Name: ポリマードロップレット生成装置によるメチル化特異的多重ドロップレットPCR (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学ぶメチル化特異的多重ドロップレットPCR法による白血球分画計測。エピジェネティクスマーカーを用いて免疫蛍光染色と同等の精度で費用対効果の高い診断を実現し、血液学的疾患の早期バイオマーカーとして臨床応用が期待されます。

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著者らは、カナダ国立研究評議会からの財政的支援を認めている。

ヒトサンプルを含むこの研究で行われたすべての実験は、NRCの倫理委員会によって承認され、適用される研究ガイドラインに従い、カナダのケベック州の法律に準拠している人間の被験者を支配するNRCの方針に従って行われました。
1. 細胞の調製
<ol><li>凍結したヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、凍結した凍結した血液単核細胞(PBMC)を、水浴中に凍結槽を5分間37°Cで置いてすぐに解凍する。</li>
	<li>細胞を穏やかに再懸濁し、1 mLピペットを使用して細胞懸濁液を15 mL円錐形チューブに移すために、2回クライオビアルを反転させます。</li>
	<li><li></li><li><li><li></ol><ol><li></li><li><li></li><li></li><li><li><li><li><li><li><li><li><li></li><li></li></ol><ol><li> <ol><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li> </li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li><li><li><li></li><li><li><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li></ol></li><li> <ol><li></li><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li></li><li><li><li></li><li><li><li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li></li><li><li><li><li><li><li><li></li><li><li><li><li><li><li><li><li><li></li><li></li><li></li><li><li><li></li></ol><ol><li><ol><li><li><li><li></li><li><li><li></li><li></li><li><li><li></li><li></li><li><li></li></ol></li><li><ol><li><li><li></li><li><li></li><li><li></li><li></li><li><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61421/61421eq1v2.jpg"> </li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61421/61421equ02.jpg"> </li><li></li><li></li></ol></li></ol>

<ol><li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li>
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<li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed%2C+methylation-specific+digital+droplet+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li>
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<li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li>
</ol>

宣言する競合はありません。

提示された実験的なプロトコルおよび方法は作られたTPEの液滴発生器、熱サイクラーおよび蛍光顕微鏡を使用して社内mdPCRを可能にする。柔らかいTPEからTPEへの結合を使用して製造された装置は、最終的な装置が液滴発生器としてその後使用するために表面処理を必要としないように、すべてのチャネル壁にわたって均一である疎水性表面特性を与える。この材料は、高スループット製造,,9、10、11、12、1310,11との互換性を必要とするポイント・9オブ・ケア・プラットフォームで日常的に採用されています。1213また、光学的にも明瞭で、可視スペクトルにおける低蛍光の背景を示し、mdPCRを使用した完全なサンプル対回答ワークフローの将来の統合に魅力的な特徴です。PCR試薬のレシピは、ファシリティ多重化遺伝子の定量を可能にする自家製...

白血球(WbCs)組成物の分析は、血液学的診断において最も頻繁に要求される検査検査の一つです。▲微分白血球数は、感染症、炎症、貧血、白血病などの疾患のスペクトルの指標として機能し、他のいくつかの条件の初期予後バイオマーカーとして調査中である。WBCサブタイピングにおけるゴールドスタンダードは、高価で不安定な蛍光抗体を必要とする免疫染色および/またはフローサイトメトリーを含み、サンプル調製におけるオペレータの熟練度に大きく依存することが多い。さらに、この方法は、出荷または後の分析のためにサンプルを凍結することができないような新鮮な血液サンプルにのみ適用されます。
エピジェネティックマーカーは、表現型のバリエーションの研究のための強力な分析ツールとして最近登場しています。その後、ヒト白血球集団は、WBCサブセットの正確な特徴付けを可能にする細胞系DNAメチル化パターンを有することが示されている。エピジェネティックマーカーに基づくサブタイプは、新鮮な血液サンプル採取や高価な抗体に依存せず、疾患発症および感受性11、2、3、4、52,のバイオマーカーとして利用できる有望な代替手段を提供する。3,4,5
ゲノムワイド研究は、白血球サブタイプにおけるゲノム(CpG島)におけるメチル化された特定のCGリッチ領域の広範なマッピングに対して行われ、白血球サブタイプに特異的なエピジェネティックマーカー候補を同定する。PCRプロトコルは、メチル化遺伝子領域、例えばCD3ZおよびFOXP3、CD3+T細胞およびCD4+CD25+調節性T細胞(T-Regs)+にそれぞれ対応する理由から開発された。Wienckeらは、T細胞のエピジェネティックサブタイピングに対する二重液滴PCRの有用性を実証し、フロー活性化細胞選別(FACS)解析6と高い相関を持つ結果を生じる。この定量的遺伝子解析法は、鋳型核酸分子およびPCR試薬を、マイクロ流体によって可能,な油中水乳液を用いて、ゼロ、1つ以上の標的核酸コピーを含む数千個の離散、体積的に定義されたサブナノリットルサイズの液滴に分割することに依存している。PCR増幅は、個々の液滴内で行われ、各液滴のエンドポイント蛍光強度が測定され、サンプル中に存在する標的の絶対定量が可能となる。液滴PCRは、標準のqPCRよりも正確で正確で技術的に簡単なように確立されており、T細胞の臨床評価に適したDNAメチル化ベースの方法となっています。急速に出現するサブタイピング方法論であるものの、様々なメチル化CpG領域を同時に探査するエピジェネティック解析の多重化は欠けている。これは、定期的な白血球の差動度数に必要です。
本明細書において、熱可塑性エラストマー(TPE)液滴微小流体装置が提示され、メチル化特異的多重液滴PCR(mdPCR)に用いられた。この技術は、細胞系DNAメチル化パターン、すなわちCD3ZおよびFOXP3 CpG領域のエピジェネティック変異に基づいて、特定の白血球サブタイプ、CD3+T細胞およびCD4+CD25+T-Regsをそれぞれ説明するために使用されてきた。+ +DNA抽出、亜硫酸水素変換およびmdPCRのための詳細なプロトコルは、TPE液滴生成装置の製造方法と協調して説明される。この方法の代表的な結果は、提案されたアプローチの有用性を強調する免疫蛍光染色のものと比較される。

<table><tbody><tr><td>Bio-Rad, Mississauga, ON TFI0201</td><td></td><td>PCR tube</td><td></td></tr><tr><td>RAN Biotechnologies, Beverly, MA</td><td>008-FluoroSurfactant</td><td>Fluoro-Surfactant</td><td></td></tr><tr><td>Silicon Quest International, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxford Instruments, Abingdon, UK</td><td></td><td>EMCCD camera</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham,</td><td>MA5-16728</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>22-8425-71</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td></td><td>蛍光画像解析</td><td></td>に使用</tr><tr><td>ニコン, 日本</td><td></td><td>10倍対物レンズ</td><td></td></tr><tr><td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td><td>PCS-800-011</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ram&eacute;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)</td><td>p/n 200-U1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィッシャー、カナダ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitrocom、ニュージャージー州、米国</td><td>5015 および 5010</td><td>ホウケイ酸キャピラリーチューブ</td><td></td></tr><tr><td>(http://definetherain.org.uk/)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>浜松、日本</td><td>LC-L1V5</td><td>DEL UV 光源</td><td></td></tr><tr><td>ドロマイト</td><td>3200063</td><td>使い捨て流体チューブ</td><td></td></tr><tr><td>ドロマイト</td><td>3200302</td><td>使い捨て流体チューブ</td><td></td></tr><tr><td>IDT、コーラルビル、アイオワ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>州ニコン、メルビル、ニューヨーク</td><td></td>州直<td>立光学顕微鏡</td><td></td></tr><tr><td>Cytec Industries、ウッドランドパーク、ニュージャージー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>州 EV Group、Sch&auml;rding, Austria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>D5030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photron, San Diego, CA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDT, Coralville, IA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gersteltec, Pully, Switzerland</td><td></td><td>SU-8 photoresist</td><td></td></tr><tr><td>Fineline Imaging, Colorado Springs, CO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td></td><td></td><td></td>203603</tr><tr><td>Image J</td><td></td><td>液滴径</td><td></td>の評価に使用</tr><tr><td>Anachemia, Montreal, QC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excelitas, MA, USA</td><td></td><td>広域スペクトルLED蛍光灯</td><td></td></tr><tr><td>Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC</td><td>DE1010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hexpol TPE, & Aring;エムアリング;l, Sweden</td><td></td><td>熱可塑性エラストマー(TPE)</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>13-400-518</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon, Japan</td><td></td><td>画像取得</td><td></td>に使用</tr><tr><td>3M, St Paul, MN</td><td></td><td>Carrier Oil</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>R37605</td><td>青色蛍光生細胞染色(DAPI)</td><td></td></tr><tr><td>IDEXヘルス&科学、オークハーバー、WA</td><td>P-881 PEEK</td><td>フィッティング</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich、オークビル、オンタリオ州</td><td>806552</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダウコーニング、ミッドランド、ミシガン州</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThinkyUSA、CA、USA</td><td>ARV 310</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IHC world、メリーランド州、米国</td><td>IW-125-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zinsser NA、ノースリッジ、CA</td><td>2607808</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cetoni GmbH、コルビュッセン、ドイツ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich、オークビル、オンタリオ州</td><td>484431</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad、ミシサガ、オンタリオ州</td><td>1861096</td><td></td><td></td></tr><tr><td>日立ハイテクノロジーズ、ミシサガ、オンタリオ州</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニコン、メルビル、ニューヨーク</td><td></td><td>倒立顕微鏡</td><td></td></tr><tr><td>ニコン、日本</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロックタイト</td><td>AAの352</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ポリマードロップレット生成装置によるメチル化特異的多重ドロップレットpcr

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

多重液滴PCR(mdPCR)ワークフローとエピジェネティックベースの白血球(WBC)微分カウントを決定するための詳細なプロトコルが、熱可塑性エラストマー(TPE)マイクロ流体液滴生成装置と共に記載されている。エピジェネティックマーカーは、異なる疾患における重要な予後値であるWBCサブタイピングに使用されます。これは、ゲノム中の特定のCGリッチ領域(CpG loci)のDNAメチル化パターンの定量化を通じて達成される。本論文では、末梢血単核細胞(PBMCs)の亜硫酸水素塩処理DNAを、WBC亜集団と相関するCpG遺伝子座に特異的なプライマーおよび加水分解蛍光プローブを含むmdPCR試薬を用いて液滴に封入する。マルチプレックスアプローチは、別々のmdPCR反応を必要とせずに多くのCpG遺伝子座の尋問を可能にし、メチル化部位のエピジェネティック解析を用いたWBC亜集団のより正確なパラメトリック決定を可能にする。この精密な定量はさまざまな適用に拡張することができ、臨床診断とその後の予後のための利点を強調する。

TPEベースのマイクロ流体液滴発生装置は、図1に示すように記載されたプロトコルを用いて製造した。透明マスクをフォトリソグラフィに使用し、シリコン(Si)マスターを得る。柔らかいリソグラフィは、次いでエポキシ型を製造するために使用されたSiマスターの逆PDMSレプリカを得るために行った。エポキシ前駆体をPDMS上に注ぎ、架橋して硬化させた。この金型は、Siマスターの正確なレプリカを表す、熱エンボスを使用して熱可塑性のその後の熱成形のためにより弾力性があった。エポキシモールドが得られると、熱可塑性エラストマーをエンボス加工した。エンボス加工の後、TPEは解体され、デバイスは切断されました。平らなTPEの基質は装置を密封するために使用された。上部カバーに穴を開け、2つの基板を接着した。最後に、世界とチップの接続に必要なチューブが挿入され、デバイスが使用できる状態になりました。製造されたマスター金型、TPE材料およびエンボス加工装置のサンプル画像を図2に示します。チューブインターコネクトを備えた組み立てられた装置は、一対の独立...

エピジェネティックマーカーは、DNAメチル化パターンの定量化を通じて白血球(WBC)のサブタイピングに使用されます。このプロトコルは、熱可塑性エラストマー(TPE)ベースのマイクロ流体デバイスを使用した多重液滴ポリメラーゼ連鎖反応(mdPCR)法を提示し、WBC差動度数の正確かつ多重化メチル化特異的ターゲット定量を可能にする液滴生成を行う。

ポリマードロップレット生成装置によるメチル化特異的多重ドロップレットPCR

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

このプロトコルは、エピジェネティックメチル化マーカーに基づいて正確な微分白血球計数を可能にする柔軟な多重液滴PCRワークフローを提示する。この柔軟性は、臨床使用に向けてmdPCRの翻訳を容易にする可能性があります。この方法は、免疫蛍光染色法を用いて得られたものに密接に問い合わせた結果を提供する。しかし、免疫蛍光染色とは異なり、この方法は新鮮な血液サンプルや高価な抗体を必要としません。血液学的診断では、感染、炎症、貧血および白血病を含む疾患のスペクトルの指標として、そして早期予後癌バイオマーカーとして考えられている。アブデルラフマンザワウィとの手順を実証することは、NRCの医療機器研究センターのチームの技術責任者クリスティーナ・ナシフです。まず、20マイクロリットルのプロテインキナーゼKと、100マイクロリットルのPBSで解凍したばかりのヒト末梢血単核細胞を含む磁気ビーズを含む400マイクロリットルのライシス結合バッファーを十分に混合することから始めます。室温で5分間のインキュベーションの後、上清を取り除く前に、チューブを磁気ラックに1〜2分間置きます。マグネットからチューブを取り出した状態で、DNAビーズ複合体を600マイクロリットルの洗浄バッファー1に再び懸濁させて、非特異的に結合したビーズを除去する。ちょうど実証したように、表面化液2の600マイクロリットルで細胞を洗浄する前に、上清の除去を可能にするために、チューブを磁石の上に戻します。上清を取り除いた後、チューブをマグネットで1分間空気乾燥させてから、溶出バッファーの100マイクロリットルを完全に混合してチューブに加えます。次に、チューブを磁気ラックに1〜2分間置き、磁気ビーズをほのめかされたDNAから分離し、精製されたDNA溶液を新しいチューブに移します。精製DNAのバイサルファイト変換の場合、20マイクロリットルのDNAサンプルをPCRチューブに移し、130マイクロリットルの変換試薬をチューブに加える。完全に混合した後、チューブの内容物を短時間回転させ、サーマルサイクラー上のDNAを増幅します。サイクルの終了時に、600マイクロリットルの結合バッファーを、コレクションチューブに入れたイオンクロマトグラフィーカラムに加え、DNAをカラムに加えます。チューブを数回反転して混ぜ、遠心分離機を全速速で30秒間反転させます。収集した流れを捨て、100マイクロリットルの洗浄バッファーをカラムに加えます。列を遠心分離し、示されているようにフロースルーを再度破棄します。200マイクロリットルの脱スル化バッファーをカラムに加え、室温で15~20分間インキュベーションしてから、サンプルを遠心し、示したようにフロースルーを廃棄します。次に、1回の洗浄バッファーを200マイクロリットルでカラムを2回洗浄します。2回目の洗浄後、カラムを新しい1.5ミリリットルの回収チューブに移し、100マイクロリットルのPCR等水をカラムの膜に加えます。その後、カラムの遠心分離によりDNAを全速力で1分間溶出させる。液滴生成のために、バイサルファイト変換DNAの1マイクロリットルをPCRチューブで調製した新しいプローブマスターミックスと混合し、簡単な遠心分離でサンプルを収集します。ピークフィッティングを使用して、使い捨て可能な流体チューブを2つの250マイクロリットルの体積精密ガラス注射器に接続します。また、1つの精密ガラスシリンジに、5%のフロウロ界面活性剤を含む250マイクロリットルのキャリアオイルと、50マイクロリットルのキャリアオイルを含む1つの精密ガラスシリンジを事前に充填してください。両方のシリンジがロードされたら、100マイクロリットルのPCRをキャリアオイルの注射器に混ぜて、高速カメラを搭載した直立光顕微鏡のステージに液滴マイクロ流体装置を配置します。リアルタイムでの液滴形成の観察と記録のために、事前充填された注射器をプログラム可能なシリンジポンプに置き、継手付きのピークユニオンを使用して、注射器のチューブを液滴マイクロ流体装置のそれぞれの入口チャネルのチューブに接続します。滴水発生器の出口から0.5ミリリットルのPCRチューブの内側にチューブを置き、1分間に2マイクロリットルにシリンジポンプの流量を調整し、得られたエマルジョンを収集する前に液滴サイズが安定するようにします。チューブの上部からエマルジョンをゆっくりと慎重に回収し、75マイクロリットルの溶液を200マイクロリットルのPCRチューブに移してサーマルサイクリングを行います。次に、PCRチューブ中の油分が分散相の体積と密接に一致していることを確認し、サーマルサイクリング中の液滴の合体を防止し、200マイクロリットルチューブをサーマルサイクラーに入れる。乳化試料の蛍光イメージングの場合、PCRエマルジョンを矩形プロファイルを有する深いホウケイ酸キャピラリーチューブに50マイクロメートルの深いホウケイ酸毛管に移し、液滴を近いパックされた単層に配置してイメージングを行う。毛細血管を顕微鏡スライドに固定して密封した後、反転した顕微鏡のステージにスライドをロードします。そして顕微鏡のイメージ作成ソフトウェアで、リアルタイムのカメラ獲得を開始するために、取得し、高速に生きて選択します。次いで、明視野と蛍光顕微鏡下で試料を観察する。液滴の発生と熱循環の後、液滴は1ミリメートル幅と50マイクロメートルの高さのガラスキャピラリーに導入することができます。蛍光画像取得に最適な液滴の単層分布を得るために、その後、各波長の画像を記録することができます。画像解析の後、それぞれのフルオロフォア内のすべての液滴の蛍光強度をプロットして、正および負の液滴の閾値を確立することができる。同定とカウント後、液滴当たりのコピー値を計算し、CD3+T細胞の割合、およびCD4+25+調節T細胞を、全細胞またはC-less遺伝子の1滴当たりのコピーに関して、それぞれメチル化CD3ZおよびFOXP3コピーに基づいて決定することができる。パーセント値は、次に、適切な抗体を用いて免疫蛍光イメージングを介して得られたものと比較することができる。熱サイクルと最終液滴イメージングステップを通じた液滴生成からのエマルジョン安定性は、正確で信頼性が高く再現可能な定量結果を得るためには非常に重要だと思います。カスタマイズされたPCRミックス製剤によるMD PCRカスタマイズは、がん研究、感染症診断、単一細胞レベルでの分析など、数多くのアプリケーションに使用できます。

methylation-specific-multiplex-droplet-pcr-using-polymer-droplet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

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デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応を用いた単一細胞ミトコンドリアDNAコピー数とヘテロプラスミーの測定(英語)

学ぶメチル化特異的多重ドロップレットPCR法による白血球分画計測。エピジェネティクスマーカーを用いて免疫蛍光染色と同等の精度で費用対効果の高い診断を実現し、血液学的疾患の早期バイオマーカーとして臨床応用が期待されます。

ポリマードロップレット生成装置によるメチル化特異的多重ドロップレットPCR

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