ポリマードロップレット生成装置によるメチル化特異的多重ドロップレットPCR
2020年6月29日
エピジェネティックマーカーは、DNAメチル化パターンの定量化を通じて白血球(WBC)のサブタイピングに使用されます。このプロトコルは、熱可塑性エラストマー(TPE)ベースのマイクロ流体デバイスを使用した多重液滴ポリメラーゼ連鎖反応(mdPCR)法を提示し、WBC差動度数の正確かつ多重化メチル化特異的ターゲット定量を可能にする液滴生成を行う。
このプロトコルは、エピジェネティックメチル化マーカーに基づいて正確な微分白血球計数を可能にする柔軟な多重液滴PCRワークフローを提示する。この柔軟性は、臨床使用に向けてmdPCRの翻訳を容易にする可能性があります。この方法は、免疫蛍光染色法を用いて得られたものに密接に問い合わせた結果を提供する。
しかし、免疫蛍光染色とは異なり、この方法は新鮮な血液サンプルや高価な抗体を必要としません。血液学的診断では、感染、炎症、貧血および白血病を含む疾患のスペクトルの指標として、そして早期予後癌バイオマーカーとして考えられている。アブデルラフマンザワウィとの手順を実証することは、NRCの医療機器研究センターのチームの技術責任者クリスティーナ・ナシフです。
まず、20マイクロリットルのプロテインキナーゼKと、100マイクロリットルのPBSで解凍したばかりのヒト末梢血単核細胞を含む磁気ビーズを含む400マイクロリットルのライシス結合バッファーを十分に混合することから始めます。室温で5分間のインキュベーションの後、上清を取り除く前に、チューブを磁気ラックに1〜2分間置きます。マグネットからチューブを取り出した状態で、DNAビーズ複合体を600マイクロリットルの洗浄バッファー1に再び懸濁させて、非特異的に結合したビーズを除去する。
ちょうど実証したように、表面化液2の600マイクロリットルで細胞を洗浄する前に、上清の除去を可能にするために、チューブを磁石の上に戻します。上清を取り除いた後、チューブをマグネットで1分間空気乾燥させてから、溶出バッファーの100マイクロリットルを完全に混合してチューブに加えます。次に、チューブを磁気ラックに1〜2分間置き、磁気ビーズをほのめかされたDNAから分離し、精製されたDNA溶液を新しいチューブに移します。
精製DNAのバイサルファイト変換の場合、20マイクロリットルのDNAサンプルをPCRチューブに移し、130マイクロリットルの変換試薬をチューブに加える。完全に混合した後、チューブの内容物を短時間回転させ、サーマルサイクラー上のDNAを増幅します。サイクルの終了時に、600マイクロリットルの結合バッファーを、コレクションチューブに入れたイオンクロマトグラフィーカラムに加え、DNAをカラムに加えます。
チューブを数回反転して混ぜ、遠心分離機を全速速で30秒間反転させます。収集した流れを捨て、100マイクロリットルの洗浄バッファーをカラムに加えます。列を遠心分離し、示されているようにフロースルーを再度破棄します。
200マイクロリットルの脱スル化バッファーをカラムに加え、室温で15~20分間インキュベーションしてから、サンプルを遠心し、示したようにフロースルーを廃棄します。次に、1回の洗浄バッファーを200マイクロリットルでカラムを2回洗浄します。2回目の洗浄後、カラムを新しい1.5ミリリットルの回収チューブに移し、100マイクロリットルのPCR等水をカラムの膜に加えます。
その後、カラムの遠心分離によりDNAを全速力で1分間溶出させる。液滴生成のために、バイサルファイト変換DNAの1マイクロリットルをPCRチューブで調製した新しいプローブマスターミックスと混合し、簡単な遠心分離でサンプルを収集します。ピークフィッティングを使用して、使い捨て可能な流体チューブを2つの250マイクロリットルの体積精密ガラス注射器に接続します。
また、1つの精密ガラスシリンジに、5%のフロウロ界面活性剤を含む250マイクロリットルのキャリアオイルと、50マイクロリットルのキャリアオイルを含む1つの精密ガラスシリンジを事前に充填してください。両方のシリンジがロードされたら、100マイクロリットルのPCRをキャリアオイルの注射器に混ぜて、高速カメラを搭載した直立光顕微鏡のステージに液滴マイクロ流体装置を配置します。リアルタイムでの液滴形成の観察と記録のために、事前充填された注射器をプログラム可能なシリンジポンプに置き、継手付きのピークユニオンを使用して、注射器のチューブを液滴マイクロ流体装置のそれぞれの入口チャネルのチューブに接続します。
滴水発生器の出口から0.5ミリリットルのPCRチューブの内側にチューブを置き、1分間に2マイクロリットルにシリンジポンプの流量を調整し、得られたエマルジョンを収集する前に液滴サイズが安定するようにします。チューブの上部からエマルジョンをゆっくりと慎重に回収し、75マイクロリットルの溶液を200マイクロリットルのPCRチューブに移してサーマルサイクリングを行います。次に、PCRチューブ中の油分が分散相の体積と密接に一致していることを確認し、サーマルサイクリング中の液滴の合体を防止し、200マイクロリットルチューブをサーマルサイクラーに入れる。
乳化試料の蛍光イメージングの場合、PCRエマルジョンを矩形プロファイルを有する深いホウケイ酸キャピラリーチューブに50マイクロメートルの深いホウケイ酸毛管に移し、液滴を近いパックされた単層に配置してイメージングを行う。毛細血管を顕微鏡スライドに固定して密封した後、反転した顕微鏡のステージにスライドをロードします。そして顕微鏡のイメージ作成ソフトウェアで、リアルタイムのカメラ獲得を開始するために、取得し、高速に生きて選択します。
次いで、明視野と蛍光顕微鏡下で試料を観察する。液滴の発生と熱循環の後、液滴は1ミリメートル幅と50マイクロメートルの高さのガラスキャピラリーに導入することができます。蛍光画像取得に最適な液滴の単層分布を得るために、その後、各波長の画像を記録することができます。
画像解析の後、それぞれのフルオロフォア内のすべての液滴の蛍光強度をプロットして、正および負の液滴の閾値を確立することができる。同定とカウント後、液滴当たりのコピー値を計算し、CD3+T細胞の割合、およびCD4+25+調節T細胞を、全細胞またはC-less遺伝子の1滴当たりのコピーに関して、それぞれメチル化CD3ZおよびFOXP3コピーに基づいて決定することができる。パーセント値は、次に、適切な抗体を用いて免疫蛍光イメージングを介して得られたものと比較することができる。
熱サイクルと最終液滴イメージングステップを通じた液滴生成からのエマルジョン安定性は、正確で信頼性が高く再現可能な定量結果を得るためには非常に重要だと思います。カスタマイズされたPCRミックス製剤によるMD PCRカスタマイズは、がん研究、感染症診断、単一細胞レベルでの分析など、数多くのアプリケーションに使用できます。
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概要
このプロトコルは、エピジェネティックなメチル化マーカーに基づく白血球の正確な差別的数え方を可能にする柔軟なマルチプレックス液滴PCRワークフローを提示します。この方法は、免疫蛍光染色法で得られた結果と密接に相関する結果を提供します。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 血液学
- エピジェネティクス
背景
- エピジェネティックマーカーは白血球のサブタイプ分類に重要です。
- 差別白血球数は様々な疾患の指標です。
- この方法は新鮮な血液サンプルや高価な抗体を必要としません。
- 初期の予後がんバイオマーカーとして検討されています。
研究の目的
- 正確な差別白血球数の方法を開発すること。
- mdPCRの臨床使用への翻訳を促進すること。
- 免疫蛍光染色の費用対効果の高い代替案を提供すること。
使用した方法
- マルチプレックス液滴ポリメラーゼ連鎖反応（mdPCR）。
- 熱可塑性エラストマー（TPE）ベースのマイクロ流体デバイスの使用。
- DNAメチル化パターンの定量。
- NRCの医療機器研究センターの技術担当者による実演。
主な結果
- mdPCR法は正確でマルチプレックスなメチル化特異的ターゲット定量を可能にします。
- 結果は従来の方法で得られたものと密接に一致します。
- この方法は臨床応用に適応可能です。
- 様々な血液学的状態の信頼できる診断ツールとして機能します。
結論
- mdPCR法は差別白血球数のための有望なツールです。
- 従来の免疫蛍光染色に比べて利点があります。
- このアプローチは血液学における診断能力を向上させる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This multiplex droplet PCR workflow enables precise epigenetic-based white blood cell differential counting, offering a cost-effective alternative to immunofluorescent staining for hematological diagnostics. By quantifying DNA methylation patterns at CpG loci, the method supports prognostic biomarker discovery in diseases such as infection, inflammation, anemia, and leukemia. Its compatibility with archival samples and elimination of antibody dependence enhances translational potential for clinical laboratory implementation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epigenetic markers to validate WBC sub-population hypotheses in disease models.
- Operational Value: Provides quantitative, methylation-specific readouts that de-risk target engagement assessments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, multiplexed epigenetic data for assay reproducibility across compound screening campaigns.
- Operational Value: Facilitates high-throughput droplet generation with consistent sizing for reliable fluorescence-based detection.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports biomarker-aligned WBC subtyping for translational continuity from discovery to preclinical validation.
- Operational Value: Enables parametric determination of immune cell populations using epigenetic signatures, reducing reliance on cell-surface markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing epigenetic quantification that informs target validation and lead identification decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immune cell involvement through methylation pattern analysis of specific CpG loci.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative droplet PCR outputs enabling comparison of epigenetic responses across experimental conditions.
- Analytics: Generates copies-per-droplet measurements and threshold-based positive/negative droplet classification for precise cell population quantification.
- Translational Research: Aligns with prognostic biomarker development by correlating epigenetic WBC counts with clinical outcomes in hematological conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for multiplex epigenetic analysis applicable across immunology, oncology, and infectious disease research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in immune cell subset quantification through epigenetic specificity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via thermoplastic elastomer microfluidic device and standardized droplet generation.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by enabling early, antibody-free immune monitoring in preclinical models.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions through objective, quantification-based immune profiling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bisulfite conversion, droplet PCR, and fluorescence imaging analysis.
- Dependent on precision glass syringes, programmable syringe pumps, and thermoplastic elastomer microfluidic devices.
- Necessitates standardization of probe master mix formulation and thermal cycling parameters across sites.
- Adaptation considerations include varying CpG target panels for different WBC sub-populations and disease contexts.
- Practical limitations include emulsion stability maintenance during thermal cycling and imaging steps to prevent coalescence.
