特注送達システムを用いた磁性ナノ粒子温熱療法のin vitroおよびin vivo送達
2020年7月2日
このプロトコルは、高度な送達および監視システムを使用して、磁性ナノ粒子温熱の正確な送達に必要な技術と方法論を提示します。
この方法は、前臨床モデルで磁性ナノ粒子温熱療法を提供するための最も堅牢で再現性の高い方法を提供するため、重要です。この技術により、局所環境、動物生理学、熱線量を正確に監視および制御することにより、ナノ粒子温熱療法の正確かつ一貫した送達が可能になります。このプロトコルを試みるときは、ナノ粒子の加熱は標的組織に限定されたままでなければならないことに留意してください。
B16 F10マウスメラノーマ細胞をめっきしてから24時間後、マウスメラノーマ細胞は磁性ナノ粒子を添加し、最終濃度を1ミリグラムあたり3ミリグラムのイオンにします。ナノ粒子がウェル全体に均一に分布していることを確認するために、あらかじめ媒体と磁性ナノ粒子のストック溶液を作成します。
ナノ粒子を添加してから48時間後、処理する各ウェルに0.5ミリリットルのトリプシンを加え、プレートを穏やかに渦巻かせます。顕微鏡を使用して、細胞が剥離していることを確認します。次に、各ウェルに1ミリリットルの培地を追加し、各ウェルに明確にラベル付けされた別々のチューブを使用して、すべての細胞を1.5ミリリットルのチューブに収集します。
チューブを60Gで2〜3分間回転させて、細胞をペレット化します。次に、コイル内の水で満たされたスペーサーにチューブを置きます。ウォーターバスの温度を設定して、培地とセルパレットを摂氏37度に維持します。
チューブとウォーターバス内の温度を監視するために、個別の光ファイバー温度プローブをセットアップします。チラーをオンにし、クーラントがコイルを流れていることを確認します。次に、電源をオンにし、最大値のパーセントを目的のフィールドに調整します。
10キロワットの発電機で駆動される14回転ソレノイドコイルを165キロヘルツ、23.87キロアンペア/メートルで操作します。以前に決定されたプロトコルの熱線量に達するまで細胞を処理します。処理後、ペレット化した細胞をチューブ内の培地に再懸濁し、明確にラベル付けされた新しい6ウェルプレートに再播種します。
マウスに麻酔をかけた後、アルコールワイプで腫瘍を洗浄します。AMF治療の3時間前に磁性ナノ粒子を腫瘍に注入します。3時間後、マウスに再度麻酔をかけ、立ち直り反射に対する反応がないかどうかを確認します。
イヤータグまたはマウス上のその他の金属物を取り外し、潤滑された光ファイバー温度プローブを直腸にそっと置きます。カテーテルを腫瘍に留置します。針を外します。
次に、カテーテルが腫瘍から突き出すぎないようにカテーテルを切断します。3センサーの光ファイバー温度プローブをカテーテルに挿入し、センサーを保護します。直腸および腫瘍内プローブを動物の尾にテープで固定します。
マウスを50ミリリットルのチューブに入れ、頭の近くに麻酔を接続して送達できる穴があります。チューブをコイルセットアップ内に置き、麻酔を再接続します。光ファイバー温度プローブをチューブにゆるく配置して、環境の温度を測定します。
次に、チラーをオンにして、クーラントが循環していることを確認します。コンピュータソフトウェアがさまざまな温度を表示していることを確認し、記録を開始して、必要なCEM43線量が事前に決定されているはずの場所にCEM43計算をリアルタイムで表示できるようにします。低電力で磁石をオンにしますtage、光ファイバー温度プローブが温度変化を記録していることを確認します。
要するに、動物のコア温度は摂氏38度のままで、調整されたエアジャケットでそれを調節します。腫瘍内の温度レベルを制御する電力を変更することにより、磁場の強度を調整します。目的の用量が達成されたら、AMFを停止します。.
コイルからチューブを取り外し、マウスをチューブから取り外します。次に、チラーをシャットダウンします。プローブとカテーテルを取り出し、必要に応じて、新しい金属製の耳タグで動物にタグを付けます。
麻酔からの回復中にマウスを監視し、マウスが正常な行動を再開し、合併症がないことを確認します。in vivo低体温症の場合、リアルタイムの有効性と安全性評価のために、できるだけ多くの光ファイバー温度プローブを戦略的な場所に配置することが重要です。これらのプローブにより、実験全体を通して温度を記録することができ、正確な線量測定と熱履歴が可能になります。
ここでは、in vivo実験中に生成された曲線を示しており、温度を綿密に監視し、腫瘍の温度を所望の範囲内に維持するようにシステムを調整する能力を強調しています。ボルケーノプロットは、in vitroおよびin vivoの磁性ナノ粒子温熱療法後に発現差のある遺伝子を示しており、分子技術を使用して温熱療法の効果をモニターする方法を示しています。腫瘍温度、動物の深部体温、および熱線量の正確なモニタリングは、治療を一貫して実施するために必要です。
ハイパーサーミア後、治療の効果とメカニズムを理解するために、さまざまな分析を行うことができます。また、より大きな治療効果を得るために、他の治療法も実施することができます。
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概要
本プロトコルでは、高度な送達およびモニタリングシステムを用いて磁性ナノ粒子ハイパーサーミアを正確に実施するために必要な技術と手法を提示します。この手法は、前臨床モデルにおいて磁性ナノ粒子ハイパーサーミア治療を行うための、最も堅牢で再現性の高い方法を提供するため、極めて重要です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- バイオテクノロジー
- 温熱療法
背景
- ナノ粒子ハイパーサーミアの精密かつ一貫した導入。
- 局所環境および動物生理学の正確なモニタリングと制御。
- 再現性と安全性のための温度測定の重要性。
- 前臨床モデルへの応用。
研究目的
- 磁性ナノ粒子ハイパーサーミアを効率的に提供するための信頼性の高い手法を開発すること。
- 治療における安全性と再現性を確保すること。
- 加熱領域を標的組織に限定すること。
使用した手法
- 濃度 3 mg/mL の磁性ナノ粒子の調製。
- 細胞培養ウェル内へのナノ粒子の均一な分散。
- 培地とナノ粒子のストック溶液の使用。
- 処置中の熱線量のモニタリング。
主な結果
- 磁性ナノ粒子ハイパーサーミアの確実な導入。
- 標的組織に限定された一貫性のある加熱。
- 試験間における結果の再現性。
- 局所環境および動物生理学的状態の効果的なモニタリング。
結論
- このプロトコルは、ナノ粒子ハイパーサーミアのための堅牢な手法を提供します。
- 前臨床応用における安全性と有効性を確保します。
- 治療における温度測定の重要性を強調しています。
よくある質問
業界における重要性
磁性ナノ粒子ハイパーサーミア（mNPH）は、前臨床腫瘍学モデルにおける精密な熱投与を可能にし、制御された腫瘍焼灼および亜致死的な免疫調節効果を通じて、ターゲットのバリデーションを支援します。本システムのリアルタイムかつ多点での温度モニタリングとCEM43に基づく線量測定は、メカニズムのリスク低減と治療ウィンドウにおける予測信頼性に不可欠な、定量的で再現性のあるアウトプットを提供します。この機能により、in vitro での結果を in vivo での有効性へと橋渡しし、初期のディスカバリーパイプラインにおけるgo/no-go判断に有用な情報を提供します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 定義された熱量を投与することで腫瘍微小環境と免疫応答を調節し、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 光ファイバー温度計を用いて加熱を標的組織に限定し、オフターゲット効果を軽減し、アッセイの特異性を向上させる。
- 予測的価値： 温度-時間の勾配における生物学的影響を定量化し、標的優先順位付けのための用量反応モデリングを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 一貫したハイパーサーミア（温熱療法）反応を得るため、標準化されたナノ粒子取り込みを行う、検証済み生物学的システム（例：B16 F10メラノーマ細胞）を調製する。
- 運用的価値： ストック溶液と均一分散プロトコルを使用することで、ウェル間およびプレート間での再現性を確保する。
- アッセイ準備： ハイコンテンツスクリーニングおよびダウンストリーム解析と互換性のある、体積熱量データ（CEM43）を生成する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：同一のナノ粒子製剤とモニタリングを用いることで、in vitroの細胞培養からin vivoの腫瘍モデルへのシームレスな移行をサポートします。
- 疾患との関連性：マウスメラノーマモデルに適用可能であり、潜在的なバイオマーカーとしてのハイパーサーミア誘発性遺伝子発現変化（例：ボルケーノプロット）の評価を可能にします。
- リスク調整後の進展：リアルタイムでの熱量追跡により、併用療法研究の前に、安全性を制御した用量増量およびメカニズム的なリスク低減が可能になります。
パイプラインおよびワークフローの統合
mNPHを、ターゲット検証とリード最適化を繋ぐイネーブリングテクノロジーとして位置づけ、熱量投与の精度を表現型スクリーニングおよび作用機序研究に活用します。
- 探索生物学： 熱ストレスを遺伝子発現の差および免疫調節に関連付けることで、パスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： ナノ粒子処方やフィールドパラメータを比較するための、定量的で再現性のある熱出力（例：CEM43）を提供します。
- 分析： 比較条件分析のために、リアルタイムの温度曲線および処置後の分子プロファイル（例：ボルケーノプロット）を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 細胞から動物まで、ナノ粒子の投与量とモニタリングの一貫性を維持し、前臨床での継続性を支援します。
- エンタープライズでの再利用： システム設計により、ex vivo、in vitro、およびin vivoのセットアップ間の迅速な切り替えが可能であり、プロジェクト間でのプラットフォーム利用を最大化します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 正確な熱量を分子レベルの結果と相関させることで、メカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用的価値： 校正済みのソレノイドコイル、チラー、および光ファイバープローブを用いることで、施設間でのハイパーサーミア（温熱療法）提供を標準化します。
- 戦略的価値： 有効性と組織の安全性のバランスが取れた有効熱ウィンドウを定義することで、Go/No-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 再現性のある熱焼灼プロファイルに基づき、ナノセラピューティック候補のリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- in vivo手順のためのナノ粒子調製、熱量測定、および動物ハンドリングに関する専門知識が必要です。
- 10 kW発生装置、14回巻きソレノイドコイル、チラー、および多点光ファイバー温度モニタリングを含む特殊な装置が必要です。
- ナノ粒子濃度（3 mg ion/mL）、投与プロトコル、およびCEM43算出法のチーム間での標準化が求められます。
- 様々な腫瘍モデル、ナノ粒子構成、および電界パラメータ（165 kHz, 23.87 kA/m）への適応に関する検討が含まれます。
- オフターゲット加熱を防止し、動物の深部体温調節を確実にするための広範な温度測定の必要性などの実用的制限が含まれます。
