ライブセル上の近くの同時レーザー走査共焦点と原子間力顕微鏡(コンポカル)

Conpokalは、プローブを用いた共焦点顕微鏡と原子間力顕微鏡を組み合わせてサンプル表面を突き刺す。両方の技術は個別に有効であるが、Conpokalは機械的特性と共に蛍光の共局在化を促進する。コンポカール技術の主な利点は、近い同時二重顕微鏡です。

共焦点は、AFMプローブの前後に細胞細胞のプロセスを調査し、領域固有の機械的特性を提供します。この技術は、例えば、脳細胞を生理学的条件下で探査して電気インパルスと強制取引を調べることができるように、メカノバイオロジー分野内で影響を与える。分析を開始する前に、目的のデータ収集に適したAFMカンチレバーを選択し、手袋、AFMチップ取り付けステージ、ピンセット、およびチップをガラスブロックに取り付けるための小さなドライバーを使用します。

AFMチップをガラスブロックの中央に慎重に配置します。AFMチップのカンチレバーと非常に小さな部分は、ガラスブロックの可視、非不透明な部分にあるべきです。スクリュードライバーを使用して、チップがガラスブロックにぴったりとぴったりとなるまでネジを締め、レンズを使用してチップの向きが正しいことを確認します。

チップが正しく向きが付いている場合は、適切な方向にガラスブロックをAFMヘッドに入れ、ガラスブロックを所定の位置にロックします。明視野顕微鏡でキャリブレーション皿の底部を見つけ、AFMシステムZステッパーモーターコントロールパネルを使用して、AFM片持ち2000ミクロンをサンプルの上に移動させます。明視野照明とZステッパーモーターコントロールパネルを使用して、AFMチップをペトリ皿に衝突させないように、100〜200ミクロンのステップでAFMチップをガラス皿の底までゆっくりと下げます。

X Y を制御する手動マイクロメータを、計器プラットフォーム上の AFM ヘッドの平易な動きで見つけます。AFM片持ち体からの影が暗くなり、形状が鋭くなるにつれて、手動マイクロメートルを使用してAFMヘッドを修正し、視野内のAFM片持ち器の位置を調整します。この時点で、ルックアップ テーブルを調整する必要があります。

AFM チップが皿の底に近づいていることを示す顕微鏡ソフトウェア ビューに影が表示されることを確認します。小さなステップを使用して、先端がほとんど焦点が合うまで AFM チップを下げます。レーザーが位置にある場合は、レーザーアライメントダイヤルを使用して、AFMチップがカンチレバーにある裏側にレーザーを配置します。

レーザーアライメントパネルには、0ボルトより大きい合計信号が表示されます。AFM先端に残っている間に最大合計信号が達成されるまで、AFM片持ちの全方向の小さな距離のレーザーを移動します。レーザー位置を設定したら、手動で制御されたたわみダイアルを使用して、垂直および横方向の偏向をゼロにします。

ターゲットが中央に配置され、レーザー位置合わせパネルで垂直または横方向のたわみが観測されないように、垂直および横方向の偏向ノブを使用して検出器を整列します。「キャリブレーション」ウィンドウを開き、実験固有の情報をすべて入力します。レーザー光フィルターを交換してください。

キャリブレーションを行う前に、コンフォーカル顕微鏡の光源をオフにしてAFMエンクロージャを閉じて、室内の光や振動から発生する潜在的なノイズを抑えます。キャリブレーションボタンを押すと、システムが自動的にチップを調整できるようになります。キャリブレーションが完了すると、カンチレバーの剛性と感度がキャリブレーションパネルに表示されます。

次に、自動アプローチ コマンド ボタンを使用して、サンプル 皿の下部に先端を下げ、スキン領域のサイズ、解像度、設定ポイント、Z の長さ、およびピクセル時間を設定してから、再生ボタンを押してスキャンを開始します。顕微鏡ソフトウェアでの共焦点顕微鏡イメージングの場合、共焦点能力を有効にし、サンプルの染色に使用した色素に適したレーザーラインを選択します。1 つまたは複数のレーザーラインを選択して、サンプル内のフィーチャを励起してイメージし、サンプルの蛍光を最適化する値に設定しますが、ノイズの量を制限します。

ダイナミックレンジを最大化しながら飽和ピクセルを避けるためにレーザーパワーを調整し、ピンホールサイズを1つのエリア単位に設定して、光断面の解像度を最大化します。必要に応じて、サンプルの明るさに基づいて値を調整します。ピクセルのドウェル時間を設定するには、約 2 マイクロ秒のドウェル時間から始め、必要に応じてサンプルの明るさを反映するように調整します。

選択した目的のピクセル サイズを選択するには、ナイキスト オプション ボタンと選択したピクセル数を使用して、インストゥルメントにピクセル サイズを計算させます。次に、[スキャン] オプションを選択して、データ収集を開始します。フォーカスノブを使用して、サンプルフィーチャを表す焦点面を最も鮮明な形式で見つけ、データ収集を開始する[スキャン]ボタン、および[キャプチャ]ボタンを使用して2次元画像をキャプチャします。

[ナイキスト]オプションを使用してピクセルサイズをコントロールするパネルを使用して、スキャンの領域サイズを小さくして、単一のセルのみをエンベロープします。収集ツールをアクティブにし、サンプル内のフィーチャを最も明確に照らすレーザー ラインのみを使用して、平面間の推奨間隔を使用して、測定するボリュームの開始平面と終了平面を設定します。ファイルに名前を付け、関連付けられたフォルダに保存します。

または、サンプルの厚さに関する我々の事前知識が存在する場合は、ボリュームを定義するために焦点を調整して最も明るく、鋭い、中間面を選択し、中央平面の上にサンプルの厚さを持たるように上を設定し、下面は中央平面の下の厚さを持って、適切なステップサイズを選択します。[今すぐ実行]ボタンを押して取得を実行します。取得が完了したら、ファイルを適切なフォルダに保存します。

実験の最後に、ガラスブロックを取り外しながら手袋を着用し、取り付けステーションに配置します。ゴムグリップ付きのピンセットを使用してAFMチップを慎重に取り外し、使用されたチップを使用されたことを示すアクセス方向の収納ボックスの場所に戻します。今後の参考のために、実験で使用されたチップをメモしておきます。

ここでは、生きたHEKセルに対する代表的なAFMスキャンが示されている。この特定のHEKセルの高さは、ラインスキャンによって示されるように約10ミクロンであった。ここでは、不適切なAFMチップ選択によるスキャン不良の例が観察できる。

この画像では、AFM PAゾーンが大きなセルの高さのために範囲外であることを示すセルの頂点に黒いピクセルが現れました。AFMカンチレバーの端は、チップオフセットと、セルの高さに比べてチップの高さが不十分なため、画像にも表示されます。AFM画像におけるこれらのアーティファクトは、セルを画像化するために別のAFMチップが選択されるべきであることを示す。

3色共焦点イメージングが行えます。例えば、細胞核、微小細管、および親油性膜を可視化する。先端の凹みの分析は、ナノメカニカルモデルと組み合わせて、表面の弾性率マップの生成を可能にする。

ここで、レーザー共焦点Zスタックの対応する3D投影が示されている。AFMスキャンおよび測定されたモジュラスマップは、レンサ球菌変異体細菌のこれらの代表的な分析で観察されるように、微生物のために取得することができます。実証されているように、従来の共焦点顕微鏡よりもAFMを用いて、このスケールでより良い解像度を達成することができます。

接着力マッピングは、分子相互作用を可視化するためにコンポカルを介して行われる技術です。例えば、結合性運動を観察する細胞表面分子の変調を研究する。コンポカルは、医学微生物学における構造機能関係を探求するための新しい経路を導く。

例えば、物理的および化学的事象およびペプチドグリカン層は、抗生物質耐性に連結することができる。