Name: 実験室マウスにおける未熟なハードティックステージのカプセルベースモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 学ぼう、実験室マウスを用いた未熟な硬いダニの飼育法。EVAフォーム製カプセルを背部に装着し、Ixodes ricinusの若虫の吸血成功率を高め、経時的なモニタリングと動物の再利用を可能にする革新的な手法です。

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我々は、アラン・ベルニエ・フランス農業研究所(INRAE)とオセアン・ル・ビデル(ANSES)の技術支援を認める。この研究は、DIM One Health - レギオン・イル・ド・フランス(プロジェクトの頭字語:NeuroPaTick)によってサポートされました。マウスはANSESによって購入した。ジェフリー・L・ブレア博士は、以前のバージョンの原稿を見直したことで認められています。

この議定書は、すべての福祉および安全対策が実験室で満たされている場合にのみ適用できることに注意してください。このプロトコルは、動物実験のための倫理委員会ComEth Anses/ENVA/UPEC、許可番号E 94 046 08によってダニの餌付けのためにマウスを使用する許可を受けました。エンドポイントについては、動物をそれぞれ4分および5分の2つの段階で9分間CO2 にさらした。
1. カプセルの準備
<ol><li>2 mmの厚さのEVA-foamと接着二重粘着性の泡を一緒に貼り付ける(図1A)。</li>
	<li>20mmの革の穴のパンチを使用して、貼り付けた泡片から円を切り取ります。次に、直径12mmの穴パンチを使用して、内部をカットして二重泡円を作成する(図1B)。 注:カプセルのフレームの厚さは、ホストスキンに接着プロセスに十分な表面を保証するために、サイズが3mm以上でなければなりません(下記参照)。</li>
	<li>粘着状二重粘着性フォームから保護紙のストリップを剥離し(図1C)、直径20mmの透明な円形プラスチックを取り付けます(図1D)。 注:幼虫に餌を与える場合は、保護用の用紙を粘着フォームから取り外して、プロトコルのステップ2に直接移動してください。保護用の紙のストリップを含む二重泡リングをマウスに接着します。</li>
	<li>透明プラスチックに~1cmのスリットを入します(図1E)。</li>
	<li>実験中に過度の水分蒸発を可能にするために、少なくとも10個の小さな穴を、内膜ピン(図1F)で作成します。 注:カプセル(図1G)は4 mm(2 mmの粘着性の泡と一緒に2つのmm EVA-foam)の総高さを有し、すべての硬いダニ種のニンフおよび幼虫を供給するために使用することができる。カプセルサイズ(図1H)の20mm外径はマウスの株のほとんどに適していますが、必要に応じて変更することができます。</li>
</ol>2. ダニの侵入前のマウスの調製
注:この研究では、10〜12週齢の雌の実験マウス(株C57BL/6およびBALB/cByJ)は、フランス食品産業安全庁(ANSES)で アドリビタム (-20 Paのグリーンライン換気ラック)を提供する食品と水を備えた標準的なケージに維持されました。動物は、異常な皮膚反応、健康上の問題または合併症について経験豊富な技術者によって1日2回監視された。
<ol><li>誘導室でイオブルランでマウスを麻酔します。麻酔が行われたら、マウスを操作パッドに置き、連続イオブルラン供給のためにノーズコーンに取り付けます(図2A)。呼吸数を監視し、イオブルランレベルを下げ、1分間に80回未満の呼吸を確実にします。 注:操作の前に、必要に応じて、入れ墨や無線周波数識別チップによって個々のマウスにラベルを付けます。噛み付きによるカプセルの損傷を避けるために、個々のマウスを別々のケージに入れておくことをお勧めします。</li>
	<li>肩甲骨の後ろから、耳のすぐ後ろの領域までマウスの前部を剃ります(図2A)。 注: 剃った領域はカプセル表面より大きくなければなりません。</li>
	<li>調製されたカプセルのEVA-foamサイト全体に非刺激性ラテックス接着剤を塗布し、1分間待ちます(図2B)。</li>
	<li>指でわずか3分の一定圧(図2C)で、特にカプセルの左右にカプセルをマウスに接着します。カプセルを少し持ち上げて、皮膚への付着を視覚的に確認します。接続されていない領域が見つかった場合は、へらを使用してさらに接着剤を適用し、さらに3分間押します。</li>
</ol>3. ダニの侵入
<ol><li>ニンフの出没については、ステップ1.4で作られたカットを介してカプセルに個々のニンフを導入します(図2D)。 注 :Ixodes ダニ種の場合、1つのカプセルあたり最大20ニンフが推奨されます。</li>
	<li>カプセルを両側から少し絞って、透明なプラスチックを曲げて、細かい解剖鉗子を使用して個々のニンフを簡単に導入できるようにします(図2D)。カプセル内のカットを介して個々のニンフをプッシュします。中に入ったら、鉗子を90°に回し、鉗子を引き出してカプセル内にダニを堆積させる。</li>
	<li>幼虫の侵入の場合は、付属のカプセルから紙のスリップを取り外します(図2E)。注射器を入れて、幼虫(図2F)を含む注射器をカプセルの中に直接入れ、シリンジプランジャーを押してダニを沈下します。スプランジャーを皮膚に向かってそっと回して、取り付けられた残りの幼虫を取り除きます。 注:実験の前に、綿で切断された端部を差し込んだ1mLの注射器に幼虫を入れてください。</li>
	<li>幼虫を皮膚に付着したら、透明なプラスチックを取り付けてカプセルを閉じる(図2G)。</li>
	<li>カプセルの周りに保護プラスチックバンドを適用します (図2H)。 注:保護プラスチックバンドは、実験の全期間のカプセルの耐久性を大幅に改善しました(図2I,J)。1つの個々のマウスに2つのカプセルを取り付けることができます(図2K)。この場合、カプセル間の最小3mmのスペースが必要であり、剃った領域を適切に増加させるべきです。</li>
	<li>マウスをケージに戻します。</li>
</ol>4. ティックのコレクション
<ol><li>上のステップ 2.1 のようにマウスを麻酔します。</li>
	<li>十字形のカット(図3A)をメスでプラスチックに作ります。 注:この十字型のカットは、必要に応じて、魅惑的なダニや給餌ダニの剥離の簡単なコレクションを可能にします。</li>
	<li>必要に応じて、透明プラスチックに粘着プラスチックパッチを貼り付けてカプセルを再閉します(直径20mm、図3B)。 注: 複数のポイントでのティックの収集が必要な場合は、同じ粘着性のプラスチック パッチを使用できます。プロトコルが必要な場合は、マウスを安楽死させ、カプセルを取り外し、ティックを収集/デタッチすることもできます(図3C)。</li>
</ol>5. マウスの回収
<ol><li>さらに1週間、マウスをケージに入れておきます。</li>
	<li>カプセルを自然に切り離しましょう。 注:この場合、カプセルが落ちるのに約8〜9日かかります。カプセルを取り除くとき、マウスの皮膚に異常な反応がないか確認することが重要です。刺激の場合にはエモリエントローションを塗るが、通常は治療は必要ない。倫理プロトコルが許せば、回復されたマウス(図3D)は別のダニの侵入または異なる実験のために再利用することができます。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

プロトコルの最も重要なステップは、マウスの皮膚にカプセルの固い接着です。したがって、ラテックス接着剤は、カプセルのEVA-フォーム表面全体に均一に適用されるべきであり、特にカプセルの左右に3分間一定の圧力を適用する必要があります。また、後足を使用してマウスによる除去を避けるために、できるだけ前方にカプセルを背面に配置することをお勧めします。我々の実験では、マウスの皮膚へのEVA-フォームおよびラテックス接着剤の接着のみが検証されており、異なる材料を使用して同じ結果の達成を保証することはできません。
実験の間、最初の7日以内に皮膚からカプセルの剥離は観察されなかった。プラスチックバンドを使用してカプセルの外面を保護することを強くお勧めします(図2H)。保護バンドがダニの供給の過程で損傷している場合、それは新しいものに置き換えることができます。カプセルの直径は、異なるマウスひずみサイズに応じて変更することができます。私たちは、少なくとも1日2回の給餌ダニを監視し、剥離直後に魅惑的なダニを収集して乾燥を避けることをお勧めします。...

ダニは、いくつかの病原体の重要なベクターであり、動物および人間の健康に深刻なリスクを表す1.効果的な給餌システムの設定は、生物学、ダニ-宿主と病原体の相互作用を研究する際、または効果的な制御手段を確立する際に重要です。現在、生きている動物の使用を避けるいくつかの人工的な給餌システムは、ティック22、3、43のために利用可能であり、4これらは実験的条件が許すたびに利用されるべきである。しかし、様々な実験環境では、これらのシステムは特定の生理学的特徴を適切に模倣できず、関連する結果を達成するために生きている動物の使用が必要である。
実験室用マウスは、多くの生物学的システムの研究に一般的に使用され、ダニ,,95、6、7、8、96,7を供給するための宿主として日常的に利用されている。58マウスに未熟なダニを供給する2つの最も一般的な方法には、遊離感染とマウスに取り付けられた閉じ込めチャンバーの使用が含まれる。無料の出没は主に幼虫段階に使用され、魅惑的なダニは回復できる領域に落ちることができます。監禁室は、通常、マウスの背中に接着されたアクリルまたはポリプロピレンキャップで構成されています。最初の技術は、ダニの供給のための効果的な自然システムですが、個々のダニがホスト体の異なる部分に分散しているため、実験中に綿密な監視を行うことは許可されません。さらに、回復領域に落ちるエンゴージドダニは、ダニの適性に深刻な影響を与える可能性のある便および尿10、11、12、13、14で汚染され、動物と回復領域10,11,12,13,1415との間に分離がない場合にはマウスによって損傷または食べられる可能性がある。チャンバーベースのシステムは、定義された領域へのティックの閉じ込めを可能にしますが、接着プロセスは面倒であり、キャップはしばしば接着剤に弱く付着し、実験16、17、18、19,17,18,19の間にしばしば取り外されます。キャップはまた、硬く、不快であり、皮膚反応を引き起こし、マウスの再利用を防ぎ、実験後に安楽死を必要とする。
我々の前の研究では、実験室のウサギ20にダニを供給するためのエチレンビニル酢酸(EVA)フォームで作られたチャンバーを使用して効果的なシステムを開発することに成功しました。本明細書では、このシステムをマウスモデルに適合させ、EVA-foamから作られた閉じたカプセルに未熟なハードティック段階を供給する簡単でクリーンな方法を提案する。具体的には、当社のシステムは、急速な乾燥(3分)、非刺激ラテックス接着剤で剃ったマウスに接着弾性EVAフォームカプセルを使用しています。この技術は実験マウスへのカプセルの堅固で長持ちする付着、ならびに実験の全過程の間に有効なダニの侵入/収集を可能にする。平らなカプセルは、柔軟な材料から作られており、採血やその他の目的のためにマウスの操作を妨げません。このシステムは主にニンフモルチック段階に適していますが、わずかな変更で幼虫の餌付けにも使用できます。この方法は、1人の経験豊富な人が完了することができ、広範なトレーニングは必要ありません。

<table><tbody><tr><td>EVAフォーム 厚さ2mm、(低密度)</td><td>コスプレショップ</td><td>EVA-45kg (950/450/2mm)</td><td>Amazonでも注文できます(品番B07BLMJDXD)</td></tr><tr><td>熱収縮チューブ 電線ラップスリーブ 31mm/1.22インチ</td><td>Amazon</td><td>B0848S3S6T</td><td>Amazonでは、さまざまな直径の熱収縮チューブを販売</td></tr>中です。<tr><td>マウスBALB / cByJ</td><td>チャールズ川</td><td>ひずみコード627</td><td></td></tr><tr><td>マウスC57BL / 6</td><td>チャールズ川</td><td>ひずみコード664</td><td></td></tr><tr><td>無毒ラテックス接着剤</td><td>涙液修復</td><td>生地&レザー接着剤</td><td>アマゾンでも入手可能(参照番号B001RQCTUU)</td></tr><tr><td>パンチツール ハンドアートツール</td><td>アマゾン</td><td></td><td>B07QPWNGBF アマゾンによって革作業ツールとして販売 1-25mmラウンドスチールレザークラフトカッター ベルトストラップ</td></tr><tr><td>用で働く PVCバインディングカバー 透明な</td><td>アマゾン</td><td>B078BNLSNP</td><td>0.150 mmから0.180 mmの間のダニの透明なPVCシートが適しています</td></tr><tr><td>自己接着パッドスポンジダブルコーティングフォームテープ</td><td>アマゾン</td><td>B07RHDZ35J</td><td>2ロール両面フォームテープ、超強力ホワイト取り付けテープフォーム</td></tr><tr><td>透明シールステッカー(直径20 mmの円)</td><td></td><td></td>としてアマゾンで販売されていますB01DAA6X66 <td></td></tr></tbody></table>

実験室マウスにおける未熟なハードティックステージのカプセルベースモデル

A Capsule-Based Model for Immature Hard Tick Stages Infestation on Laboratory Mice

ダニは、発達のすべての段階(卵を除く)で必須の血液供給寄生虫であり、様々な病原体のベクターとして認識されています。ダニ研究におけるマウスモデルの使用は、生物学とダニ宿主と病原体の相互作用を理解するために重要です。ここでは、実験室用マウスの硬いダニの未熟な段階の供給のための非骨作業の技術を実証する。この方法の利点は、そのシンプルさ、短い期間、および実験のさまざまな時点でのティックを監視または収集する機能です。さらに、この技術は、同じマウス上の2つの個々のカプセルの取り付けが可能であり、同じ動物を餌に2つの異なるグループのダニが必要な様々な実験に有益である。非刺激性および柔軟なカプセルは容易にアクセス可能な材料からなされ、実験動物の不快感を最小にする。さらに、安楽死は必要なく、マウスは実験後に完全に回復し、再利用が可能である。

マウスの背中に塗布したEVA-foamカプセルに未熟なハードティックステージを供給するための詳細なステップバイステップ法を提案する(図2)。この面倒でないプロトコルは、正確なティック監視と収集が必要な場合に、さまざまなタイプの実験に適しています。この方法の主な利点は、そのシンプルさ、簡単にアクセスできる費用対効果の高い材料、および短い期間です。また、1匹のマウスに2つのカプセルを取り付け(図2K)を使用して、同じ動物に2つの異なるダニ群を供給することができました。非常に効果的で、速い乾燥、および非刺激性のラテックス接着剤の使用は、カプセルが3分以内にしっかりと取り付けられていることを保証します。また、カプセルは少なくとも1週間装着されたまま(図2J)は、未熟なハードティック種21、22、23、24,22,<sup clas...

本研究では、実験用マウスに付着したカプセルを用いて、硬ダニのニンファルおよび幼虫段階の給餌システムを開発した。供給カプセルは、柔軟な材料から作られ、少なくとも1週間はしっかりとマウスに取り付けられたままで、ダニの供給の快適なモニタリングを可能にします。

Ticks are obligatory blood feeding parasites at all stages of development (except eggs) and are recognized as vectors of various pathogens. The use of ...

我々の技術は様々な種類の実験に適しているが、私達のマウスモデルはダニを供給するために必要であり、容易な収集および監視のために囲まれた区域でダニを保つために必要である。この単純な方法の利点は、効率、短い期間、および実験のさまざまな時点でのティックを監視または収集する機能です。私たちのシステムは、ダニ生物学、宿主-ベクター病原体相互作用を研究したり、これらの医学的に重要な節足動物の異なる制御尺度を評価するのに適しています。この方法は、未熟なダニの段階が小さく、マウスにそれらを供給するために、数日間マウスにしっかりと取り付けられるように封じられたカプセルを必要とするので、細部に正確さと注意が必要です。2ミリメートルEVAフォーム、接着剤二重粘着性の泡を一緒に貼り付けて開始します。直径20ミリメートルのレザーホールパンチを使用して、泡片から円をカットします。その後、12ミリメートルの穴パンチを使用して内部をカットします。粘着状の二重粘着性の泡から保護紙のストリップを剥がし、20ミリメートル透明なプラスチックサークルを泡に取り付けます。幼虫を授乳する場合は、保護紙を粘着フォームから取り外せず、カプセルを取り付けて直接進んでください。透明なプラスチックに1センチのスリットを作り、その後、実験中に水分蒸発のための少なくとも10の小さな穴を作成するために、内膜ピンを使用してください。マウスが麻酔された後、操作パッド上に置き、連続イオブルラン供給のために鼻コーンを取り付けます。イオブルランのレベルを調整して、呼吸数が毎分80回未満であることを確認します。肩甲骨の後ろから、耳のすぐ後ろの部分までマウスの前部を剃り、カプセル表面よりも大きい剃った領域を作ります。カプセルのEVAフォームサイト全体に非刺激ラテックス接着剤を塗布し、1分間待ちます。マウスの背中にカプセルを置き、特にカプセルの左右に3分間一定の圧力を加えます。カプセルを少し持ち上げて、皮膚への付着を視覚的に確認します。カプセルのしっかりとしたアタッチメントを確保するために、特にカプセルの左右に指でわずか3分間の一定圧力を加えます。アタッチされていない領域が見つかった場合は、へらでさらに接着剤を塗布し、さらに3分間押します。実験中に添付ファイル以外の領域が形成される場合は、同じ方法で修正します。1センチのスリットを介してカプセルに個々のニンフを導入します。カプセルを両面から少し絞って透明なプラスチックを曲げ、カプセルの中にニンフを押します。鉗子を90度回して引き出します。幼虫の侵入の場合は、付属のカプセルから紙のスリップを取り出し、注射器を幼虫と一緒に直接中に置きます。注射器プランジャーを押してダニを堆積させ、プランジャーを皮膚に向かってそっと回して残りの幼虫を取り除きます。幼虫が皮膚に沈着したら、透明なプラスチック円を取り付けることでカプセルを閉じます。保護プラスチックバンドの3.5ミリメートルストリップをカットし、カプセルの周りに保護プラスチックバンドを適用し、ケージにマウスを返します。ダニを収集するには、メスでプラスチックに十字架のカットを作成し、ティックを収集するために鉗子を使用します。必要に応じて、透明プラスチックに粘着プラスチックパッチを貼り付けてカプセルを再閉してください。複数のタイム ポイントでのティックの収集が必要な場合は、同じプラスチック パッチを使用できます。あるいは、マウスを安楽死させ、カチマを回収したり、カプセルを取り外した後に手動で取り外すことができます。マウスの回復を成功させるために、さらに1週間ケージに入れておき、カプセルを自然に取り外します。カプセルがオフになったら、皮膚の異常な反応がないか確認します。刺激がある場合は、任意のエモリエントローションを適用します。このプロトコルはマウスの背に適用されるEVA泡のカプセルの未熟な堅いダニを供給することを可能にする。速い乾燥および非刺激ラテックスの接着剤の使用は、カプセルが3分以内にしっかりと取り付けられ、少なくとも7日間取り付けられたままであることを保証する。2つのカプセルを取り付けると、同じ動物に2つの異なるダニのグループを供給することが可能になります。さらに、実験後のマウスの完全な回復は、動物を再利用し、安楽死を避けることを可能にする。このシステムは、イコデス・リシヌス・ニンフを供給するために正常に使用されています。2種類の異なるマウス株で中程度から高いエングレージェント成功率が達成された。両方の株では、すべてのニンフは4〜5日以内に給餌を終え、大多数は4日目に降板しました。このプロトコルを試みるとき、マウスの皮膚の十分な領域を剃り、実験中に偶発的な剥離を避けるためにカプセルを効果的に取り付けることが重要です。基本的なダニ生物学の研究に加えて、この方法は、ダニからホストまたはホストに病原体の伝達を探索するために使用することができます。さらに、マウスを再利用するオプションは、免疫学的研究や異なるダニ媒介病原体の伝染を調査するのに有益であり得る複数の再出入の可能性を提供する。

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実験室マウスにおける未熟なハードティックステージのカプセルベースモデル

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