Name: ライブセル上の近くの同時レーザー走査共焦点と原子間力顕微鏡(コンポカル) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶConpokal法で共焦点顕微鏡と原子間力顕微鏡を統合し、生細胞の蛍光イメージングと力学的特性評価を同時に行う方法。メカノバイオロジー研究において細胞の構造と機能の関係を解明する強力なツールとなる。

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我々は、番号P20GM130456の下でNIH COBREの資金調達を認める。我々は、研究担当副社長が支援する英国の光顕微鏡コアに、この研究に対する支援に感謝する。S.ミュータンとE.フェカリスの株はナタリア・コロトコワ博士によって提供されました。共焦点顕微鏡と原子間力顕微鏡の組み合わせを説明するプレイ・オン・ワードの最初の言及は、ケンタッキー大学のブラッド・ベロン博士(化学・材料工学)に起因し、2017年にケンタッキー州のケンタッキー大学で化学材料工学の教員に加わったセミナースピーカーのジョナサン・ファム博士(対応著者)と話し合いました。

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

マイクロスケールまたはナノスケールの機械的評価ツールは、単一細胞または微生物レベルの変形特性を明らかにするためにしばしば採用され、細胞内プロセスおよび構造特徴を可視化するために別々の高解像度顕微鏡ツールが採用されています。コンポカルは、レーザースキャン共焦点顕微鏡と原子間力顕微鏡(AFM)を単一の器械プラットフォームに組み合わせたものです。コンポカール技術は、最初に非生物学的ポリマーシステムで実施され、そこで目標は軟質表面に接触する硬質表面の接着、弾力性、および表面張力を決定することであった。共焦点画像は、ポリマーがハードプローブ1,2からどのように変形し、接着し、放出するかを視覚的にレンダリングする。ポリマーから生物学的サンプルまで、この技術は、ほぼ同時生細胞または微生物共焦点イメージングおよびAFMの機会を提供する。
細胞の弾力性の変化は、多くのヒト疾患の病因に関与している3 血管障害を含む4マラリア5,6、鎌状赤血球貧血7関節 炎8喘息9、および癌6,10,11,12,13,14,15.細胞の力学を測定するための一般的な技術は、磁気ビーズの使用を含みます16,17、光ピンセット18,19、マイクロピペット吸引8,20,21,22、および AFM11,23,24,25,26.AFMを生細胞に適用して以来、細胞の地形を特徴付けるために容易に適応された27,28 機械的特性と同様11,24,29,30,31 ナノスケールの精度で。AFMはマイクロレロジーに適応されています32,33、周波数変調34,35、クリープ25,36,37 様々な細胞株の粘弾性特性を研究する実験を行う。適切なナノコンタクトモデルの使用は、AFM生成力のインデンテーション測定からの定量的弾性値の抽出に重要である1,2.細胞弾性に対する細胞骨格系薬物の影響を調べるAFM研究は、弾性率が高い影響を受けることを示している38.弾性率の測定に基づいて、多くの研究者は、癌細胞が非形質の細胞よりも柔らかいことを示しています11,38,39.変形性の増加は、癌細胞が組織を転移し浸透させる能力において顕著な役割を果たす可能性が高い40.このような行動は細胞の細胞骨格組織における修飾によって調節される38,41,42.癌に加えて、機械的依存性疾患の別のクラスは呼吸器疾患である。例えば、急性呼吸ストレス症候群は、毎年ますます多くの人間に影響を与えます。患者が機械的換気を行い、高濃度の酸素を持つ場合、その状態が悪化することが示されている43.AFMを用いて肺胞上皮マクロファージを観察する一連の研究では、酸素が豊富な環境を加えて、アクチン形成による細胞の剛性が増加することを発見した。AFMが、細胞レベルの呼吸機能に対する大気環境への影響を詳細に理解し、最終的には人間の治癒と健康に与える影響の典型的な例44,45,46.創傷に向かう移行中の上皮細胞の剛性もAFMを介して評価することができ、弾性率の変動は将来の細胞広がりを知らせるために起こること47,48.したがって、病気の細胞が健康細胞とどのように異なり、相互作用するかを理解するために、細胞力学を定量的に測定する現実的な必要性があります。
AFMは、接着特性や表面構造の研究にも使用されます。原子間力顕微鏡には、接触力学を用いてサンプルに関する情報を収集するための様々なモードがあります。生きた生物サンプルの主な目的の2つは、定量的機械的特性値(例えば、弾性率、接着力)と、マップ面の高さを得ることです。これらのモードには、タッピングモード(断続的接触とも呼ばれる)が含まれ、試料表面と接触モードとを間欠的に接触させる一定の片持ち振幅を維持し、カンチレバーを上げたり下げたりして一定の偏向を維持する49。AFMシステム上のフォースマッピングを使用して、接着マップを収集することができます。片持ちはサンプルをある程度の力にインデントし、それから引き込まれる。退位に抵抗する力を検出器で測定し、力変位グラフを生成する。接着力は、引き込み時に測定される最大力です。表面形態はマイクロまたはナノレベルのサンプルの詳細なビューを提供する。片持ちは、各ピクセルでカンチレバーの動きによって捕捉されたインデントと偏向に基づいてサンプル全体のラスタースキャンを完了し、マイクロサイズとナノサイズの特徴を明らかにする。AFMを用いると、ペプチドグリカン構造50などの小さな特徴の大きさ、ポリマー鎖アライメント51、フラメラ52、ラメリポディア53、及びフィリポディア54が測定できる。AFMのパワーは力変位曲線と非光学的トポロジカル画像にありますが、共焦点顕微鏡は蛍光標識されたサンプルの詳細なイメージングを提供します。
共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)は、生細胞、固定細胞、および組織55、56、57をイメージングするための支配的な技術である。CLSMは、1955年から生物学的イメージングに採用されており、創業以来58,59年に入り込んできました。共焦点顕微鏡の動作原理(すなわち、ピンホールを通した焦点外光の拒絶)はほぼ同じままであるが、技術的な実装は非常に多様な56、57、58、60となっている。共焦点イメージングは、マルチポイント走査を介して、回転ディスクシステム61のように、単一のレーザー光の点走査、ライン走査62のように、または多要素検出器57を介して、その後のピクセル再割り当てで点広がり関数を撮像することができる。共焦点イメージングの有用性を拡大する最近の進歩には、レーザースキャン機能、高速共鳴スキャン、および高感度検出器63、64、65が含まれる。すべての共焦点システムが広視野顕微鏡に対して持っている利点は、特に厚いサンプルで、より詳細なz軸で光学断面を行う能力です。カメラベースの検出を用いたワイドフィールド顕微鏡は、焦点面から放出される光を収集し、同時に照明経路の至る所から放出される光を収集します。ピンホールを閉じることで、信号を低減する費用で、軸方向と横方向の両方の分解能を66に増加させることができる。CLSMでは、励起レーザーがx-y視野を横切ってスキャンされるため、画像は発光信号収集を通じてピクセル単位で構築されます。サンプルの z 軸に沿った複数の x-y 平面のコレクションを使用して、サンプル57,67の 3 次元アーキテクチャを再構築できます。共焦点顕微鏡は、蛍光タンパク質の導入と併せて、細胞生物学68の理解に革命を起こしました。例えば、神経科学69に欠かせないツールとなっている。CLSMは、クリアされた組織を観察し、免疫染色された脳および神経ネットワークアーキテクチャ70の包括的な画像を得るために定期的に使用される。このアプリケーションは、脳内のニューロンとグリア細胞間のシナプス接触とコミュニケーションに新たな洞察をもたらしました71.脳細胞から小胞まで、蛍光染色プロトコルは、治療技術72,73の進歩のための共焦点顕微鏡による細胞機能の検査および捕捉をサポートする。
これらは個別に印象的で多用途なツールですが、共焦点と原子間力顕微鏡(Conpokal)の組み合わせは、研究者が様々な細胞小器官およびそれぞれのダイナミクスの観察と地形およびマイクロ機械的細胞/組織特性をユニークに相関させることができます。ペアドインストルメンテーションを使用すると、ユーザーは本質的に、調査中の内容を「見る」ことができます。1つのテクニックよりも大きな利点があります。Conpokal を使用すると、AFM を介したフォース マッピングが共焦点画像上に重ね合わされ、例えば、細胞の剛性、接着性、または形態をサンプル内の細胞骨格構造に関連付けます。Conpokal法の全体的な目標は、研究者が単一のプラットフォームで画像と物質特性データの両方を提供し、簡潔で効果的な方法で生きたサンプルを研究するためのプラットフォームを提供することです。この研究では、サンプルの適切な選択と準備、計器のセットアップ、片持ち器のキャリブレーションを含むConpokalの動作を実証し、トラブルシューティングを成功させるためのガイドラインを提供します。プロトコルの後、同じ細胞共焦点およびAFMを通じて、成功した細菌および細胞AFM高さマッピング、細菌および細胞AFM率マッピング、および多重標識細胞の共焦点イメージングを含む代表的な結果を提供する。最後に、Conpokalの手順の重要なステップ、トラブルシューティングの推奨事項、技術の制限、意義、および将来の方法の見通しについて説明します。

<table><tbody><tr><td>音響エンクロージャ</td><td>JPK-Bruker</td><td>音響エンクロージャ</td><td>チャンバーは、ノイズを軽減するために使用されます</td></tr><tr><td>BioTracker 488 緑の微小管 細胞骨格染料</td><td>ミリポア シグマ</td><td>SCT142</td><td>哺乳類細胞の微小管の標識に使用</td></tr><tr><td>CP-qp-CONT-BSG AFMのヒント</td><td>NanoAndMore</td><td>CP-qp-CONT-BSG-B</td><td>生物学的サンプル</td></tr><tr><td>の弾性率測定に適したジルステイン(1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩('DiI';DiIC18(3)))</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>D282</td><td>哺乳類細胞の原形質膜の標識に使用</td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグル培地</td><td>VWR</td><td>VWRL0100-0500</td><td>細胞培養培地の成分</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック A1285601</td><td></td><td>生物学的環境のシミュレーションに使用</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>45000-736</td><td>細胞培養培地の成分</td></tr><tr><td>フィッシャー・バイオ試薬 微生物学培地 添加物酵母エキス</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP1422-500</td><td>細菌培養培地の成分</td></tr><tr><td>フルオロディッシュ 細胞培養ディッシュ</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ (WPI)</td><td>FD35-100</td><td>側壁が10mm未満のガラス底ディッシュで、Nanowizard 4a AFM</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 核酸の全機能に必要です。</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>62249</td>を染色する <td>哺乳類細胞の核を標識するために使用される、生細胞のための良い核マーカー</td></tr><tr><td>ヒト胚性腎臓 293細胞</td><td>ATCCグローバルバイオリソースセンター</td><td>CRL-1573</td><td>プロトコルで使用される哺乳類細胞</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>VWR</td><td>47743-716</td><td>細胞培養皿のコーティング</td></tr><tr><td>モデル:PFQNM-LC-A-CAL AFM ヒント</td><td>ブルカー</td><td>PFQNM-LC-A-CAL</td><td>高さの大きいサンプル(真核細胞など)に適したAFMヒントNanoWizard</td></tr> <tr><td>4a</td><td>JPK-Bruker</td><td>NanoWizard 4a</td><td>AFM</td></tr><tr><td>Nikon A1 レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>A1 HD25</td><td>明視野、落射蛍光、共焦点イメージングに使用される顕微鏡</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>VWR</td><td>16777-164</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>の成分PetriDishHeater</td><td>JPK-Bruker</td><td>PetriDishHeater</td><td>希望のペトリ皿サンプル温度を維持</td></tr><tr><td>qp-BioAC-Cl AFMチップ</td><td>ナノセンサー</td><td>qp-BioAC-Cl-10</td><td>剛性の異なる3種類のAFMカンチレバー</td></tr><tr><td>交換可能なカーボンファイバーチップピンセット</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>5051</td><td>繊細なAFMチップをガラス取り付けブロックに慎重に配置および取り外すために使用されます</td></tr><tr><td>トッドヒューイットブロス バクト</td><td>BD DIFCO Bacterius Ltd</td><td>Bacto-249240</td><td>細菌培養培地</td></tr><tr><td>の成分 バンコマイシン、BODIPY FL コンジュゲート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>V34850</td><td>細菌の細胞壁を蛍光標識するために使用されます</td></tr></tbody></table>

ライブセル上の近くの同時レーザー走査共焦点と原子間力顕微鏡(コンポカル)

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

マイクロスケールおよびナノスケールの機械的特徴付けに利用できる技術は、過去数十年で爆発的に増加しました。走査型透過型電子顕微鏡のさらなる発展から、原子間力顕微鏡の発明、蛍光イメージングの進歩、小材料の研究を可能にする技術が大きく向上しています。コンポカルは、共焦点顕微鏡と原子間力顕微鏡(AFM)を組み合わせたポートマントーで、プローブが表面を「突く」。各技術は、単独で定性的および/または定量的な画像収集に非常に効果的であるが、Conpokalは、ブレンドされた蛍光イメージングと機械的特性を使用してテストする機能を提供します。近くの同時共焦点のイメージ投射および原子間力の調査のために設計されていて、Conpokalは生きている微生物学的サンプルの実験を促進する。ペア計測から追加された洞察は、AFMによる測定された機械的特性(例えば、弾性率、接着性、表面粗さ)を細胞内成分または共焦点顕微鏡で観察可能な活動と共に局在化します。この研究は、レーザー走査共焦点と原子間力顕微鏡の動作のためのステップバイステッププロトコルを提供し、同時に、同じ細胞、同じ領域、共焦点イメージング、および機械的特性を達成する。

コンポカル手法は 図 1A で概略的に表現され、セットアップのイメージを 図 1Bに示します。AFMの同じ構造を用いた共焦点顕微鏡を介して生物学的構造を正確に併発させるためには、設置時の2つのシステムのアライメントが重要です。互いの空間要件に精通している評判の良いコンフォーカルおよびAFMメーカーを選択します。さらに、この技術の成功した実装は、良好な染色手順、生物学的構造の固定化、およびAFM先端の適切な選択に依存しています。生細胞の高さは、多くの場合、AFMイメージングのための課題を提示します。生きている HEK セルの AFM スキャンを 図 2Aに示します。この特定のHEKセルの高さは約10μmで、ラインスキャンを緑色で示した(図2B)。オフセットがゼロ(チップは片持ちの端)または先端の高さがセルの高さより大きい(例えば、先端の高 ≥さ10μm)のAFM先端は、個々の細胞の高度に分解された画像を生成します。AFMチップの選択が不適切なためのスキャンが不十分な例が 図2Cに含まれています。この画像では、AFMピエゾが大きなセルの高さのために範囲外であることを示すセルの頂点に黒いピクセルが現れました。AFM片持ち体の端部は、セルの高さと比較してチップの高さが不十分と組み合わされた先端オフセットのために画像(丸い正方形)に現れました。AFM 画像内のこれらのアーティファクトは、セルを画像化するために異なる AFM ヒントを選択する必要があることを示します。
この方法では、生細胞イメージングのための正しいプローブと共に蛍光染色における効率的な標識が必要です。 図3A に示す3色の共焦点像を、核染色(蛍光青)、微小管染色(蛍光緑)、脂溶性膜染色(蛍光赤色)で行った。これらのライブセルプローブは、スペクトルの重複が限られており、標準フィルタキューブとの互換性があるために選択されました。 また、図3Bには明視野光学画像も含まれています。
AFMから、ナノメカニカルモデルと共に先端の凹みを解析し、表面の弾性率マップを生成する。先端形状に対してヘルツモデルの適合度と放物線プロファイル(半径8nm)を用いて構築されたモジュラスマップの例は 、図4A のセル形状の3D再構成に重ね合わせて示されている( これは図3に示されている2つのセルと同じである)。レーザー共焦点zスタックの対応する3D投影を 図4Bに示します。
この方法は、光顕微鏡を使用して解決することが困難なマイクロおよびナノスコピック特徴を有する単一細菌を含む、より小さな生物学的構造にも適している。現在の研究では、コンポカル技術を用いて、 レンサ球菌ミュータンs.74 細胞壁成分の操作が形態および抗生物質耐性の変化をもたらした抗生物質耐性に影響を与える細胞壁内の機械的メカニズムを探求する。Conpokalは、同じ細胞サンプル上で生きた、インソリューション、データ収集(例えば、表面形態、弾性率、接着強度、表面粗さ)を容易にし、細胞壁成分の有無と機械的特性を結合する。 図5A,B は 、ストレプトコッカス・ミュータンス 菌のAFMスキャンおよび測定されたモジュラスマップを含む。従来の共焦点顕微鏡よりもAFMを用いたこの尺度での解像度の向上が達成されました。
図6 は、細胞壁に付着する緑色の蛍光細胞構造染色で染色された エンテロコッカス・フェカリス のコロニーの共焦点像を含む。 図5 および 図6 は、真核細胞に加えて、コンポカル法の微生物への適用性を示す。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig01.jpg"> 図1:コンポカルのセットアップ。 (A) コンポカル技術の概略図。(B)機器のセットアップのイメージ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig02.jpg"> 図2 生細胞の原子間力顕微鏡 (A) 2つのHEK細胞のAFM画像。(B)セルの高さが10μmでかなり大きいであることを示すHEKセルの高さプロファイル(Aの緑色の線)。(C)AFMピエゾが細胞の頂点で範囲を外れ、カンチレバー末端の逆イメージングの証拠があるアストロサイト細胞の貧弱なAFM画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig03.jpg"> 図3:生細胞の共焦点顕微鏡と明視野顕微鏡 (A)核染色(蛍光ブルー)、微小管染色(蛍光緑)及び親油性膜染色(蛍光赤)で染色された生きたHEK細胞のレーザー走査共焦点顕微鏡。(B)対応する明視野光学画像。スケールバーは10 μmです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig04.jpg"> 図4:生きたHEK細胞のAFMと共焦点顕微鏡の3Dレンダリングの比較 (A) AFM からセルの 3D 再構成に重ね合わされた先端形状のヘルツモデルフィットと放物線プロファイル(半径 8 nm)を使用して構築されたモジュラス マップ。(B)核染色(蛍光ブルー)、微小管染色(蛍光緑)及び親油性膜染色(蛍光赤色)を有するレーザー共焦点zスタックの対応する3D突起。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig05.jpg"> 図5:細菌サンプルのAFM。 (A ) AFM スキャンおよび (B)レンサ球菌ミュータンス菌のモジュラスマップを測定した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig06.jpg"> 図6:細菌サンプルの共焦点顕微鏡 緑色の蛍光膜染色を伴う エンテロコッカス・フェカリス のコロニーの共焦点像。スケールバーは5μmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここで提示されるConpokal技術のプロトコルは、共焦点と原子間力顕微鏡を単一の器械のプラットホームに結合する。コンポカルは、同じ細胞、同じ領域、近くの同時共焦点イメージングおよび生きた生物学的サンプルの機械的特性を提供する。

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Conpokalは、プローブを用いた共焦点顕微鏡と原子間力顕微鏡を組み合わせてサンプル表面を突き刺す。両方の技術は個別に有効であるが、Conpokalは機械的特性と共に蛍光の共局在化を促進する。コンポカール技術の主な利点は、近い同時二重顕微鏡です。共焦点は、AFMプローブの前後に細胞細胞のプロセスを調査し、領域固有の機械的特性を提供します。この技術は、例えば、脳細胞を生理学的条件下で探査して電気インパルスと強制取引を調べることができるように、メカノバイオロジー分野内で影響を与える。分析を開始する前に、目的のデータ収集に適したAFMカンチレバーを選択し、手袋、AFMチップ取り付けステージ、ピンセット、およびチップをガラスブロックに取り付けるための小さなドライバーを使用します。AFMチップをガラスブロックの中央に慎重に配置します。AFMチップのカンチレバーと非常に小さな部分は、ガラスブロックの可視、非不透明な部分にあるべきです。スクリュードライバーを使用して、チップがガラスブロックにぴったりとぴったりとなるまでネジを締め、レンズを使用してチップの向きが正しいことを確認します。チップが正しく向きが付いている場合は、適切な方向にガラスブロックをAFMヘッドに入れ、ガラスブロックを所定の位置にロックします。明視野顕微鏡でキャリブレーション皿の底部を見つけ、AFMシステムZステッパーモーターコントロールパネルを使用して、AFM片持ち2000ミクロンをサンプルの上に移動させます。明視野照明とZステッパーモーターコントロールパネルを使用して、AFMチップをペトリ皿に衝突させないように、100〜200ミクロンのステップでAFMチップをガラス皿の底までゆっくりと下げます。X Y を制御する手動マイクロメータを、計器プラットフォーム上の AFM ヘッドの平易な動きで見つけます。AFM片持ち体からの影が暗くなり、形状が鋭くなるにつれて、手動マイクロメートルを使用してAFMヘッドを修正し、視野内のAFM片持ち器の位置を調整します。この時点で、ルックアップ テーブルを調整する必要があります。AFM チップが皿の底に近づいていることを示す顕微鏡ソフトウェア ビューに影が表示されることを確認します。小さなステップを使用して、先端がほとんど焦点が合うまで AFM チップを下げます。レーザーが位置にある場合は、レーザーアライメントダイヤルを使用して、AFMチップがカンチレバーにある裏側にレーザーを配置します。レーザーアライメントパネルには、0ボルトより大きい合計信号が表示されます。AFM先端に残っている間に最大合計信号が達成されるまで、AFM片持ちの全方向の小さな距離のレーザーを移動します。レーザー位置を設定したら、手動で制御されたたわみダイアルを使用して、垂直および横方向の偏向をゼロにします。ターゲットが中央に配置され、レーザー位置合わせパネルで垂直または横方向のたわみが観測されないように、垂直および横方向の偏向ノブを使用して検出器を整列します。「キャリブレーション」ウィンドウを開き、実験固有の情報をすべて入力します。レーザー光フィルターを交換してください。キャリブレーションを行う前に、コンフォーカル顕微鏡の光源をオフにしてAFMエンクロージャを閉じて、室内の光や振動から発生する潜在的なノイズを抑えます。キャリブレーションボタンを押すと、システムが自動的にチップを調整できるようになります。キャリブレーションが完了すると、カンチレバーの剛性と感度がキャリブレーションパネルに表示されます。次に、自動アプローチ コマンド ボタンを使用して、サンプル 皿の下部に先端を下げ、スキン領域のサイズ、解像度、設定ポイント、Z の長さ、およびピクセル時間を設定してから、再生ボタンを押してスキャンを開始します。顕微鏡ソフトウェアでの共焦点顕微鏡イメージングの場合、共焦点能力を有効にし、サンプルの染色に使用した色素に適したレーザーラインを選択します。1 つまたは複数のレーザーラインを選択して、サンプル内のフィーチャを励起してイメージし、サンプルの蛍光を最適化する値に設定しますが、ノイズの量を制限します。ダイナミックレンジを最大化しながら飽和ピクセルを避けるためにレーザーパワーを調整し、ピンホールサイズを1つのエリア単位に設定して、光断面の解像度を最大化します。必要に応じて、サンプルの明るさに基づいて値を調整します。ピクセルのドウェル時間を設定するには、約 2 マイクロ秒のドウェル時間から始め、必要に応じてサンプルの明るさを反映するように調整します。選択した目的のピクセル サイズを選択するには、ナイキスト オプション ボタンと選択したピクセル数を使用して、インストゥルメントにピクセル サイズを計算させます。次に、[スキャン] オプションを選択して、データ収集を開始します。フォーカスノブを使用して、サンプルフィーチャを表す焦点面を最も鮮明な形式で見つけ、データ収集を開始する[スキャン]ボタン、および[キャプチャ]ボタンを使用して2次元画像をキャプチャします。[ナイキスト]オプションを使用してピクセルサイズをコントロールするパネルを使用して、スキャンの領域サイズを小さくして、単一のセルのみをエンベロープします。収集ツールをアクティブにし、サンプル内のフィーチャを最も明確に照らすレーザー ラインのみを使用して、平面間の推奨間隔を使用して、測定するボリュームの開始平面と終了平面を設定します。ファイルに名前を付け、関連付けられたフォルダに保存します。または、サンプルの厚さに関する我々の事前知識が存在する場合は、ボリュームを定義するために焦点を調整して最も明るく、鋭い、中間面を選択し、中央平面の上にサンプルの厚さを持たるように上を設定し、下面は中央平面の下の厚さを持って、適切なステップサイズを選択します。[今すぐ実行]ボタンを押して取得を実行します。取得が完了したら、ファイルを適切なフォルダに保存します。実験の最後に、ガラスブロックを取り外しながら手袋を着用し、取り付けステーションに配置します。ゴムグリップ付きのピンセットを使用してAFMチップを慎重に取り外し、使用されたチップを使用されたことを示すアクセス方向の収納ボックスの場所に戻します。今後の参考のために、実験で使用されたチップをメモしておきます。ここでは、生きたHEKセルに対する代表的なAFMスキャンが示されている。この特定のHEKセルの高さは、ラインスキャンによって示されるように約10ミクロンであった。ここでは、不適切なAFMチップ選択によるスキャン不良の例が観察できる。この画像では、AFM PAゾーンが大きなセルの高さのために範囲外であることを示すセルの頂点に黒いピクセルが現れました。AFMカンチレバーの端は、チップオフセットと、セルの高さに比べてチップの高さが不十分なため、画像にも表示されます。AFM画像におけるこれらのアーティファクトは、セルを画像化するために別のAFMチップが選択されるべきであることを示す。3色共焦点イメージングが行えます。例えば、細胞核、微小細管、および親油性膜を可視化する。先端の凹みの分析は、ナノメカニカルモデルと組み合わせて、表面の弾性率マップの生成を可能にする。ここで、レーザー共焦点Zスタックの対応する3D投影が示されている。AFMスキャンおよび測定されたモジュラスマップは、レンサ球菌変異体細菌のこれらの代表的な分析で観察されるように、微生物のために取得することができます。実証されているように、従来の共焦点顕微鏡よりもAFMを用いて、このスケールでより良い解像度を達成することができます。接着力マッピングは、分子相互作用を可視化するためにコンポカルを介して行われる技術です。例えば、結合性運動を観察する細胞表面分子の変調を研究する。コンポカルは、医学微生物学における構造機能関係を探求するための新しい経路を導く。例えば、物理的および化学的事象およびペプチドグリカン層は、抗生物質耐性に連結することができる。

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Research

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Bioengineering

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&gt;jove_content&lt;細胞小器官や他の細胞内構造の動的挙動をin...

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

ここでは、光学トラップによる直接力測定を用いて、3次元閉じ込めで単離した胚ゼブラフィッシュ細胞の細胞内の機械的特性を調べるプロトコルを提示する。...

光ピンセットを用いた閉じ込めにおける細胞下力学の直接力測定

プロトコルは、切断された神経を通してマウス運動神経終末に蛍光カルシウム色素をロードする方法を説明しています。さらに、共焦点顕微鏡を使用して末梢神経終末の高速カルシウム過渡現象を記録するためのユニークな方法が提示されます。...

共焦点顕微鏡を用いたマウス神経筋接合部におけるカルシウム過渡現象の高時間分解能による登録

このプロトコルは、高解像度のセルラーおよびサブセルラー画像診断のための、多重アレイ検出器と統合されたレーザー走査共焦点顕微鏡システムの高度なイメージングアプリケーションおよび共有リソース管理について詳述しています。このワークフローにより、共焦点から超分解能(~120nm)までのマルチモーダルイメージングが単一のプラットフォーム内で可能となり、ナノスケールの可視化をより容易にします。...

超分解能イメージングと共有管理:多重検出を伴う共焦点顕微鏡のプロトコル

住んでいるグラム陰性およびグラム陽性細菌は、ゼラチンコートしたマイカ上に固定し、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて液体中に撮像することができます。...

原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

学ぶConpokal法で共焦点顕微鏡と原子間力顕微鏡を統合し、生細胞の蛍光イメージングと力学的特性評価を同時に行う方法。メカノバイオロジー研究において細胞の構造と機能の関係を解明する強力なツールとなる。

ライブセル上の近くの同時レーザー走査共焦点と原子間力顕微鏡(コンポカル)

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