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

このシステムの設計と実装は、正確で再現性のあるin vitroおよびin vivo磁性ナノ粒子ハイパーサーミア実験を実施する能力を提供します。AMFの周波数と電界強度が磁性ナノ粒子の種類、濃度、および組織の位置と温度に適切に一致するようにシステムを設計することが重要です。さらに、リアルタイムで温度を正確に監視することは、安全性と正確な熱線量(43°C/ CEMでの累積等価分)の計算にとって非常に重要です。図 1に示すようにプローブを配置することで、 図2に示すように、熱線量と深部体温をリアルタイムで監視できます。
磁性ナノ粒子ハイパーサーミアの正確な送達の最初のステップは、動物とオペレーターにとって安全なシステムを構築することです。システムのすべてのコンポーネントは、運用と配信の観点からもよく理解する必要があります。この状況では、AMF渦電流の可能性を理解し、磁性粒子がどこにあるかを知ることを意味します。アンテナ、またはコイルは、フィールドの形状と強度の重要な要素...

温熱療法は歴史的に、単独で、または他の治療法と組み合わせて、癌治療に使用されてきました。それは長い使用の歴史を持っていますが、この治療を提供するための最も有利な方法はまだ議論されており、病気の部位と場所に依存します。温熱伝導の方法には、マイクロ波、高周波、集束超音波、レーザー、および金属ナノ粒子(金や酸化鉄など)が含まれます1,2,3,4。これらの送達方法は、発熱レベルから数百°Cまでの範囲の治療温度につながる可能性があります。温熱療法の生物学的効果は、主に使用される温度と治療期間に依存します5。この論文と目的のために、磁性ナノ粒子ハイパーサーミア(mNPH)に焦点を当てています。この方法では、毒性のないFDA承認の酸化鉄ナノ粒子を使用して、焦点を絞って局所化し、十分に監視し、制御した温度変化を可能にします。
他の温熱療法の落とし穴の1つは、正確な細胞ターゲティングの欠如です。温熱療法は本質的に高い治療比を持たないため、慎重な体温測定とターゲティングが必要です6。mNPHは、mNPの全身的または腫瘍内注射を可能にし、mNPが位置する場所でのみ熱が発生するため、腫瘍に直接治療を標的にします。mNPHは、磁性ナノ粒子が細胞の内側または外側にある場合に有効です。癌治療の場合、mNPHの一般的な概要は、磁性ナノ粒子が注入され(腫瘍内または静脈内に)、次に交番磁場が印加され、ナノ粒子磁極が絶えず再整列し、ナノ粒子に関連する細胞および組織の局所的な加熱をもたらすことです7,8.ナノ粒子の体積と交流磁場(AMF)の周波数/強度を調整することにより、組織内で発生する温度を注意深く制御することができます。
この治療法は、より深い腫瘍がより強いAMFを必要とするため、渦電流加熱のリスクが高まるため、体表面近くの腫瘍でうまく機能します9。ハイパーサーミアが単剤療法として臨床的に使用されているという証拠がありますが、多くの場合、ハイパーサーミアは放射線療法または化学療法と組み合わされ、より標的を絞った抗がん効果につながります10,11,12。放射線療法と組み合わせて機能する温熱療法の臨床的証拠は、以前の出版物でレビューされています13。私たちの研究室では、mNPH法12,14,15を用いて、マウスからブタ、イヌの自然がんまで、さまざまな動物の治療に成功しています。このプロトコルは、単独で、または他の治療法と組み合わせて、局所的な温熱療法の効果を調査することに関心のある人のために設計されています。
温熱療法の最も重要な要素の1つは、標的/腫瘍組織に送達される熱線量をリアルタイムで測定および理解できることです。線量を計算および比較する標準的な方法は、43°Cでの加熱の累積等価分数のデモンストレーションによるものです。このアルゴリズムは、送達システム、最高温度および最低温度(特定の範囲内)、および加熱/冷却パラメータ5,16とは無関係の用量の比較を可能にする。CEM計算は、39〜57°C5の温度に最適です。たとえば、私たちが実施したいくつかの研究では、CEM43 30(つまり、43°Cで30分)の熱線量を選択しました。この線量を選択することで、単独で、または単回線量の放射線と組み合わせて、in vitroで安全で効果的な免疫遺伝学的効果を調べることができました17。
磁性ナノ粒子温熱療法では、適切な送達システムを構築する際に考慮する必要があるいくつかの要因があります。計装設計には、高電力で動作している場合でも磁場供給装置を冷却するためのチラーの使用や、すべての温度、電力評価、および制御システムがアクティブになっていない場合にシステムの電源がオンにならないようにするフェイルセーフ手順など、重要な安全要素が含まれています。さらに、in vivoとin vitroの両方の状況で考慮する必要がある重要な生物学的要因があります。培養細胞を使用する場合、結果に影響を与える可能性のある生理学的変化を避けるために、増殖培地で処理し、一定の生菌温度に維持する必要があります。個々のナノ粒子タイプについては、AMFベースの加熱パラメータを計算する際に比吸収率(SAR)を知ることが重要です。同様に、所望の加熱を達成するために必要な細胞および組織中のmNP/Fe濃度を知ることも重要である。in vivo法では、治療中は動物を麻酔下で維持し、治療中は動物の深部体温を正常なレベルに維持する必要があるため、細部にさらに注意を払う必要があります。麻酔下で起こるように、動物の体温を下げることを許容することは、治療される組織の熱線量に関して、全体的な結果に影響を与える可能性があります。
この原稿では、汎用性の高い磁性ナノ粒子ハイパーサーミアシステムの設計と構築に使用される方法と、考慮する必要のある重要な使用要因について説明します。記載されたシステムは、磁性ナノ粒子温熱療法の堅牢で、一貫性があり、生物学的に適切で、安全で、十分に制御された送達を可能にする。最後に、私たちが実施するmNPH研究には、放射線療法、化学療法、免疫療法などの他の治療法が含まれることが多いことに注意してください。これらの結果が意味のあるものであるためには、供給された熱が他のモダリティの有効性および/または安全性毒性(またはその逆)および動物の幸福にどのように影響するかを判断することが重要です。このため、前述の線量測定および治療状況のために、磁性ナノ粒子温熱療法の投与精度と連続的なコアおよびターゲット温度測定に厳密に注意を払うことが不可欠です。このプロトコルの目標は、安全で効果的な磁性ナノ粒子温熱療法の送達のための簡単で一貫した方法と説明を提供することです。

<table><tbody><tr><td>.25% トリプシン</td><td>コーニング</td><td>45000-664</td><td>多くの企業から入手可能</td></tr><tr><td>1.5 mL チューブ</td><td>エッペンドル</td><td>フ エッペンドルフ 22363204</td><td>多くの企業から入手可能</td></tr><tr><td>B16F10 マウス黒色腫細胞</td><td>アメリカンタイプ培養コレクション</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>C57/Bl6 マウス</td><td>チャールズ川</td><td>027C57BL/6</td><td>6週齢の雌マウス</td></tr><tr><td>チラー</td><td>コイル</td>を冷却するサーマルケア<td>NQ 5シリーズ</td><td>チラー</td></tr><tr><td>クーラント液</td><td>ダウケミカルカンパニー</td><td>ダウサームSR-1</td><td>アンテナ冷却液</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ハイクロン</td><td>SH30071</td><td>多くの企業から入手可能</td></tr><tr><td>光ファイバープローブ、ソフトウェア、シャーシ</td><td>FISO</td><td></td><td>FISOエボリューションソフトウェア 温度を読み取るために使用されます</td></tr><tr><td>IRカメラ</td><td>Flir</td><td></td><td>赤外線カメラ 意図しない加熱を監視する</td></tr><tr><td>酸化鉄ナノ粒子</td><td>micromod Partikeltechnologie GmbH</td><td>Bionized NanoFerrite</td><td>デキストランコーティング 酸化鉄ナノ粒子</td></tr><tr><td>マウスコイル、ソレノイド</td><td>Fluxtrol</td><td>カスタムビルド</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>コーニング</td><td>45000-652</td><td>多くの企業から入手可能</td></tr><tr><td>RFジェネレータ</td><td>Huttinger</td><td>TIG 10/300</td><td>電源</td></tr><tr><td>RPMI メディア</td><td>Corning</td><td>45000-396</td><td>多くの企業から入手可能</td></tr></tbody></table>

特注送達システムを用いた磁性ナノ粒子温熱療法のin vitroおよびin vivo送達

In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

温熱療法は癌の治療に長い間使用されてきました。技術は、高温の鉄棒の腫瘍内挿入から、39°C(発熱レベル)から1,000°C(電気焼灼)の温度および数秒から数時間の治療時間での全身送達腫瘍抗体標的磁性ナノ粒子までさまざまです。温度-時間関係(熱線量)は、組織のアブレーションをもたらす高熱線量と、血流の増加、薬物の蓄積、免疫刺激などの亜致死効果をもたらす低熱線量での効果を決定します。現在最も有望な治療法の1つは、磁性ナノ粒子温熱療法(mNPH)です。この技術は、非侵襲的、非毒性の交流磁場で全身的または腫瘍内に送達され得る磁性ナノ粒子を活性化することを含む。磁性ナノ粒子のサイズ、構造、会合、および磁場の周波数と電界強度は、主要な加熱決定要因です。私たちは、大小動物モデルや培養細胞に再現性のある磁性ナノ粒子ハイパーサーミアを提供するための高度な機器と技術を開発しました。このアプローチは、複数の場所で継続的なリアルタイムの温度モニタリングを使用して、非標的組織の加熱を制限しながら、標的組織(腫瘍)または細胞に明確に定義された熱線量を送達することを可能にします。複数のサイトでの温度の正確な制御と監視、および業界標準のアルゴリズム(43°C/CEM43での累積等価分)の使用により、熱線量の正確な決定と定量化が可能になります。さまざまな温度、熱線量、生物学的効果を可能にする当社のシステムは、商業的買収と社内のエンジニアリングおよび生物学の開発を組み合わせて開発されました。このシステムは、エキソビボ、インビトロ、およびインビボ技術間の迅速な変換を可能にする方法で最適化されています。このプロトコルの目的は、再現性のある正確な磁性ナノ粒子療法(mNP)温熱療法を提供するための効果的な技術とシステムを設計、開発、および実装する方法を実証することです。

インビトロ研究 細胞は、磁性ナノ粒子/鉄とAMFの量と濃度が適切に一致している場合にのみ、所望の温度と熱線量を達成および維持します。磁性ナノ粒子を使用してin vitro(およびin vivo)で細胞を加熱する場合、内部化された磁性ナノ粒子を有する細胞で温熱を達成するためには、特定のレベルの細胞内mNP / Feが必要であり、mNP負荷細胞の数と近接性が必要になることに注意してください。標的細胞/組織内のmNP / Feのレベルが加熱効果を達成するのに十分である場合、磁場の周波数と強度を調整して、目的の温度と効果を達成できます。適切にメッキされれば、異なる用量とタイミングの間の遺伝的および分子的違いを調べるさらなる研究を追求することができます17。図1は、インビトロ法の概略 図 を表す。
これらのin vitroメソッドは、細胞のmRNAおよびタンパク質発現変化を調べるために使用できます。私たちの研究室の最近の例では、CEM43 30 ...

このプロトコルは、高度な送達および監視システムを使用して、磁性ナノ粒子温熱の正確な送達に必要な技術と方法論を提示します。

Hyperthermia has long been used in the treatment of cancer. Techniques have varied from the intra-tumoral insertion of hot iron rods, to systemically ...

この方法は、前臨床モデルで磁性ナノ粒子温熱療法を提供するための最も堅牢で再現性の高い方法を提供するため、重要です。この技術により、局所環境、動物生理学、熱線量を正確に監視および制御することにより、ナノ粒子温熱療法の正確かつ一貫した送達が可能になります。このプロトコルを試みるときは、ナノ粒子の加熱は標的組織に限定されたままでなければならないことに留意してください。B16 F10マウスメラノーマ細胞をめっきしてから24時間後、マウスメラノーマ細胞は磁性ナノ粒子を添加し、最終濃度を1ミリグラムあたり3ミリグラムのイオンにします。ナノ粒子がウェル全体に均一に分布していることを確認するために、あらかじめ媒体と磁性ナノ粒子のストック溶液を作成します。ナノ粒子を添加してから48時間後、処理する各ウェルに0.5ミリリットルのトリプシンを加え、プレートを穏やかに渦巻かせます。顕微鏡を使用して、細胞が剥離していることを確認します。次に、各ウェルに1ミリリットルの培地を追加し、各ウェルに明確にラベル付けされた別々のチューブを使用して、すべての細胞を1.5ミリリットルのチューブに収集します。チューブを60Gで2〜3分間回転させて、細胞をペレット化します。次に、コイル内の水で満たされたスペーサーにチューブを置きます。ウォーターバスの温度を設定して、培地とセルパレットを摂氏37度に維持します。チューブとウォーターバス内の温度を監視するために、個別の光ファイバー温度プローブをセットアップします。チラーをオンにし、クーラントがコイルを流れていることを確認します。次に、電源をオンにし、最大値のパーセントを目的のフィールドに調整します。10キロワットの発電機で駆動される14回転ソレノイドコイルを165キロヘルツ、23.87キロアンペア/メートルで操作します。以前に決定されたプロトコルの熱線量に達するまで細胞を処理します。処理後、ペレット化した細胞をチューブ内の培地に再懸濁し、明確にラベル付けされた新しい6ウェルプレートに再播種します。マウスに麻酔をかけた後、アルコールワイプで腫瘍を洗浄します。AMF治療の3時間前に磁性ナノ粒子を腫瘍に注入します。3時間後、マウスに再度麻酔をかけ、立ち直り反射に対する反応がないかどうかを確認します。イヤータグまたはマウス上のその他の金属物を取り外し、潤滑された光ファイバー温度プローブを直腸にそっと置きます。カテーテルを腫瘍に留置します。針を外します。次に、カテーテルが腫瘍から突き出すぎないようにカテーテルを切断します。3センサーの光ファイバー温度プローブをカテーテルに挿入し、センサーを保護します。直腸および腫瘍内プローブを動物の尾にテープで固定します。マウスを50ミリリットルのチューブに入れ、頭の近くに麻酔を接続して送達できる穴があります。チューブをコイルセットアップ内に置き、麻酔を再接続します。光ファイバー温度プローブをチューブにゆるく配置して、環境の温度を測定します。次に、チラーをオンにして、クーラントが循環していることを確認します。コンピュータソフトウェアがさまざまな温度を表示していることを確認し、記録を開始して、必要なCEM43線量が事前に決定されているはずの場所にCEM43計算をリアルタイムで表示できるようにします。低電力で磁石をオンにしますtage、光ファイバー温度プローブが温度変化を記録していることを確認します。要するに、動物のコア温度は摂氏38度のままで、調整されたエアジャケットでそれを調節します。腫瘍内の温度レベルを制御する電力を変更することにより、磁場の強度を調整します。目的の用量が達成されたら、AMFを停止します。.コイルからチューブを取り外し、マウスをチューブから取り外します。次に、チラーをシャットダウンします。プローブとカテーテルを取り出し、必要に応じて、新しい金属製の耳タグで動物にタグを付けます。麻酔からの回復中にマウスを監視し、マウスが正常な行動を再開し、合併症がないことを確認します。in vivo低体温症の場合、リアルタイムの有効性と安全性評価のために、できるだけ多くの光ファイバー温度プローブを戦略的な場所に配置することが重要です。これらのプローブにより、実験全体を通して温度を記録することができ、正確な線量測定と熱履歴が可能になります。ここでは、in vivo実験中に生成された曲線を示しており、温度を綿密に監視し、腫瘍の温度を所望の範囲内に維持するようにシステムを調整する能力を強調しています。ボルケーノプロットは、in vitroおよびin vivoの磁性ナノ粒子温熱療法後に発現差のある遺伝子を示しており、分子技術を使用して温熱療法の効果をモニターする方法を示しています。腫瘍温度、動物の深部体温、および熱線量の正確なモニタリングは、治療を一貫して実施するために必要です。ハイパーサーミア後、治療の効果とメカニズムを理解するために、さまざまな分析を行うことができます。また、より大きな治療効果を得るために、他の治療法も実施することができます。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

付着したマウスミクログリア細胞をマルチウェルプレートに収めます。ポリアクリル酸でコーティングされた磁性ナノ粒子(MNP)をテストウェルに追加し、別のウェルをコントロールとして未処理のままにします。細胞をインキュベートしてエンドサイトーシスを介してMNPを取り込み、内在化を可能にします。バッファーで洗浄して、結合していないMNPを除去します。酵素溶液を加えて細胞を剥離します。分離した細胞をチューブに移し、遠心分離してペレット化します。上清を廃棄し、ペレットを基礎培地に再懸濁し、懸濁液を微量遠心チューブに移します。磁気アプリケーターデバイス内の銅コイルの中心にチューブを配置します。コイルは交流磁場 (AMF) を生成し、アプリケーターは一定の目標温度を維持します。AMF は MNP...

マウスミクログリア細胞における磁気温熱誘発性細胞損傷

MRI互換カスタム設計レーザーベースの加熱装置は、具体的には、腫瘍領域で感熱性リポソームからの薬剤の放出を活性化するために、皮下腫瘍の局所加熱を提供するために開発されてきました。...

磁気共鳴画像誘導による感熱リポソームからのシスプラチンのトリガリリースのためのカスタム設計されたレーザーベースの加熱装置

この原稿は、PEI / MNPベクター及びその磁化により内皮細胞へのmiRの効率的な、非ウイルス送達を記載しています。このように、遺伝的改変に加えて、このアプローチは、磁気細胞ガイダンスやMRIの検出能が可能になります。技術は、治療用細胞製品の特性を改善するために使用することができます。...

準備と<em&gt;インビトロ</em磁化のmiR修飾内皮細胞の&gt;キャラクタリゼーション

この原稿では、化学反応を伴わない温度誘導エマルジョンによる磁気感熱性ミクロゲルの調製について説明します。これらの感受性ミクロゲルは、磁気的および熱的に誘発される薬物放出における潜在的な使用のためにポリ（ N-イソプロピルアクリルアミド ）（PNIPAAm）、ポリエチレンイミン（PEI）およびFe 3 O 4 -NH 2ナノ粒子を混合することによって合成された。...

磁気および感熱性ポリ（<em&gt; N</em&gt; - イソプロピルアクリルアミド）ベースのミクロゲル

ここでは、自己集合体を介した酸化鉄ナノ粒子殻状マイクロバブル(NSM)の製造プロトコルであり、磁気高熱および光熱併用がん治療のための1つのナノ治療プラットフォームにおける磁気、音響、および光応答性を相乗化する。...

磁気温熱療法とポト温熱併用がん治療のための磁気、音響、光三重応答性マイクロバブル

ここに提示されるのは、横紋筋肉腫マウスモデルにおいて温度感受性リポソームからの薬物放出を引き起こすために、磁気共鳴ガイド下高強度集束超音波によって生成される制御された温熱療法を使用するプロトコルです。...

磁気共鳴ガイド下高強度集束超音波生成温熱療法:マウス横紋筋肉腫モデルにおける実行可能な治療法

血液脳関門は、治療法がない病気である膠芽腫の治療を提供する上で大きなハードルです。ここでは、サイズによってこの生理学的障壁を回避し、腫瘍に蓄積できる in vivo 画像誘導酸化鉄治療用ナノプラットフォームを報告します。...

神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達

このプロトコルは、固形腫瘍モデルにおける標的温熱療法に必要な技術と方法論を提示します。このアプローチは、腫瘍内に注入された金ナノロッドによる近赤外光の光熱変換を利用して、腫瘍微小環境内で局所的な加熱を誘導します。...

腫瘍内金ナノロッドによる近赤外光の光熱変換によるマウス腫瘍モデルにおける標的軽度温熱療法の誘導

この記事では、遺伝子デリバリー研究やIVISの生物発光イメージング法を用いて遺伝子発現のその後の分析のための患者の組織切片の文化を説明します。...

遺伝子デリバリーの患者の組織及び審査のex vivoでの文化

例えば、高血圧または心筋梗塞などの心血管疾患のマウスモデルにおける心筋細胞送達は、回生広く研究において、異なる細胞型の治療可能性を試験するために使用される。そのため、詳細な説明およびこの外科処置の明確な可視化は、小型げっ歯類の心血管細胞治療の分析の限界と利点を定義するのに役立ちます。...

心筋内細胞送達：マウスハーツの観測

学ぶ磁性ナノ粒子温熱療法の正確な送達法。B16 F10マウス黑色素腫細胞を用いたin vitroおよびin vivo実験において、標的組織への局所加熱と熱線量モニタリングにより、再現性と安全性を確保する前臨床モデルでの治療手法です。

特注送達システムを用いた磁性ナノ粒子温熱療法のin vitroおよびin vivo送達

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