フローサイトメトリーによる主要なマウス海馬ニューロンの主要組織適合性複合体クラスIの発現の評価

このプロトコルでは、フローサイトメトリーを使用して、マウスから培養した初代ニューロンの細胞外MHCクラス1発現を定量的に評価します。MHC1発現のためのNC2免疫染色は、タンパク質、三次、構造変化、透過化または変性条件によるシグナルの損失を避けるためにも実施できます。MHCクラス1は、感染に対する免疫応答を誘導するだけでなく、ニューロンのシナプス結合を調節します。

しかし、MHCクラス1の発現を調節する因子はまだわかっていません。胚の脳の解剖ステップをマスターするには練習が必要です。技術を学ぶときは、時間やその後の培養プロセスを気にせずに解剖を練習するように注意してください。

胚性海馬を単離するには、最初に採取したマウス胚性脳を立体解剖顕微鏡下に置きます。そして、2組のSterile Dumont Number 5鉗子を使用して、嗅球をつまみ、髄膜を完全に引き離します。髄膜が完全に除去されると、皮質の上側が横方向に開き、海馬が露出します。

鉗子を使用して海馬をつまんで付着した皮質から離し、分離された海馬を氷上の5ミリリットルのHibernate-Eメディウムを含む滅菌15ミリリットルの円錐管に慎重に移します。すべての海馬が1つの15ミリリットルのチューブに集められたら、遠心分離によって脳組織を沈殿させます。上清を胚ごとに調製したばかりのパパイン解離0.5ミリリットルと交換し、反転によってチューブを数回混合します。

組織を摂氏37度に30分間置き、10分ごとに逆転してサンプルを混合してから、遠心分離によって組織を再度収集します。上清を等量の新鮮なHibernate-Eメディウムと交換し、完全に開いたガラスのファイヤーポリッシュパスツールピペットを使用して、ティッシュを10回粉砕します。組織を2分間沈殿させた後、上清を新しい50ミリリットルの円錐管に移します。

同量のHibernate-E Mediumをティッシュに戻し、半開きガラスのファイヤーポリッシュ仕上げパスツールピペットを使用してティッシュを10回粉砕します。組織をさらに2分間沈殿させた後、上清を50ミリリットルのチューブにプールします。等量のHibernate-E Mediumをティッシュに加え、1/4オープンガラスファイヤーポリッシュパスツールピペットでティッシュを10回粉砕します。

組織を2分間沈殿させた後、上清を50ミリリットルのチューブにプールします。遠心分離により、上清中の解離細胞を回収します。そして、ペレットを5ミリリットルのニューロン増殖培地に再懸濁してカウントし、細胞をニューロン増殖培地のミリリットルあたり5倍10〜5番目の生存細胞の最終プレーティング密度に希釈し、12ウェルポリD-リジンコーティングプレートの各ウェルに1ミリリットルの細胞を添加します。

次に、プレートを細胞培養インキュベーターに置き、培地の半分を週に2回、培養の寿命が尽きるまで等量の新鮮な培地と交換します。培養ニューロンがMHC1を発現する能力を評価するには、培養の適切な日に、各ウェル中の0.5ミリリットルの上清を、0.5ミリリットルの新鮮なニューロン増殖培地に交換し、1ミリリットルあたり200ユニットのインターフェロンベータを補充して、細胞培養インキュベーターで6〜72時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終了時に、各ウェルをサプリメントを含まない冷たいNeurobasal Mediumで1回洗浄してから、FCブロック1ミリリットルあたり1マイクログラム、蛍光標識抗MHC1抗体1ミリリットルあたり1マイクログラムを補充した0.5ミリリットルの非サプリメントの冷たいNeurobasal培地を各ウェルに加えます。

摂氏4度で45分間インキュベートした後、光から保護します。冷たいダルベッコPBSで各井戸を1回洗います。次に、各ウェルに0.5ミリリットルの室温酵素フリー細胞解離バッファーを加え、撹拌して細胞を剥離します。

倒立組織培養顕微鏡で解離を確認し、各ウェルに0.5ミリリットルのFACSバッファーを添加します。細胞を粉砕して凝集体を分散させ、各ウェルの全容積を個々の1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移します。遠心分離により細胞を回収し、チューブあたり100マイクロリットルの新鮮なFACS緩衝液にペレットを再懸濁します。

各懸濁液を96ウェルU底プレートの個々のウェルに移し、各ウェルに100マイクロリットルの固定試薬を加えます。細胞の凝集を避けるために数回回転させ、光から保護された室温でプレートを15分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、遠心分離機でウェルの底に細胞を回収し、ウェルあたり200マイクロリットルの新鮮なFACSバッファーにペレットを再懸濁します。

遠心分離後、蛍光標識抗ニューロン核抗体をウェルごとに補充した100マイクロリットルの透過化試薬にペレットを再懸濁します。混合後、プレートを室温で20分間インキュベートし、ロッキングを光から保護します。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞を3回収集し、遠心分離の間にペレットを100マイクロリットルの新鮮なFACS緩衝液に再懸濁します。

最後の洗浄後、細胞をFACS緩衝液中の2%対のホルムアルデヒドの100マイクロリットルに再懸濁し、十分に混合します。ニューロンは、細胞の破片やダブレットを除外するための全イベントの逐次ゲーティングと、それらのニューロン核陽性率によって識別できます。その後、ニューロン核陽性細胞のMHC1陽性性をさらに分析することができます。

このデータから、MHC1染色陽性のニューロンの割合と蛍光強度の中央値を計算でき、例えば、インターフェロンβ治療がMHC1ニューロン発現の割合と強度を有意にアップレギュレートすることが明らかになります。これらの方法は、わずかな変更を加えるだけで、皮質ニューロンなどの他のニューロン集団の培養や、さまざまな細胞マーカー、刺激分子、または遺伝子組み換えのテストに使用できます。