フローサイトメトリーによる主要なマウス海馬ニューロンの主要組織適合性複合体クラスIの発現の評価
May 19th, 2020
このプロトコルは、胚性マウス脳から一次海馬ニューロンを培養する方法を説明する。培養ニューロンの細胞外表面上の主要な組織適合性複合体クラスIの発現は、次いでフローサイトメトリック解析によって評価される。
このプロトコルでは、フローサイトメトリーを使用して、マウスから培養した初代ニューロンの細胞外MHCクラス1発現を定量的に評価します。MHC1発現のためのNC2免疫染色は、タンパク質、三次、構造変化、透過化または変性条件によるシグナルの損失を避けるためにも実施できます。MHCクラス1は、感染に対する免疫応答を誘導するだけでなく、ニューロンのシナプス結合を調節します。
しかし、MHCクラス1の発現を調節する因子はまだわかっていません。胚の脳の解剖ステップをマスターするには練習が必要です。技術を学ぶときは、時間やその後の培養プロセスを気にせずに解剖を練習するように注意してください。
胚性海馬を単離するには、最初に採取したマウス胚性脳を立体解剖顕微鏡下に置きます。そして、2組のSterile Dumont Number 5鉗子を使用して、嗅球をつまみ、髄膜を完全に引き離します。髄膜が完全に除去されると、皮質の上側が横方向に開き、海馬が露出します。
鉗子を使用して海馬をつまんで付着した皮質から離し、分離された海馬を氷上の5ミリリットルのHibernate-Eメディウムを含む滅菌15ミリリットルの円錐管に慎重に移します。すべての海馬が1つの15ミリリットルのチューブに集められたら、遠心分離によって脳組織を沈殿させます。上清を胚ごとに調製したばかりのパパイン解離0.5ミリリットルと交換し、反転によってチューブを数回混合します。
組織を摂氏37度に30分間置き、10分ごとに逆転してサンプルを混合してから、遠心分離によって組織を再度収集します。上清を等量の新鮮なHibernate-Eメディウムと交換し、完全に開いたガラスのファイヤーポリッシュパスツールピペットを使用して、ティッシュを10回粉砕します。組織を2分間沈殿させた後、上清を新しい50ミリリットルの円錐管に移します。
同量のHibernate-E Mediumをティッシュに戻し、半開きガラスのファイヤーポリッシュ仕上げパスツールピペットを使用してティッシュを10回粉砕します。組織をさらに2分間沈殿させた後、上清を50ミリリットルのチューブにプールします。等量のHibernate-E Mediumをティッシュに加え、1/4オープンガラスファイヤーポリッシュパスツールピペットでティッシュを10回粉砕します。
組織を2分間沈殿させた後、上清を50ミリリットルのチューブにプールします。遠心分離により、上清中の解離細胞を回収します。そして、ペレットを5ミリリットルのニューロン増殖培地に再懸濁してカウントし、細胞をニューロン増殖培地のミリリットルあたり5倍10〜5番目の生存細胞の最終プレーティング密度に希釈し、12ウェルポリD-リジンコーティングプレートの各ウェルに1ミリリットルの細胞を添加します。
次に、プレートを細胞培養インキュベーターに置き、培地の半分を週に2回、培養の寿命が尽きるまで等量の新鮮な培地と交換します。培養ニューロンがMHC1を発現する能力を評価するには、培養の適切な日に、各ウェル中の0.5ミリリットルの上清を、0.5ミリリットルの新鮮なニューロン増殖培地に交換し、1ミリリットルあたり200ユニットのインターフェロンベータを補充して、細胞培養インキュベーターで6〜72時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終了時に、各ウェルをサプリメントを含まない冷たいNeurobasal Mediumで1回洗浄してから、FCブロック1ミリリットルあたり1マイクログラム、蛍光標識抗MHC1抗体1ミリリットルあたり1マイクログラムを補充した0.5ミリリットルの非サプリメントの冷たいNeurobasal培地を各ウェルに加えます。
摂氏4度で45分間インキュベートした後、光から保護します。冷たいダルベッコPBSで各井戸を1回洗います。次に、各ウェルに0.5ミリリットルの室温酵素フリー細胞解離バッファーを加え、撹拌して細胞を剥離します。
倒立組織培養顕微鏡で解離を確認し、各ウェルに0.5ミリリットルのFACSバッファーを添加します。細胞を粉砕して凝集体を分散させ、各ウェルの全容積を個々の1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移します。遠心分離により細胞を回収し、チューブあたり100マイクロリットルの新鮮なFACS緩衝液にペレットを再懸濁します。
各懸濁液を96ウェルU底プレートの個々のウェルに移し、各ウェルに100マイクロリットルの固定試薬を加えます。細胞の凝集を避けるために数回回転させ、光から保護された室温でプレートを15分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、遠心分離機でウェルの底に細胞を回収し、ウェルあたり200マイクロリットルの新鮮なFACSバッファーにペレットを再懸濁します。
遠心分離後、蛍光標識抗ニューロン核抗体をウェルごとに補充した100マイクロリットルの透過化試薬にペレットを再懸濁します。混合後、プレートを室温で20分間インキュベートし、ロッキングを光から保護します。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞を3回収集し、遠心分離の間にペレットを100マイクロリットルの新鮮なFACS緩衝液に再懸濁します。
最後の洗浄後、細胞をFACS緩衝液中の2%対のホルムアルデヒドの100マイクロリットルに再懸濁し、十分に混合します。ニューロンは、細胞の破片やダブレットを除外するための全イベントの逐次ゲーティングと、それらのニューロン核陽性率によって識別できます。その後、ニューロン核陽性細胞のMHC1陽性性をさらに分析することができます。
このデータから、MHC1染色陽性のニューロンの割合と蛍光強度の中央値を計算でき、例えば、インターフェロンβ治療がMHC1ニューロン発現の割合と強度を有意にアップレギュレートすることが明らかになります。これらの方法は、わずかな変更を加えるだけで、皮質ニューロンなどの他のニューロン集団の培養や、さまざまな細胞マーカー、刺激分子、または遺伝子組み換えのテストに使用できます。
概要
このプロトコルは、胚性マウスの脳から初級海馬ニューロンを培養し、フローサイトメトリーを用いてその表面上の主要組織適合複合体クラスI（MHCクラスI）の発現を評価する方法を概説しています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 免疫学
背景
- MHCクラスIは免疫反応と神経細胞のシナプス接続に役割を果たします。
- ニューロンにおけるMHCクラスIの発現制御は十分に理解されていません。
- 初級ニューロン培養技術には練習が必要です、特に解剖には注意が必要です。
- フローサイトメトリーはMHCクラスIの発現を定量的に分析するために使用されます。
研究目的
- 初級海馬ニューロンを培養する信頼できる方法を確立すること。
- 培養されたニューロン上のMHCクラスIの発現を調査すること。
- インターフェロンベータのMHCクラスIの発現への影響を探ること。
使用された方法
- 海馬を分離するための胚性マウス脳の解剖。
- 細胞分離のためのパパイン解離の使用。
- ニューロン成長培地を用いたニューロンの培養。
- MHCクラスI発現を評価するためのフローサイトメトリー分析。
主要な結果
- インターフェロンベータ処理はニューロンのMHCクラスIの発現を著しく増加させます。
- フローサイトメトリーにより、MHCクラスI陽性と中央値蛍光強度の定量化が可能になります。
- 特定のゲーティング戦略を通じて、ニューロンを特定し、MHCクラスIの発現を分析することができます。
- この方法は他のニューロン集団とマーカーにも適応できます。
結論
- このプロトコルは、初級海馬ニューロンを培養し分析するための体系的なアプローチを提供します。
- ニューロンにおけるMHCクラスIの発現を理解することで、免疫-神経相互作用に関する洞察が得られる可能性があります。
- この方法は、様々なニューロン集団とそれらの異なる刺激への反応を研究するために適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of MHCI expression on primary murine hippocampal neurons by flow cytometry enables precise interrogation of neuro-immune interactions relevant to CNS drug discovery. This workflow supports mechanistic de-risking and target validation for programs investigating immune modulation in neurological contexts. Reliable detection of neuronal MHCI expression informs early-stage portfolio decisions where immune signaling intersects with synaptic function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of MHCI modulation in primary neurons for hypothesis-driven target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying neuronal response to immune stimuli such as interferon beta.
- Facilitates functional assessment of neuro-immune pathways implicated in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, quantitative assay for MHCI expression using flow cytometry.
- Provides standardized gating and marker strategies for reliable neuronal identification and output measurement.
- Prepares validated neuronal systems for downstream compound or genetic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro neuronal MHCI expression data with translational biomarker strategies in neuroimmunology.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement of neuro-immune targets based on quantitative readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a robust platform for testing immune modulation in primary neuronal cultures.
- Discovery Biology: Quantifies MHCI expression changes in response to defined stimuli, supporting pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables calculation of percentage positivity and median fluorescence intensity for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to in vivo or disease-relevant models where immune-neuronal interactions are critical.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for other neuronal populations or protein markers, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuro-immune target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Standardizes neuronal MHCI quantification for reproducibility and cross-study comparability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for neuro-immune programs by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets with immune modulation components.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary neuronal culture and flow cytometry analysis.
- Demands access to cell sorting and quantitative fluorescence instrumentation.
- Necessitates standardized gating and antibody labeling protocols for cross-team reproducibility.
- Adaptable to other neuronal types or markers with protocol modifications.
- Dependent on careful dissection and culture technique to ensure neuronal purity and viability.
