Name: 各種牛脳構造における狂犬病ウイルスの定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: 学ぶ qRT-PCRによる牛脳構造における狂犬病ウイルスN遺伝子の定量法。in vitro転写を用いた高感度検出技術で、家畜の狂犬病診断とウイルス分布解析に貢献します。

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この研究は、国立農林畜研究所(INIFAP)によって支援されました。この文書に関連するビデオの開発における彼のコラボレーションのためにJerzayn Fraustro Esquivelに感謝します。

この研究は、中央ナシオナル・デ・インベスティガシオン・ディシプリカルティフィケーション・エン・微生物学動物(CENID-MA)の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)が提供する動物の使用に関する勧告に従って承認され、厳格に実施されました。
1. サンプル
<ol><li>RT-PCR分析のために6つの異なる狂犬病陽性ウシ脳から解剖された脳の異なる領域を使用してください。</li>
</ol>2. 狂犬病を確認するための直接蛍光抗体(DFA)
注:DFAによる狂犬病抗原の検出は、フルオレセイン標識抗体を用いて狂犬病核タンパク質の存在を判定する定性的方法である。試験は、以下に説明するようにDeanら(1966)20によって提供されるプロトコルを用いて行った。
<ol><li>直径約15mmの無菌スライド上で、異なる脳構造から解剖された各組織から2つの印象を与えます。木製アプリケーターを使用して、組織の約3mm 3 部分を滅菌スライドに塗りつぶします。塗りつぶしを作成するには、手動で木製のアプリケーターをスライドに押し付けます。</li>
	<li>サンプルスミアスライドを-20°Cで1時間100%アセトンに沈め、スライドを固定します。 インキュベーション後、乾いた布でスライドを21°Cで30分間乾燥させます。</li>
	<li>フルオレセイン標識抗核タンパク質抗体の50 μLを、注射器を通して分配して1:10希釈時に各脳スミアに加えます。</li>
	<li>37°Cの湿気の多いチャンバーにコンジュゲートでスライドを1時間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、スライドを水で2回洗浄し、PBSで余分なコンジュゲートを除去します。スライドを21°Cで乾燥させます。 慎重に余分な液体を除去し、取り付ける前に一時的に空気乾燥を除去するためにブロット。</li>
	<li>セクションの表面を覆うために50%リン酸グリセリンの滴を加え、カバースリップで覆います。40倍の拡大で、蛍光顕微鏡下で切片を観察します。<ol>
<li>正および否定的なコントロール(陽性対照:RABVを接種したマウス脳;陰性対照:RABV陰性牛脳)をサンプルと同じ方法で処理し、観察する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. RT-PCRのポジティブコントロールの生成
<ol><li>胚芽バンクからBHK-21細胞を得る。70番目 の通路までの細胞を使用して、通路2を使用してRABVエブリン・ロキトニッキ・アバルセス(ERA)株を複製します。</li>
	<li>CO2(5%)の存在下で37 °Cで10%の胎児子牛血清(FCS)を補充した最低必須培地(MEM)を含むボトル内のBHK-21 細胞を維持し、伝播する(5%)湿気の多い条件下で。彼らは80%合流に達するまで25cm2 培養フラスコで細胞を成長させ、その後、サブカルチャー。</li>
	<li>培養液を細胞から取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でボトルを洗浄する。RABV株ERAの105 TCID /mLで培養を接種する。CO2(5%)の存在下で37°Cで一定の揺れの下で2時間ウイルス接種をインキュベートする(5%)湿気の多い条件下で。</li>
	<li>感染培地を除去し、5%(胎児ウシ)SFBを添加したMEMを加える。CO2(5%)の存在下で37°Cで72 時間インキュベート湿気の多い状態で。</li>
	<li>細胞が細胞性効果を示すときに接種後3日後にRABVを収穫する。感染した細胞を凍結し、4°Cで解凍して細胞を融解します。ボトルから培地を回収し、遠心分離チューブに細胞を入れ、4°Cで10分間1,050 x g で遠心分離します。</li>
	<li>RABVの上清を-80°Cで保存し、-70°Cで保管するための作業アリコートを準備します。</li>
	<li>前工程で得られたウイルスを21日目の雌CD1マウスに脳内接種する。1mLシリンジを使用して、106 MICLD 50(マウス感染性培養致死量50%) を含む溶液50μLを接種する。マウスへの用量22.</li>
</ol>4. RNA抽出
注:総RNAは、次のプロトコルに従って有機抽出法を使用してウシの脳から直接抽出しました。
<ol><li>各解剖学的構造から100mgの脳組織を使用して、グアニジウム・イソチオシアネートを含む市販の試薬を使用して全RNAを抽出する。</li>
	<li>グアニジウム・イソチオシアネート試薬の1mLの各構造から、最大速度で15sの小さな害虫を持つDounceホモジナイザーを使用して渦を出して、各構造から合計100mgの組織を手動で均質化する。</li>
	<li>サンプルを氷上で5分間インキュベートし、200 μLのクロロホルムを加えます。サンプルを15sの間激しく混ぜ、氷の上で2〜3分間インキュベートし、遠心分離機を12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。</li>
	<li>水相をきれいなチューブに移し、500 μLのイソプロピルアルコールを加えます。サンプルを21°Cで15分間インキュベートします。</li>
	<li>サンプルを12,000 x g で4°Cで10分間遠心します。 水性上清をピペットで吸引する。単離されたRNAは、チューブ内にペレットとして存在する。</li>
	<li>次に、75%エタノールの1 mLでRNAペレットをピペット処理し、遠心分離機を7500 x g で4°Cで5分間洗浄します。</li>
	<li>上清をデカントし、室温(21°C)でRNAペレットを空気乾燥します。次に、ペレットをヌクレアーゼを含まない水50μLで希釈します。</li>
	<li>分光光度計を用いて260nmでRNA濃度と品質を決定します。使用するまで-80°CでRNAを保存します。</li>
	<li>DNase I.で消化してRNAサンプルからDNAを除去し、前のステップで抽出したRNAの1μg当たりDNase Iの2 Uを加えます。次に、5 μLの10倍反応バッファーを加え、37°Cで30分間インキュベートします。混合物に1μLのEDTAを加え、続いて65°Cで10分間インキュベーションを行い、DNase Iを不活性化します。</li>
</ol>5. cDNA合成およびPCR
<ol><li>オリゴdTと逆転写酵素を用いて第一鎖cDNAを合成する。RNA 1 μg ごとに、オリゴ DT (500 μg/mL) を 1 μL、1μL の 10 mM dNTP ミックス、ヌクレアーゼフリー蒸留水を最終体積 12 μL に加えます。65°Cで5分間インキュベートします。</li>
	<li>反応混合物を4°Cに冷やす。 1,050 x gで30sのチューブを遠心し、4 μLの反応バッファー、2 μL 0.1 M DTT、リボヌクレアーゼ阻害剤(40 U/μL)を1 μL加えます。</li>
	<li>反応混合物を37°Cで2分間インキュベートし、1μLの逆転写酵素(200U)を加える。次に、反応混合物を37°Cで50分間インキュベートし、その後70°Cで反応を15分間不活性化した。</li>
	<li>cDNAは使用前に-20°Cに保存してください。 注:合成されたcDNAの品質を検証するために、インビトロの合成を行う前にRABV N遺伝子の761 bp断片の増幅を行う。Loza-Rubioら.11 で説明するプロトコルを使用して、後述するステップ5.5に記載されている。</li>
	<li>以下の条件でTaq DNAポリメラーゼを用いてPCRを行う。以下のように設定した反応を実行します: 20 mM MgCl 2、0.2 mM dNTPs を含む10x Taqバッファー、 1 U Taqポリメラーゼ、各プライマーの10 μM(SuEli+:5′cgtrgaycaatatgagtaca 3′とSuEli-:5′caggctcraacatttttattta'3'、2.5 μLのcDNA、および超純水を50μLの最終体積にする。</li>
	<li>サーモサイクラーで増幅を行い、以下のサイクリング条件を使用して、3分間95°C。30 sの95°C、30 sのための60°C、および1分のための72 °Cの35サイクル;72°Cの1サイクル7分間。</li>
	<li>1%アガロースゲルを使用して761 bp PCR産物の存在を評価します。</li>
</ol>6. インビトロ転写
注:インビトロ転写は、標的遺伝子のmRNAを生成する。完全なRABV N遺伝子を増幅するプライマーペアと、qRT-PCRアッセイの陽性対照として使用されるプライマーペアを使用してください。これらのプライマーは、完全なRABV N遺伝子を増幅し、T7ポリメラーゼを認識するプロモーターを添加するように設計されている(TAATACGACTActATAG)。
<ol><li>N遺伝子全体のRABVを増幅するには、プライマートランスNrabフォワード(5ʹガトガガクテクカトクトククトクト3ʹ)および逆(5ʹカアタカボクダクタガッガッガカガガート3ʹ)と高忠実度PCRキットを使用します。<ol>
<li>各反応に対して、クリーン PCR チューブ反応バッファー 10x、2 mM DMSO、25 mM MgCl2、10 mM dNt、10 μM の各プライマー、0.5 U の高忠実度ポリメラーゼ、1.5 μL の cDNA (ステップ 5 で調製)、超純水を 50 μL の最終容積に加えて、PCR マスター ミックスを調製します。</li>
		<li>増幅のために次の条件に設定されたサーモサイクラーを使用してください: 1分のための94 °C;94°Cの4サイクル(1分間、40°C)1分、72°C(2分間)94°Cの35サイクル(1分間、60°C)1分、72°C(2分間)2分間の72°Cの最終延長。</li>
	</ol>
</li>
	<li>インビトロ合成の鋳型としてPCR製品を使用し、ステップ6.1.2から酵素反応の成分を除去するには、メーカーの指示に従ってカラムベースの濃縮キットを使用してPCR製品を精製し、分光光度計を使用して定量化します。</li>
	<li>RNA合成には、インビトロ転写キットを使用し、次の反応混合物を使用します:5 μL T7転写5xバッファー、各三リン酸ヌクレオチドの1.9 μL、精製されたRABV N DNA VP2 DNAの10 μg、および酵素混合物の2.5 μL。次に、37°Cで4時間インキュベートする。その後、1 U/μg RNaseフリーDNaseを反応混合物に1μL加え、37°Cで15分間インキュベートしてDNA汚染を排除します。</li>
	<li>インビトロ転写RNAを精製し、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)を使用して濃縮します。</li>
	<li>精製したRNAペレットを70μLのTEバッファーに再懸濁し、使用するまで-80°Cで保存します。</li>
	<li>ステップ6.1から約5μgのPCR産物が得られるまでPCRプロトコルを繰り返します。精製および濃縮後、インビトロ転写されたN遺伝子mRNAは4.711 μg/μLの濃度で存在します。</li>
	<li>in vitro転写されたmRNAがこのプロトコルのステップ5に続くN遺伝子に対応していることを確認し、これをリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)の陽性対照として使用する。</li>
</ol>7. リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)
<ol><li>qRT-PCR の場合、メーカーの指示に従ってハイブリダイゼーション プローブを使用して、市販のワンステップ qRT-PCR キットと共に、完全な N 遺伝子を正のコントロールとしてコードするインビトロ mRNA トランスクリプトを使用します。カルネイロらによって記述されたプローブおよびプライマーを使用してください。 (2010)23 RABV遺伝子Nの保存領域を検出する(BRDesrot-Rev:5'aaactcaagagaggaacca3'3'、BRDesrot-Fwd:5′cgtactgggggaagggaattg 3'、およびBRDesrot-Probe:5-FAM-acaagggacccactttattatattatgc-3gcgc-3)。</li>
	<li>以下のサーマルサイクリング条件を使用してください:10分の50°Cの1サイクルと2分間の95°C;15sの場合は95°Cの40サイクル、30sの場合は50°C。</li>
</ol>8. 較正曲線または標準曲線
<ol><li>6デクリュプル希釈が得られるまで、1μg/μLのmRNAをチューブに連続的にピペット処理して、インビトロ転写mRNAのシリアル希釈を行います。標準曲線の作成に使用するために、3重で100 μLの体積でチューブを準備します。ステップ 7 で説明されているように qRT-PCR を実行します。</li>
	<li>ロータを使用したサーモサイクラーでqRT-PCRを実行するには、様々な脳サンプルを、標準曲線を作成するためのランニング反応と同時に処理し、細胞培養から分離された正のコントロール、陰性コントロール、上清を使用します。</li>
	<li>試験の検出限界、試験効果、感度を評価するには、同じ条件で三重化の標準曲線を使用します。</li>
</ol>9. 生物学的サンプルのqRT-PCR
<ol><li>RABV遺伝子Nの検出には、フィールドサンプルからのRNA、陽性対照、陰性対照、および細胞培養上清を使用して、ステップ7で説明したPCRキットを使用してqRT-PCRを行います。</li>
	<li>ウシの脳サンプルに存在するRABVゲノムのコピー数を決定するために、標準曲線および生体試料から、および較正曲線式から補間されたものからCtデータを得る。</li>
</ol>

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著者は宣言する利害の対立を持っていません。

これまでの研究では、DFAは、試料が室温(21°C)14で保存されてから7日以内にRABVを検出することしかできないということが示されている。これに対し、この研究は、サンプルが室温に12日間曝露された後、RT-PCRの感度が低下し始めるということを実証した。したがって、RABVゲノムは、室温に曝露されたサンプル中のqRT-PCRによって最大23日間検出することができる。これは、より高度に分解されたサンプルに対してqRT-PCRの感度が比較的高いことを示しています。しかし、特異性25を損なわないより単純な方法を開発することは依然として必要である。本研究は、特定の脳構造に関わらずウイルスゲノムを検出できたという観察に基づき、DFAよりも高感度を有する分子アッセイを実証した。
感染性薬剤の検出に使用するRT-PCR技術の利点は、いくつかの科学的研究で強調されています。ただし、この手法には特殊な機器が必要なため、実行コストなどの欠点が発生する場合があります。分子生物学アッセイを扱うためには、訓練...

狂犬病は、脳、皮膚、尿、または唾液中のウイルス核酸の検出を可能にする様々な技術によって、前死性および事後分析を確認することができる1。狂犬病ウイルスの核タンパク質(N)遺伝子の検出は、主に分子検査による狂犬病診断に用いられる。この遺伝子は、ウイルスのジェノタイピングにも使用されます。狂犬病は、影響を受けた脳の任意の部分を使用して動物で診断することができます。しかし、狂犬病の可能性を排除するために、脳内の少なくとも2つの領域からの組織を2をテストする必要があります。動物の狂犬病検出にはいくつかの診断方法が存在する。しかし、直接免疫蛍光試験は標準基準技術3のままである。その他の試験には、マウスの接種、組織培養における感染、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)4を組み込んだ生物学的試験が含まれる。これらの技術はすべて、世界保健機関(WHO)と世界動物衛生機構(OIE)が、人間と動物の狂犬病の診断に推奨しています。
核酸検出および増幅技術は、近年6年に狂犬病の診断に革命をもたらし、これらの技術はヒト狂犬病のアンティ・モーテム診断において重要な役割を果たしている。いくつかのPCRベースのテストは、アンティモテと死後の狂犬病の診断7、8、9、10のための従来のテストを補完するために評価されています。ほとんどのアッセイは、ウイルスゲノム1,11において最も保存性の高い領域である増幅のための狂犬病ウイルス核タンパク質遺伝子を標的とする。この20年の間にRABVを診断するために様々な分子アッセイが開発され、これらのアッセイの一部がウイルス特性評価に用いられてきた。ほとんどの試験は、ウイルスゲノム内の保存された遺伝子を検出することを目的としており、最も一般的には従来のまたは定量的なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)アッセイ12,13を用いて行う。
PCRは、これらの組織が分解されても、組織内の特定の病原体のゲノムを検出することができる高感度診断技術です。PCRベースのアプローチを用いて、DNAヌクレオチド配列14の選択的かつ反復的な増幅を通して臨床サンプルで感染因子の最小量を検出することができる。蛍光プローブ(例えば、TaqMan)またはDNA結合色素(例えば、SYBRグリーン)を組み込んだqRT-PCRは、RABVを高感度で アンティと ポストの両方 の分析 の診断に試験で使用されています。ただし、このようなアプローチには特殊な機器が必要です。この制限を克服するために、逆転写ループ媒介等温増幅(RT-LAMP)は、その低コスト、シンプルさ、およびRABVの検出に望ましい特性に基づいて示唆されている。このアッセイは、発展途上国15で使用することができるので特に重要である。
qRT-PCR は分子の検出と定量に基づいており、蛍光シグナルの増加は、単一の反応で PCR 産物の量に直接比例します。核酸標的のコピー数が増加するにつれて、蛍光も増加する。蛍光色素およびクエンチャーを運ぶSYBRグリーンDNA結合色素や配列特異的オリゴヌクレオチドプローブなどの非特異的なインターカレート色素は、一般的にqRT-PCRで蛍光読み出しを提供するために使用されます。このアッセイは、試験時間の短縮(2~4時間)、閉管システムによる汚染リスクの低減(増幅産物のPCR後の操作の欠如)、および異なるターゲットを同時に検出する機能を含む従来のRT-PCRよりも利点を提供します。qRT-PCRは唾液および他のサンプルからの狂犬病の前検を診断するために使用することができる。このアッセイはまた、RABV15の異なるリッサウイルス種または系統の検出のための普遍的なリアルタイムテストとして使用することができる。このコンボRT-PCRアプローチでは、2つの反応が使用されます。最初はRABVの異なる遺伝的なリナジを検出し、第二はリサウイルス種を検出する。どちらのステップもqRT-PCRアッセイを含み、最初はハイブリダイゼーションプローブを使用し、2番目は染料15を使用します。この技術を用いてRABVの分子検出に成功した多数の試験のために、現在のOIE地球マニュアル(2018)は、RABV17の分子検出のためのPCRの使用を推奨しています。
メキシコは家畜の可能性が高い国です。家畜生産量が最も高い州には、狂犬病の主な送信機である吸血鬼コウモリ デスモドゥス・ロタンドゥス の存在により狂犬病の流行の危険にさらされている湿気の多い熱帯地域と乾燥した地域の両方が含まれています。そのため、メキシコの牛麻痺性狂犬病(BPR)の予防と制御のためのより多くのツールを開発することが不可欠です。これに基づいて、本研究の目的は、狂犬病感染による死亡後の牛脳の異なる解剖学的構造におけるウイルス粒子の数を決定するために定量的なqRT-PCRを使用することであった。
RABV陽性ウシから得られた6つの脳を、以下に記載するqRT-PCRプロトコルの開発に使用するために外部の実験室から寄贈された。ウシの脳構造サンプルを、INIFAP CENID-MAラボBSL-2施設に冷鎖輸送し、使用するまで-80°Cで保存した。脳はカンペチェ、ユカタン、ケレタロの州から動物から得られた。領収書の前に、様々な構造が脳から解剖されました。これらの構造には、アンモンの角、小脳、皮質、髄質、ポン、視床18、19が含まれていました。遺伝物質は以下に記載されるように抽出した。RABV診断は、直接蛍光抗体(DFA)20を用いて確認した。陽性対照として、RABV21を接種したマウス脳が用いられた。さらに、4つのRABV陰性牛の脳(DFAによって決定される)を陰性対照として使用した。

<table><tbody><tr><td>クロロホルム</td><td>SIGMA</td><td>C7559</td><td>鉱物油を重ね合わせたPCRの水相の回収を容易にします。</td></tr><tr><td>DNAクリーン&コンセントレーター-500</td><td>Zimo</td><td>D4031</td><td>DNAクリーン&Concentrator-500 (DCC-500)は、最大500 & microの迅速で大判の精製と濃縮のために設計されています。g、大規模な制限エンドヌクレアーゼ消化、不純DNA調製物を含むサンプルからの高品質DNA。</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>アムレスコ</td><td>193-500</td><td>核酸の精製</td></tr><tr><td>FastStart ハイフィデリティ PCR システムキット、dNTPack</td><td>Roche</td><td>3553400001</td><td>ランダムな塩基変化を避けるPCR産物の増幅のためのハイフィデリティ酵素</td></tr><tr><td>GelDoc XR</td><td>BioRad</td><td>XR+</td><td>より大きなタンパク質およびDNAゲルを分析</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>新世代の核酸ゲル染色剤は、色素が生細胞内の核酸と相互作用する可能性を最小限に抑えるように設計された新しい化学的特徴を備えています。</td></tr><tr><td>iCycler サーマルサイクラーグラジエント</td><td>BioRad</td><td>582BR</td><td>温度は、装置アルゴリズム、インサンプルプローブ、またはサンプルブロックモードで監視および制御できます</td></tr><tr><td>iTaqユニバーサルプローブ ワンステップキット</td><td>BioRad</td><td>1725141</td><td>TaqManタイプハイブリダイゼーションプローブを使用してリアルタイムでPCR反応を行うための反応混合物</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>Amresco</td><td>0918-500</td><td>核酸の沈殿</td></tr><tr><td>QIAquickゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>QIAquickキットには、高塩緩衝液にDNAを結合し、低塩緩衝液または水で溶出するためのシリカ膜アセンブリが含まれています。精製手順では、DNAサンプルからプライマー、ヌクレオチド、酵素、鉱油、塩、アガロース、臭化エチジウム、およびその他の不純物を除去し</td></tr>ます <tr><td>M-MLV 逆転写酵素</td><td>Invitrogen</td><td>28025-021</td><td>Moloney Mouse Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) は、プライマーの存在下で一本鎖RNAまたはDNAを使用して、相補的な DNA鎖を合成します。</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo-Scientific</td><td>ND2000</td><td>微量分光光度計</td></tr><tr><td>オリゴ(dT)18プライマー</td><td>Invitrogen</td><td>SO132</td><td>オリゴ(dT)18プライマーは、末端が5'および3'-ヒドロキシル末端を持つ合成一本鎖18-merオリゴヌクレオチドです。</td></tr><tr><td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>In vitro転写反応は、組換えDNAテンプレートからマイクログラム量のRNAプローブを合成するために使用されます。RNAプローブを生成するように設計されたほとんどの転写反応は、大量のRNAを生成するのではなく、放射性標識リボヌクレオチドの取り込みを最大化するように最適化されています</td></tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ</td><td>Invitrogen</td> <td>#EP0402</td><td>Taq DNAポリメラーゼは、好熱性細菌Thermus aquaticusの高耐熱性DNAポリメラーゼです。この酵素は5'と3'DNA の合成 &nbsp;</td></tr><tr><td>TRIzol試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>TRIzol試薬は、高品質のトータルRNAの単離、または様々な生体サンプルからのRNA、DNA、タンパク質の同時単離のために設計された、すぐに使用できる完全な試薬です。</td></tr></tbody></table>

各種牛脳構造における狂犬病ウイルスの定量

Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures

牛麻痺狂犬病(BPR)は、大きな人獣共通感染症をもたらすラテンアメリカ全体で経済的に重要なウイルス性脳炎の一種です。ここで我々の目的は、実験プロトコルを用いて、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を用いて、異なる牛脳解剖学的構造における狂犬病ウイルス(RABV)ゲノムの相対的なコピー数を決定することであった。qRT-PCR は、サンプル中に存在する標的核酸の量に直接比例する増幅後に放出される蛍光に基づいてサンプルに存在する特定の数の遺伝子コピーを定量化します。この方法は、その短い期間、汚染のリスクの低減、および他の技術と比較してより容易に異なるサンプル内のウイルス核酸を検出する可能性のために有利である。狂犬病の6匹の動物の脳は、アンモンの角、小脳、皮質、髄質、ポン、視床の6つの解剖学的構造に分けられた。すべての脳は、直接免疫蛍光試験に基づいてRABV抗原に陽性であると同定された。4つのRABV陰性ウシの脳から同じ解剖学的構造も評価された。RNAを各構造から抽出し、qRT-PCRに使用した。インビトロ転写されたヌクレオタンパク質遺伝子を用いてRABV遺伝子のコピー数を決定するためにアッセイを行った。ウイルスRNAを定量化するために使用される標準曲線は、100%の効率と0.99の直線性を示した。分析の結果、これらの構造がRABVの最高レベルを有するという観察に基づいて、皮質、髄質、視床がRABV検出に使用する理想的なCNS部分であることがわかりました。試験特異性は100%であった。すべてのサンプルは陽性であり、偽陽性は検出されなかった。BPRの診断中に、低レベルのRABVを含むサンプルでRABVを検出するために使用できます。

DFAの結果は、それぞれ100%、100%、83.3%、66%、および50%の皮質、視床、髄質、ポン、ホーンにおけるRABVの陽性を示した。これらの結果は、前の結果を確認し、各脳から解剖された構造の少なくとも3つはRABVに陽性であった。代表的な正の DAF 染色を 図 1に示します。
図2 は、Loza-Rubioららによって報告されたプライマーを最初に有するRABV N遺伝子の断片(ステップ5.5)の増幅を示す。これは、増幅に用いられる材料が良好な品質であることを示した。
PCR増幅フラグメントのサイズを 図3に示します。標準曲線の式は、サンプル中のRABV遺伝的含有量の量とPCR増幅断片のサイズとの関係を示す。RABV遺伝的含有量(ng)の量は 、図4</...

このプロトコルは、in vitro転写を用いて様々な牛脳解剖学的構造内の狂犬病ウイルスヌクレオプロテイン(N)遺伝子コピー数を決定するためのqRT-PCRベースのアプローチを提示する。

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major ...

様々な牛の脳構造における狂犬病ウイルスの定量化メキシコは家畜の可能性が高い国です。家畜生産量が最も高い州には、吸血鬼のコウモリ、狂犬病の主な送信機であるDesmodus rotundusの存在により狂犬病の流行の危険にさらされている湿気の多い熱帯地域と乾燥した地域の両方が含まれています。狂犬病ウイルスの検出は、ヌクレオプロテインN遺伝子が主に分子検査による狂犬病診断に用いられる。PCRベースのアプローチを使用すると、DNAヌクレオチド配列の選択的および反復増幅を通じて、臨床サンプルで感染因子の最小量を検出することができます。qRT-PCR は、蛍光シグナルが増加する分子の検出と定量が、単一の反応における PCR 産物の量に直接比例して行われているものに基づいています。核酸標的のコピー数が増加するにつれて、蛍光も増加する。これに基づいて、研究の目的は、狂犬病感染による死亡後、牛の脳の異なる解剖学的構造におけるウイルス粒子の数を決定するために定量qRT-PCRを使用することであった。総RNAは、以下のプロトコルに従って有機抽出法を用いてウシの脳から直接抽出した。各解剖学的構造から100ミリグラムの脳組織を使用して、グアニジニウムイソチオシアネートを含む市販の試薬を使用して全RNAを抽出する。グアニジニウムイソチオシアネート試薬の1ミリリットルの各構造から、最大速度で15秒間、マイクロチューブ内に小さな害虫を持つDounceホモジナイザーを使用してボルテックスすることにより、各構造から合計100ミリグラムの組織を手動で均質化する。サンプルを氷の上で5分間インキュベートし、200マイクロリットルのクロロホルムを加えます。サンプルを15秒間激しく混ぜます。氷の上で2〜3分間インキュベートし、12,000 x gで遠心分離機を摂氏4度で15分間インキュベートします。水相をきれいなチューブに移し、500マイクロリットルのイソプロピルアルコールを加えます。サンプルを摂氏21度で15分間インキュベートします。サンプルを摂氏4度で10分間10分間遠心分離する。ピペット処理により水性上清を吸引する。単離されたRNAは、チューブ内にペレットとして存在する。次に、75%エタノールの1ミリリットルでRNAペレットを7、500 x gの摂氏4度で5分間遠心分離機で洗浄します。上清をデカントし、空気は室温、摂氏21度でRNAペレットを乾燥させます。次に、50マイクロリットルのヌクレアーゼを含まない水でペレットを希釈します。分光光度計を用いて260ナノメートルでRNA濃度と品質を決定します。インビトロ転写は、標的遺伝子のmRNAを生成する。完全なRABV N遺伝子を増幅するプライマーペアと、qRT-PCRアッセイの陽性対照として使用されるプライマーペアを使用してください。これらのプライマーは、完全なRABV N遺伝子を増幅し、T7ポリメラーゼを認識するプロモーターを添加するように設計されている。N遺伝子RABV全体を増幅するには、プライマートランスとRABフォワードとリバース、および高忠実度PCRキットを使用してください。各反応に対して、各プライマーの10マイクロモルと0.5単位の高忠実度ポリメラーゼを用いたクリーンなPCRチューブ反応バッファーに添加して、PCRマスターミックスを調製します。インビトロ合成のテンプレートとして PCR 製品を使用し、酵素反応の成分を除去するには、メーカーの指示に従って、カラムベースの濃縮キットを使用して PCR 製品を精製します。そして、分光光度計を用いて定量化する。RNA合成には、インビトロ転写キットを使用し、次の反応混合物を用いて、5マイクロリットルT7転写5Xバッファー、各三リン酸ヌクレオチドの1.9マイクロリットル、精製RABV N DNAの10マイクログラム、および2.5マイクロリットルの酵素混合物を使用する。次に、摂氏37度で4時間培養する。次に、反応混合物にマイクログラムRnase-Free DNaseあたり1単位の1マイクロリットルを加え、37度で15分間インキュベートしてDNA汚染を排除します。インビトロ転写RNAを精製し、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを25:24:1の比率で濃縮します。精製したRNAペレットを70マイクロリットルのTEバッファーに再懸濁し、使用するまで摂氏80度で保存します。PCR プロミコールを、約 5 マイクログラムの PCR 産物が得られるまで繰り返します。精製および濃縮後、インビトロ転写されたN遺伝子mRNAは、マイクロリットル当たり4.711マイクログラムの濃度で存在する。in vitro転写されたmRNAがこのプロトコルのステップ5に続くN遺伝子に対応していることを確認し、これをリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、qRT-PCRの陽性対照として使用する。リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応のために、完全なN遺伝子を陽性対照としてコーディングする際にin vitro mRNA転写物を使用する。市販のワンステップqRT-PCRキットとともに、メーカーの指示に従ってハイブリダイゼーションプローブを使用。コロナドおよび同僚2010によって記述されたプライマーのプローブを使用して、以下の熱循環条件を用いてRABVの保存領域を検出する。6つの分離希釈が得られるまで、mRNAのマイクロリットル当たり1マイクログラムをチューブに連続的にピペット処理することによって、インビトロ転写mRNAの連続希釈を行う。標準曲線の作成に使用するために、3重で100マイクロリットルの体積でチューブを準備します。前述のとおり、qRT-PCR を実行します。ローターを使用して、さまざまな脳サンプルを実行反応と同時に処理して、標準曲線を作成し、細胞培養から分離された正のコントロール、陰性コントロール、上清を使用して、ローターを使用してqRT-PCRを実行します。試験の検出限界、試験効果、感度を評価するには、同じ条件で三重化の標準曲線を使用します。RABV遺伝子Nの検出には、上記のPCRキットを使用してqRT-PCRを実行するために、フィールドサンプル、陽性対照、陰性対照、および細胞培養上清からのRNAを使用します。ウシの脳サンプルに存在するRABVゲノムのコピー数を決定するために、標準曲線および生体試料からCTデータを取得し、そして検量曲線式から補間されたものから、この図は、直接免疫蛍光に従って陽性染色を示す牛の脳組織を示す。結果は、皮質、視床、髄質、ポン、および角におけるRABVの100%100%83.3%66%および50%陽性を示す。これらの結果は、前の結果を確認し、各脳から解剖した少なくとも3つの構造がRABVに陽性であった。一方、標準曲線の式は、サンプル中のRABV遺伝的含有量の量とPCR増幅断片のサイズとの関係を示す。ナノグラム中のRABV遺伝的含有量の量は、この図に示した式を用いて較正曲線中のCT値の補間によって推定された。この式を用いて、ウイルスRNAのマイクロリットル当たり10倍から5マイクログラムの検出限界がRABVゲノムの36コピーに相当することを発見した。これらの結果は、アッセイが感受性であり、RABV N遺伝子のコピー数が少ないサンプル中のウイルスを検出するために使用できることを示しています。アッセイの効率は、標準曲線の傾きを用いて計算した。これは3.28であった。qRT-PCRに使用したサンプルは、RABV N遺伝子の増幅を示した。存在するウイルスコピーの数を決定するために、各サンプルのCT値を、較正曲線式を用いて補間した。ナノグラムで得られた結果を、ここで説明する式に置換した。次の表は、qRT-PCR と DFA の比較結果を示しています。qRT-PCRアッセイの結果はDFAを用いて得られたものと一致した。CおよびDの場合におけるqRT-PCR試験で得られた結果によると、視床はRABV N遺伝子のコピー数が最も多い構造である。これは、これらのニューロンが動物の栄養機能を制御することを考えると、視床下部および視床神経の早期感染が疾患の発症に重要であることを示唆している。各サンプルの各構造で検出されたRABV N遺伝子のコピー数は、すべてのサンプルが陽性であったため、qRT-PCR試験の感度と特異性が100%です。この結果は、サンプルの初期診断と一致します。qRT-PCR は高感度の手法です。一部の手順は、最良の結果を得るために重要です。その一つがRNA抽出のためのサンプルの適切な取り扱いです。RNAが分解しやすく、結果が影響を受ける可能性があるため、このステップは非常に重要です。プロセス中に約4°Cの寒い条件でサンプルを維持することを検討してください。さらに、インビトロ転写に記載されているように、数ラウンドのPCR適用が行われることを考慮する。この研究で行われたqRT-PCRアッセイは、組織の1ミリグラム当たりRABV N遺伝子の36.3コピーを検出することができた。qRT-PCRに最も適した脳構造には、皮質および視床が含まれていた。これは、これらの構造でRABV N遺伝子の濃度が高いことが検出され、また、RABV参照試験を用いて陽性であることが判明した観察に基づいています。この試験では、様々なサンプル中のウイルスの9番目のコピーに0.00023倍の非常に低い濃度を検出することができました。サンプル中のウイルス粒子を定量することに加えて、この試験は、ここで提示されたRABVの検出のための良好な代替診断および研究ツールを提供するように見える。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このウイルスは大脳皮質の錐体ニューロンに感染し、発現したウイルスタンパク質は封入体として知られる細胞質内顆粒構造内に局在します。...

狂犬病ウイルス感染マウス脳組織におけるウイルスタンパク質の検出

このビデオは、感染したマウス脳組織における狂犬病ウイルス抗原検出のための免疫組織化学染色を示しています。このプロセスには、脱パラフィンとアルコール処理が含まれ、その後、抗原のアクセシビリティを強化するためのタンパク質分解処理が行われます。免疫組織化学染色では、赤色の沈殿物が明らかになり、組織切片に狂犬病抗原が存在することが確認されます。...

狂犬病ウイルス抗原検出のための免疫組織化学染色

出典: Zaeck, L., et al. 溶媒除去された脳組織における狂犬病ウイルス感染の高解像度3Dイメージング。 J. Vis. Exp. (2019).

マウス脳組織における狂犬病ウイルス感染の3次元可視化

溶媒除去された器官の究極の3Dイメージングのような新しい、免疫染色互換組織クリアリング技術は、狂犬病ウイルス脳感染症とその複雑な細胞環境の3D可視化を可能にします。厚い、抗体標識された脳組織スライスは、画像深さを高め、共焦点レーザー走査顕微鏡による3D解析を可能にするために光学的に透明に作られています。...

溶媒クリア脳組織における狂犬病ウイルス感染の高解像度3Dイメージング

直接急速免疫組織化学検査(DRIT)は、狂犬病診断のための直接蛍光抗体(DFA)検査に代わる世界動物衛生・世界保健機関(OIE/WHO)に代わる方法を提供しています。このテストは軽い顕微鏡を使用して脳の印象に約1時間で行うことができる分野ベースの適用を可能にする。...

直接急速な免疫組織化学試験を用いた狂犬病サーベイランスの強化

このプロトコルの目的は、狂犬病検査のための満足のいく組織サンプルを得るために、小動物および大型動物における安全な壊死技術を実証することである。...

大小動物における狂犬病壊死技術

脳生検サンプリングから最終解釈まで、迅速な免疫クロマトグラフィー診断検査(RIDT)を用いて、現場条件下での動物狂犬病の死後診断のための完全なプロトコルを提示する。また、分子解析やウイルス遺伝子作成用の装置を用いたさらなる応用についても説明する。...

フィールド死後狂犬病は、さらなる分子用途を用いた資源限定設定のための迅速な免疫クロマトグラフィー診断試験

ここでは、ホルマリン固定組織の代替診断試験として狂犬病ウイルス抗原の検出のための免疫組織化学試験プロトコルを紹介する。...

ホルマリン固定組織からのリサウイルス抗原検出のための免疫組織化学試験

ここでは、ナノポア技術を用いて狂犬病ウイルス(RABV)ゲノムを特徴付けるための迅速で費用対効果の高いワークフローを紹介します。このワークフローは、地域レベルでのゲノミクス情報に基づくサーベイランスを支援することを目的としており、狂犬病対策の指針となるために、循環するRABV系統と地域系統学内でのRABV系統の位置に関する情報を提供します。...

ナノポア技術を用いた狂犬病ウイルスの迅速な特性評価のための全ゲノムシーケンシング

このプロトコルは、一部の非狂犬病リッサウイルスおよびラゴモルフのアッセイ性能を改善するためのプライマー配列および製剤の更新を含む、組織収集から結果の解釈までの汎リッサウイルスLN34リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)アッセイを実証しています。また、シングルウェルLN34マルチプレックス(LN34M)フォーマットのアッセイセットアップのデモも行います。...

更新されたマルチプレックスLN34リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイによる動物の狂犬病の死後診断

学ぶ qRT-PCRによる牛脳構造における狂犬病ウイルスN遺伝子の定量法。in vitro転写を用いた高感度検出技術で、家畜の狂犬病診断とウイルス分布解析に貢献します。

各種牛脳構造における狂犬病ウイルスの定量

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