Name: 熱帯熱マラリア原虫 人工膜供給による食作用細胞培養と蚊感染 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶマラリア原虫Plasmodium falciparumの感染性ガメトサイト培養法と蚊への膜給餌法。このプロトコルは伝播阻害研究と原虫ライフサイクル解析に応用可能です。

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著者は、ジョンズ・ホプキンスマラリア研究所(JHMRI)への財政的支援のためにブルームバーグ・フィランソロピーに感謝します。この作業は、JHMRIの昆虫や寄生虫のコア施設が提供する専門知識がなければ不可能でした。

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<li>Swearingen, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+Plasmodium+Sporozoite+Surface%3A+Identification+of+Surface-Exposed+Proteins+and+Demonstration+of+Glycosylation+on+CSP+and+TRAP+by+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics.</a> PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606(2016).</li>
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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

ここで説明する方法は、10年以上のジョンズ・ホプキンスマラリア研究所で15年以上、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22年以上にわたって使用されています。このプロトコルを用いて産生されるガテサイトは、高スループットのゲームトサイトサイクスアッセイ22、プロテオミクス15、ならびに転写23研究に使用されている。しかし、これらの方法を開発する主な理由...

マラリアは マラリア原 虫寄生虫によって引き起こされ、雌 のアノフェレス 蚊の感染性咬傷を介して脊椎動物の宿主に伝染する。2019年の世界保健機関(WHO)の報告書によると、マラリアの合計2億2,800万例から推定405,000人の死亡がありました。マラリア関連死のほとんどはアフリカ地域、特に5歳未満の小児に集中していた。マラリアの全体的な発生率は2010年から世界的に低下していますが、近年は減少が高まっており、この病気を排除するために追加の制御戦略が緊急に必要とされています。
マラリア原虫の周期性無性血液段階は病因を引き起こし、これらの小さなサブセットは女性と男性の解血細胞に分化する。熱帯熱マラリア原虫のテジカルは、5つの形態学的に異なる段階を経て開発するのに7〜10日かかるため、本質的にユニークです。第1段階からIV期までの未熟な食細胞は骨髄小板に隔離され、末梢循環2、3、4、5にはほとんど欠けている。成熟期Vのゲームサイトに感染した赤血球は、血流中に放出され、蚊によって取り込まれるように自由に循環する。蚊の中に入ると、タレトサイトは、温度の変化と中腸環境への暴露を通じて活性化され、メスとオスの配偶体に変身し、蚊の唾液腺6、7のスポロゾアテの感染段階で最高潮に達する蚊の段階の開発を開始する。
TragerとJenson8はP.熱帯熱化を培養するための標準化された方法を説明したので、無性血液段階に関する研究は大幅に進歩している。しかし、性的段階のための信頼性の高い文化システムの欠如は、P.熱帯熱マラリア類、伝染生物学および蚊の段階を研究することを困難にしている。近年、数種類の方法が発表され、その中で、9、10、11、12の培養を確立する研究所が発表されている。本稿は、マラリア研究コミュニティにとって貴重な資源を表すことができるP.熱帯熱マラリア原虫を培養するための標準化された信頼性の高いプロトコルを記述する。この方法は、標準化された蚊の供給プロトコルと共に、信頼性の高い蚊の感染性をもたらす成熟した、感染性のタメサイトの堅牢な生産を可能にする。これらの方法は、ゲームトサイト、および蚊の段階寄生虫の途切れない供給を維持するために確立された。本稿では、完全な食塩基細胞培養プロトコル(図1)、ガラス膜フィーダーの調製、これらの膜フィーダーを用いた蚊の感染(図2)、蚊の中腸(図3)の解剖および唾液腺の解剖(図4)、中腸および唾液腺切断後の蚊の感染の定量について述べる。

<table><tbody><tr><td>10% 砂糖溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10ml 血清ピペット</td><td>ファルコン</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15ml コニカルチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>1ml 血清ピペット</td><td>ファルコン</td><td>357521</td><td></td></tr><tr><td>25ml 血清ピペット</td><td>ファルコン</td><td>357535</td><td></td></tr><tr><td>37&deg;Cインキュベーター50ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>5ml血清ピペット</td><td>ファルコン</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル組織培養プレート</td><td>ファルコン</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9インチガラスピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>ハマダラカ蚊</td><td>JHMRI、昆虫コア</td><td></td><td>A.ステファンシまたはA.ガンビアエ(キール)</td></tr><tr><td>セルカウンター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>循環水浴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細先端鉗子</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-000-122</td><td></td></tr>ガ<tr><td>イムサステイン</td><td>シグマ</td><td>GS1L</td><td></td></tr><tr><td>ガラス乾燥器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス膜フィーダー</td><td>ケムグラスライフサイエンス</td><td>CG183570</td><td></td></tr><tr><td>ガラススライドフィ</td><td>ッシャーブランド</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>シグマ</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血液O +</td> <td>JHU</td><td></td>は<td>RPMIでRBCを3回洗浄し、50%で冷蔵します ヘアマトクリットヒト</td></tr>血清<tr><td>O +</td><td>州間血液銀行</td><td></td><td>プール-異なるドナーからの血清の少なくとも6単位と-20&でアリコートを凍結します度;C.</td></tr><tr><td>ヒポキサンチン</td><td>シグマ</td><td>H9337</td><td>1M NaOHで500倍のストックを作る</td></tr> メル<tr><td>クロクロム</td><td>シグマ</td><td>M7011</td><td>必要に応じて0.1%に希釈できるPBSで1%のストック溶液を準備し</td></tr>ます <tr><td>マイクロピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td></td><td>10倍、40倍、100倍の対物レンズを備えた顕微鏡はどれでも機能します。</td></tr><tr><td>蚊のカップ</td><td>ネプチューンカップ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルグルコサミン</td><td>Sigma</td><td>A3286</td><td>オプションであり、純粋な配偶子細胞が必要な場合にのみ必要です。</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>ネット <td>蚊が入り、血液が供給できることを確認してください</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シャー</td>レ <td>サーモサイエンティフィック</td><td>249964</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>熱帯熱マラリア原虫 NF54</td><td>BEI Resources</td><td>MRA-1000</td><td>早期継代培養を大量に凍結して、一定の供給を確保します</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>コーニング</td><td>CV-041-CV</td><td>培地にはグルタミンとHEPESが含まれています</td></tr><tr><td>スライドウォーマー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S6297</td><td>培地はオプションで、培養インキュベーションウォーターバス中にマラリアガスミックスを使用する場合にのみ追加</td></tr>します<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>キサンチュレン酸</td><td>シグマ</td><td>D120804</td><td>鞭毛培地用</td></tr></tbody></table>

熱帯熱マラリア原虫 人工膜供給による食作用細胞培養と蚊感染

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

マラリアは依然として最も重要な公衆衛生上の問題の1つであり、重大な罹患率と死亡率を引き起こしている。マラリアは、雌の アノフェレス 蚊からの感染性咬傷を介して伝染する蚊媒介性疾患である。マラリア対策は、最終的には蚊との間の感染を遮断する方法を含む多数のアプローチに依存します。マラリア原虫の蚊の段階を実験室で研究するために、ヒト宿主から蚊ベクターへの感染に必要な寄生虫ステージである感染性の高い熱帯 熱マラリア 原虫の宿虫細胞を培養するプロトコルを最適化しました。 P. 熱帯熱透析 細胞は、5つの形態学的に異なるステップを経て成熟し、およそ1〜2週間かかる。このプロトコルに記載されているガテサイト培養は15日で完了し、15〜18日目から蚊に感染する。これらのプロトコルは、感染有能なタテライトの連続的なサイクルを維持し、寄生虫の蚊の段階の途切れない供給を維持するために開発されました。ここでは、食細胞培養の方法論と、ガラス膜フィーダーを用いてこれらの寄生虫に感染する方法について述べる。

ここでは、上記のプロトコルを使用して生成された P.ファルシカルNF54 食塩細胞培養物を用いた一連の膜供給の結果を提示します(図5参照)。テマトサイト培養は0日目に約0.5%の混合無性培養で開始され、4日目と5日目までに約15%のピーク寄生虫症に成長しました。この高寄生症で 図5A に示すように、寄生虫はストレスを受け、無性期の培養がクラッシュする。しかし、このストレスは、ゲーム細胞産生の誘導をもたらすと同時に起きます。初期の食細胞は6日目と7日目の後に現れ、無性寄生虫症はゆっくりと低下したが、低いレベルにとどまった。無性期寄生虫の存在は蚊の摂食実験に影響を与えなかった。しかし、薬物感受性アッセイやプロテオミクスや転写学などの純粋な培養を必要とする実験でゲームサイトを使用する場合、残留無性ステージは50mM N-アセチルグルコサミンによる治療によって除去することができる。ゲームトサイトの大半は、15日目までにVをステージングするために成熟し、その時点で蚊に感染し、餌を与える準備ができていました。ギム...

マラリア原虫の蚊の段階に関する詳細な調査は、効果的な伝染遮断戦略を設計するために重要です。このプロトコルは、感染性のタテキを効果的に培養し、これらのタテライトを蚊に供給して P.熱帯熱砂の蚊の段階を生成する方法を示しています。

Malaria remains one of the most important public health problems, causing significant morbidity and mortality. Malaria is a mosquito borne disease ...

配偶子細胞はマラリア原虫の伝染に関与しています。研究室で感染性配偶子細胞を作製することは、蚊の段階での感染生物学を研究し、後期の結果を得るためにスポロゾイトを生成するための鍵となります。これらの方法は、どの検査室でも簡単に採用でき、視覚的なデモンストレーションは、これらの手順を世界中のマラリアコミュニティと共有するのに役立ちます。私と一緒に手順を実演するのは、ジョンズ・ホプキンス大学マラリア研究所の同僚であるシニアリサーチアソシエイトのGodfree MlamboとポスドクフェローのSachie Kanataniです。配偶子細胞培養をセットアップするには、遠心分離機で5ミリリットルのフィーダー培養物をスピンダウンし、ペレットを30ミリリットルの完全培地に再懸濁します。1.2ミリリットルの詰められた赤血球をチューブの内容物と混合し、得られた懸濁液の5ミリリットルを6ウェル培養プレートの各ウェルに加えます。次に、プレートを摂氏37度のキャンドルジャーに入れます。次の15〜18日間、毎日、各ウェルから培養上清の70〜80%を慎重に吸引し、血清学的ピペットを使用して、各ウェルの壁に血球のない5ミリリットルの新鮮な培地を追加し、沈殿した赤血球層を乱さずに培養物に供給します。成熟配偶子血症を定量化するには、15 日目から 18 日目に血液塗抹標本を作成し、少なくとも 1000 個の赤血球で成熟した配偶子細胞の数を数え、成熟した配偶子細胞に感染した赤血球の割合を計算できるようにします。鞭毛イベントを定量化するには、予め加温したチューブ内で配偶子細胞培養物200マイクロリットルを遠心分離し、ペレットを20マイクロリットルの鞭毛培地に再懸濁します。配偶子細胞懸濁液をカバースリップ付きのスライドガラスに移し、スライドを室温で15分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、10倍対物レンズを使用して、少なくとも4つのフィールドで位相コントラストモードで鞭毛形成中心をカウントし、鞭毛発生事象を計算できるようにします。標準的な膜栄養アッセイを使用して蚊に感染するには、生後3〜7日の雌のハマダラカの蚊かごから砂糖水を6.5〜18時間取り出し、吸引器を使用して最大100匹の蚊を2層の細かいメッシュ生地で覆われた個々の紙コップに移します。洗浄した血液を遠心分離で採取し、等量の解凍したばかりのヒト血清で血液を再構成します。摂氏37度の水浴で30分間温めた再構成血液を温め、配偶子細胞培養物をあらかじめ温めた15ミリリットルのプラスチックチューブに移して遠心分離し、ペレットの薄い血液塗抹標本を作成して、実証されているように成熟配偶子細胞を決定します。最終的な血液供給を行うには、再構成した全血を使用して配偶子細胞ペレットを適切な実験濃度に希釈し、蚊とガラスフィーダーの準備ができるまで血

plasmodium-falciparum-gametocyte-culture-mosquito-infection-through

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

遺伝子は、デング熱ウイルスのための潜在的に耐火として識別されると、それは蚊の中でウイルス感染の予防にその役割を評価する必要があります。このプロトコルは、蚊のデング熱感染症の程度をアッセイする方法を示します。文化、膜の給餌蚊、ヒト血液中にウイルスが育ち、そして蚊の中腸におけるウイルス力価を測定するための技術が実証されています。...

デング熱蚊の感染症（A.ネッタイシマカ）と感染症の表現型決定のためのプロトコル

遺伝子がマラリアのための潜在的に耐火として識別されると、それは蚊の中マラリア原虫の感染症の予防にその役割を評価する必要があります。このプロトコルは、蚊のマラリア原虫の感染の程度をアッセイする方法を示します。生殖母体の文化、膜の給餌蚊ヒト血液、及び蚊の中腸におけるウイルス力価を測定することを準備するための技術が実証されています。...

蚊と感染症の表現型決定における熱帯熱マラリア原虫の感染症のためのプロトコル

このビデオでは、脳マラリアの実験的なマウスモデルの生成を示しています。Plasmodium bergheiに感染した雌の蚊から分離されたスポロゾイトは、拘束されたマウスの尾静脈に注入され、血液脳関門の破壊と脳の炎症を引き起こし、脳マラリアを引き起こします。この感染マウスモデルは、脳マラリアに関連するin...

宿主蚊由来スポロゾイトを用いた実験的脳マラリアのマウスモデル作製

結核、マラリア、人間と熱帯の貧しい集団における罹患率および死亡率の主要な原因の中で最も流行している感染症の2つです。我々は、感染の彼らの自然な経路を経て、両方の病原体攻撃後のマウスにおけるマラリア結核の重複感染の結果を研究するための実験的なモデルシステムを確立した。...

自然送信時に結核マラリア重複感染を研究する実験モデル結核菌とマラリアベルゲイ</i

私たちは、実験的な脳マラリアのマウスモデルを記述し、磁気共鳴画像法を用いて生体内で炎症性および微小血管の病理をどのように追跡できるかを示します。...

磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡

ヒトマラリア寄生虫に対するげっ歯類マラリア寄生虫のライフサイクルと生物学の顕著な類似性により、げっ歯類マラリアモデルはマラリア研究に欠かせないものとなっています。ここでは、野生型およびトランスジェニックげっ歯類マラリア種の表現型分析に用いられる最も重要な技術のいくつかを標準化した。...

げっ歯類マラリア寄生虫の現象分析無性および性的血液段階と蚊の段階

標準的な膜供給アッセイ(SMFA)は、潜在的な抗マラリア化合物の評価と同定のためのゴールドスタンダードと見なされています。この人工給餌システムは、熱帯 熱...

ハマダラカ媒介動物における熱帯熱マラリア原虫感染の検出のための標準的な膜摂食アッセイ

ここでは、感染の血液期における マラリア原虫 に対する細胞性免疫のメカニズムを解明するのに役立つ新しい方法について説明します。これは、細胞傷害性リンパ球による感染した赤血球の死滅を測定する in vitro...

インビトロ 細胞傷害性リンパ球による マラリア原虫感染赤血球殺傷のアッセイ

マラリアは、感染した蚊による マラリア原虫 のスポロゾイト段階の接種によって伝染します。トランスジェニックマラリア原虫は、マラリアの生物学をよりよく理解することを可能にし、 マラリア ワクチン開発の取り組みに直接貢献しています。ここでは、トランスジェニック マラリア原虫...

遺伝子組換え マラリア原虫ベルヘイ ・スポロゾイトの生成

化学遺伝学では、標的遺伝子座においてゲートキーパー残基を異なる側鎖を含むアミノ酸に置き換えることが含まれます。ここでは、 cdpk1...

植物様キナーゼの低形対立遺伝子を保有する突然変異型マラリア原虫における代償経路の発達の理解

マラリア原虫の性的発達は、蚊の中腸で起こります。寄生虫の性段階を標的にすることは、感染をブロックするための有望な戦略です。私たちは、受精卵形成後にナノルシフェラーゼを発現するトランスジェニックP.bergheiであるOoklucを開発し、伝達阻害化合物のハイスループットスクリーニングを可能にしました。この記事では、Ooklucを使用したスクリーニングの方法について詳しく説明します。...

Ookluc: Plasmodium berghei 系統による感染阻止化合物の同定

学ぶマラリア原虫Plasmodium falciparumの感染性ガメトサイト培養法と蚊への膜給餌法。このプロトコルは伝播阻害研究と原虫ライフサイクル解析に応用可能です。

熱帯熱マラリア原虫人工膜供給による食作用細胞培養と蚊感染

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熱帯熱マラリア原虫 人工膜供給による食作用細胞培養と蚊感染

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