Name: 生体内でのトランス脊髄直流刺激時の型同定されたラット脊髄モネニューロンの細胞内記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 学ぶトランス脊髄直流刺激下でのラット脊髄モネニューロンの細胞内記録法。成熟した神経系における膜特性と発火パターンの評価により、神経可塑性と神経リハビリテーションへの応用可能性を解明する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、国立科学センター補助金第2017/25/B/NZ7/00373によって支援されました。著者らは、この論文で提示された結果のデータ収集と分析に貢献したハンナ・ドジマワ・チェリコフスカとヴウォジミミェシュ・ムロフチンスキの研究を認識したいと考えています。

この議定書に関連するすべての手続きは、適切な当局(例えば、地域倫理委員会)によって受け入れられ、動物の福祉と管理に関する国内および国際的な規則に従っています。
注:手順に関与する各参加者は、基本的な外科的処置で適切に訓練され、動物実験を行うための有効なライセンスを持っている必要があります。
1. 麻酔と前投薬
<ol><li>ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射でラットを麻酔する(体重400\u2012550gの6ヶ月齢のオスのウィスターラットの初期用量は60mg·kg-1)。 注:このプロトコルは、ラットの示された株、性別または年齢に限定されません。また、ケタミンキシラジンミックスなどの代替麻酔,α-クロラロースまたはフェンタニル+ミダゾラム+メデトミジンは、異なる研究目標に適している場合、または倫理委員会が要求する場合に使用することができます。</li>
	<li>約5分後、ラットの後肢のつま先を鈍い鉗子でつまんで麻酔の深さを確認します。反射アクションが見られない場合にのみ、プロトコルの次のステップを進めます。</li>
	<li>挿管後の粘液産生を減らすために、皮下に0.05 mLのアトロピンを注入する。</li>
	<li>4%グルコース溶液を含むリン酸緩衝液の皮下5mLを注入し、NaHCO3(1%)を含む3ゼラチン(14%)と。このバッファーは、実験を通じて、皮の血管によって吸収され、流体のバランスを維持するのに役立ちます。</li>
	<li>手術を通して、定期的に動物に反射作用がないかをチェックし、必要に応じて麻酔を補う(ペントバルビタールナトリウムの10 mg·kg-1·h-1)。</li>
</ol>2. 手術
<ol><li>左後肢の背部、足首から股関節、後部、尾から高胸部、胸部の左側、胸骨の上の頸部領域の腹側まで、左後肢の背部に毛皮を剃って外科治療のために動物を準備する</li>
	<li>静脈内線の配置<ol>
<li>ラットを閉じたループ加熱パッドの背面に置きます(そして、四肢の固定で固定します)。</li>
		<li>21枚の刃を使用して、胸骨から顎に皮膚を縦切りします。</li>
		<li>鉗子で皮膚を保持し、下の組織から分離します。</li>
		<li>鈍い解剖技術を使用して右頸静脈を露出させる。周囲の組織から静脈を慎重に解剖する。</li>
		<li>分岐点のない静脈の部分を見つけ、その下に2つの4-0合字を滑らせる。</li>
		<li>以前に同定された静脈の非分岐セグメントの近位端に1つの緩い結び目を作り、静脈のこのセグメントの遠位端に1つの緩い結び目を作ります。心臓に近位静脈をクランプし、静脈の遠位部分をリゲートします。</li>
		<li>アイリスハサミを使用して、クランプと遠い合字の間に切開を行います。静脈のフラップを保持し、クランプによってブロックされているポイントに事前に充填されたカテーテルを導入します。</li>
		<li>静脈とカテーテルを鉗子と一緒に保持しながら、クランプを取り外し、カテーテルを数ミリメートル静脈に押し込みます。カテーテルの両端を静脈に固定し、皮膚に追加の固定点を追加します。</li>
	</ol></li>
	<li>気管管の導入<ol>
<li>鈍い鉗子を使用して、ステルノイド筋肉を覆う2つの下顎腺を分離する。気管を露出させるために、中線でステルノヒロイドの筋肉を分離します。</li>
		<li>気管の下に3つの4-0合字を滑らせ、気管チューブ挿入点の下に2つのノットを作り、上に1ノットを作ります。</li>
		<li>喉頭の口蓋軟骨を見つけ、3番目の気管軟骨の下に切開を行います。</li>
		<li>気管チューブを気管の下に挿入し、あらかじめ準備された合字でチューブを所定の位置に固定し、皮膚に追加の合字を追加します。</li>
		<li>分離した筋肉の上に小さなコットンウールを置き、手術した領域の上に皮膚を縫合します。</li>
	</ol></li>
	<li>後肢神経の解剖<ol>
<li>21ブレードを使用して、左後肢の後部側、アキレス腱から股関節まで縦切りします。</li>
		<li>鉗子で皮膚をつかみ、鈍い解剖技術を使用して、切開の両側の下の筋肉から皮膚を分離する。</li>
		<li>上腕二頭筋で覆われている膝関節の後ろのポピタル窩を見つけ、はさみを使用してこの筋肉の前部と後部の間を切り取ります。</li>
		<li>上に移動すると、上腕二頭筋の2つの頭を股関節まで切り取り、坐骨神経を露出させる。出血を防ぐために必要に応じて焼灼します。</li>
		<li>坐骨神経の腹膜、脛骨および一般的な腹膜の枝を特定する。</li>
		<li>はさみを使用して、腸神経とその枝を露出させるために胃頭の内側頭から横方向を分離する。</li>
		<li>55鉗子を使用して、スラル神経の遠位端をつかみ、遠位に切り、可能な限り解剖する。</li>
		<li>一般的な腹膜神経で手順を繰り返します。</li>
		<li>鈍いガラス棒を使用して、脛骨神経を周囲の組織から分離し、血管に損傷を与えないように注意し、遠回りに切断する。</li>
		<li>内側胃腸(MG)と、横胃腸およびソレウス(LGS)神経を特定する。</li>
		<li>55鉗子を使用して、MGとLGS神経を慎重に解剖し、周囲の組織から切り離すが、それぞれの筋肉との接続を維持する。</li>
		<li>露出した神経の下に生理に浸した綿毛を置きます。</li>
		<li>操作領域の上に皮膚を閉じます。</li>
	</ol></li>
	<li>ラミネ切れ<ol>
<li>21枚刃を使用して、仙骨から胸椎までの縦切開を行います。</li>
		<li>根底にある筋肉から皮膚を分離します。</li>
		<li>胸部および腰椎の棘の両側の長軸筋を切る。</li>
		<li>鈍いエッジのメスを使用して、各椎骨の横方向のプロセスを露出させるために脊柱から筋肉を引き込みます。</li>
		<li>鈍い先端のはさみを使用して、露出した脊柱に沿って横方向のプロセスに接続された筋肉の腱を切断する。必要に応じて止血剤を塗布します。</li>
		<li>胸椎を最も低い胸部セグメントとして識別し、細かい回転器を使用すると、脊髄の腰部セグメントを露出させるためにTh13からL2椎骨までの棘プロセスとラミナエを除去します。脊椎安定化の固定点として使用されるL3棘プロセスを損傷しないように注意してください。</li>
		<li>Th12の棘のプロセスを取り除き、脊椎の裏面を可能な限り滑らかにします。</li>
		<li>鈍い解剖技術を使用して、ホルダー挿入ポイントを作成するために、Th11椎骨から筋肉を分離します。</li>
		<li>露出した脊髄セグメントの上に薄い生理液浸しのコットンウールを置きます。</li>
		<li>2つの平行な棒と2つの調節可能な腕と2つの調節可能な腕が付いているカスタムメイドの金属フレームにラットを動かして、背骨を支え、安定させる。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 記録と刺激の準備
<ol><li>椎骨カラム固定と神経配置<ol>
<li>ラットをカスタムメイドのフレームに加熱パッドに入れ、閉ループ加熱システムに接続して、動物の体温を37±1°Cに維持します。</li>
		<li>皮膚の下に心電図電極を挿入し、心拍数の監視のためのアンプに接続します。</li>
		<li>皮膚フラップを使用して、露出した脊髄の上に深いプールを形成する。</li>
		<li>金属クランプを使用して、Th12横方向プロセスの下およびL3のスピンプロセスでクランプを置くことによって、椎骨柱を固定します。</li>
		<li>椎骨柱が固定され、水平に配置されていることを確認し、その後、筋肉を引っ込めるために列の両側に背部腹側の圧力を適用します。</li>
		<li>プールに温かい(37°C)の鉱油を充填し、この温度で維持します。</li>
		<li>アキレス腱を通して4-0の合字を通し、足首が股関節で平準化されるように、操作された左後肢を持ち上げて伸ばします。</li>
		<li>皮膚フラップを使用すると、露出した脛部、MGおよびLGS神経の上に深いプールを作る。</li>
		<li>プールに温かい(37°C)のミネラルオイルを入れます。</li>
		<li>MGとLGSの神経をバイポーラシルバーワイヤー刺激電極に配置し、正方形のパルス刺激装置に接続します。各神経に対して別々の刺激チャネルを使用します。</li>
	</ol></li>
	<li>表面電極配置<ol>
<li>露出した脊髄の左側の帯側に銀色のボール電極を配置し、後ろの筋肉に参照電極を挿入し、両方の電極を差動DCアンプに接続します。表面ボール電極は、神経からの発泡ボレーを記録するために使用されます。</li>
		<li>定電流刺激器を使用して、0.1 msの秒間隔の正方形のパルスでMGとLGS神経を刺激し、3Hzの周波数で繰り返し、そして、アフェレントなボレーを観察する。</li>
		<li>神経活性化の閾値(T)を決定し、各神経を約3・2002で刺激するT強度、および各神経のためのアフェレントボレーの振幅を記録する。</li>
		<li>表面電極のrostralを動かし、各神経のバレーの振幅が最も高い脊髄セグメントを識別する手順を繰り返します。最大ボレー位置を決定した後、表面電極を脊髄から安全な距離に移動します。</li>
	</ol></li>
	<li>呼吸運動を軽減するために、筋肉麻痺と気胸を形成する<ol>
<li>ラットを神経筋遮断薬で静脈内に麻痺させ、げっ歯類適合性のカプノメーターに沿って気管チューブを外部人工呼吸器に接続する(臭化パンクロニウム、初期用量0.4mg·kg-1で、0.2 mg·kg-1の用量で30分ごとに補う)-1</li>
		<li>終潮CO2 濃度を監視し、換気パラメータ(周波数、空気圧、流量)を調整することで、約3\u20124%で維持します。</li>
		<li>録音の側面にある5番目と6番目の肋骨の間の皮膚に縦切開を行います。</li>
		<li>鈍い先端のはさみを使用して、肋骨間の肋間空間を視覚化するために上の筋肉をカットします。</li>
		<li>小さな鋭いはさみを使用して、肋間筋と胸膜に小さな切開を行い、その後、肺を押さないように注意して、鈍いエッジ鉗子の先端を開口部に挿入します。</li>
		<li>鉗子が実験を通して気胸を開いたままにするために小さい管を伸びるか、または挿入することを許可する。</li>
		<li>神経筋ブロック後、心電図周波数を確認して麻酔深度を監視し、心拍数が400bpmを超える場合は麻酔剤を補う。筋肉麻痺と気胸を形成して呼吸の動きを減らし、記録安定性を向上させる</li>
	</ol></li>
	<li>デュラとピアマーターを開く<ol>
<li>#55鉗子を使用して、硬膜をそっと持ち上げ、L5セグメントからL4セグメントまでロストラリーにカットします。</li>
		<li>超薄型5SF鉗子のペアを使用すると、MGまたはLGS神経からの最大アフェレントボレーのレベルで、血管間の、後列を覆うピアに小さなパッチを作ります。</li>
		<li>必要に応じて出血をブロックするために生理焼け入れと乾燥ゲルフォームの小片を使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>tsDCS電極配置<ol>
<li>L4-L5脊髄セグメントの位置に対応するロストロ・コーダルレベルで、ラット腹部の腹側の皮膚に小さな切開を行います。</li>
		<li>参照電極として機能する金属クリップで露出した皮膚フラップをつかみます。</li>
		<li>Th12椎骨の裏側に生理焼けしたスポンジを置きます。スポンジのサイズがアクティブtsDCS電極(直径5mmの円形のステンレス鋼板)のサイズと等しいことを確認してください。</li>
		<li>細かいマニピュレータを使用して、アクティブなtsDCS電極を使用してスポンジを骨に押し付け、電極の表面全体が等しく押されていることを確認します。</li>
		<li>参照およびアクティブtsDCS電極を一定電流刺激装置ユニットに接続し、連続的な直流流を供給することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>マイクロピペットの調製<ol>
<li>マイクロ電極プーラーを使用して、マイクロ電極を準備する。 注:フィラメント電極と非フィラメント電極の両方を使用できますが、電極のシャンクは、下降中に脊髄を圧縮しないように十分な薄さである一方で、腹側ホーンに到達するのに十分な長さでなければならないことを覚えておいてください。<ol>
<li>脊髄に入るシャンクが約3mm長く、電極の先端が直径1\u2012 μm以下で、微小電極抵抗が10~20MΩになるように、引き手の設定を調整します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>2Mのカリウムクエン酸電解質でマイクロ電極を充填します。</li>
		<li>1\u20122 μmのステップ移動と立体キャリブレーションを可能にするマイクロマニピュレータに準備されたマイクロ電極を取り付ける。</li>
		<li>マイクロ電極を細胞内アンプに接続し、後ろの筋肉に配置された参照電極を使用します。</li>
	</ol></li>
	<li>神経筋ブロック後、ECG周波数をチェックして麻酔深度を監視し、ラットの心拍数が400bpmを超えないように麻酔剤を補う。</li>
</ol>4. モトニューロンの追跡と浸透
<ol><li>アフェレント・ボレー記録電極を脊髄の背部表面に戻し、記録部位の位置まで、L6セグメントのレベルに置く。</li>
	<li>3 Hzの周波数で0.1 msの電気パルスと3T強度でMGとLGS神経を刺激し、選択した神経内のα-モトニューロンのすべての軸索を活性化します。</li>
	<li>マイクロピペットを15\u201220°のメロディー角でPIA内の選択したパッチに駆動します(先端が横方向に向けられています)。</li>
	<li>表面下に降下した後、マイクロ電極を較正し、そのキャパシタンスと電圧オフセットを補償し、すべてのパラメータが安定している場合は脊髄の浸透を継続します。モトニューロンプールの抗ドロミック場電位は、それぞれの神経の刺激中に専用の運動核に近づくと、マイクロ電極電圧トレースで見える。</li>
	<li>1\u20122 μmステップでマイクロ電極を貫通し、細胞内アンプのバズ機能を定期的に使用して、任意の残留物から電極先端をクリアします。</li>
	<li>記録された電圧トレースの突然の超分極化とアンチドロミックスパイク電位の出現によって特徴づけられるモトニューロンの浸透を観察する。</li>
</ol>5. モトニューロン膜と焼成特性の記録
<ol><li>細胞内増幅器のブリッジモードでは、それぞれの神経枝を刺激することによって、抗ドロミック作用の可能性の「オールまたはナッシング」の出現に基づいてモトニューロンを同定する。後で平均化するために、20 の後続トレースを記録します。</li>
	<li>厳密な包含基準を実施して、高い品質データを確保する:少なくとも-50 mVの可静時の膜電位を振幅で行う。50 mV を超えるアクション電位振幅、ポジティブオーバーシュート。記録前に少なくとも5分間安定した膜電位。</li>
	<li>細胞内増幅器の不連続電流クランプモード(電流スイッチレートモード4~8 kHz)では、0.5msの細胞内脱分極電流パルスを用いたニューロンの正交性アクションポテンシャルを呼び起こす。オフライン平均化のために、少なくとも 20 回繰り返します。</li>
	<li>細胞入力抵抗を計算するために、過分極電流(1nA)の40の短いパルス(100 ms)でモトニューロンを刺激します。</li>
	<li>振幅を増加させると50ミリ秒の方形波パルスでモトニューロンを刺激し、単一のスパイクを引き出すために必要な脱分極電流の最小振幅としてレオベース値を決定します。</li>
	<li>モトニューロンのリズミカルな放電を呼び起こすために0.1-2 nAのステップで振幅を増加させると、脱分極電流の500 msの方角波パルスを注入します。</li>
</ol>6. トランス脊髄直流刺激(tsDCS)
<ol><li>モトニューロンの安定した浸透を維持しながら、直流のトランス脊髄適用により分極化手順を開始する。現在の強度と適用時間を実験計画に合わせて調整します(例えば、15分間の0.1 mA)。</li>
	<li>DCをオンにした直後に、モトニューロン膜電位を観察します。アノーダル偏光(陽極としての活性電極)は膜電位の脱分極をもたらす必要があり、カソーダル偏光(カソードとしての活性電極)は逆の効果を呼び起こすはずです。DC刺激に応答して安静膜電位の変化が一定であるかどうかを観察し、電界強度が影響を受けないようにします。</li>
	<li>現在の連続アプリケーションの間に、5 分間隔で手順 5.3\u20125.6 を繰り返します。</li>
	<li>DC の電源を切り、記録が不安定になるか、または包含条件が危険になるまで、手順 5.3\u20125.6 を 5 分間隔で繰り返し続けます。</li>
	<li>実験を終了し、ペントバルビタールナトリウム(180mg·kg-1)の致死量の静脈内投与を使用して動物-1を安楽死させる。</li>
</ol>

<ol><li>Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ergogenic+Effects+of+Transcranial+Direct+Current+Stimulation+on+Exercise+Performance%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance.</a> Frontiers in Physiology. 8, 90(2017).</li>
<li>Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+induces+lasting+fatigue+resistance+and+enhances+explosive+vertical+jump+performance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance.</a> PloS One. 12 (4), 0173846(2017).</li>
<li>Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+%28tsDCS%29+selectively+inhibits+the+synaptic+efficacy+of+nociceptive+transmission+at+spinal+cord+level%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level.</a> Neuroscience. 393, 150-163 (2018).</li>
<li>Parazzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+current+density+generated+by+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+%28tsDCS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurophysiology%3A+Official+Journal+of+the+International+Federation+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS).</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).</li>
<li>Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+feasibility+and+effect+of+anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+on+chronic+neuropathic+pain+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury.</a> Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).</li>
<li>Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+spinal+direct+current+simulation+for+spasticity+therapy+following+spinal+cord+injury%3A+mechanistic+insights+contributing+to+long-term+treatment+effects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects.</a> The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).</li>
<li>de Araújo, A. V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+anodal+transcranial+direct+current+stimulation+to+improve+muscle+strength+and+motor+functionality+after+incomplete+spinal+cord+injury%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis.</a> Spinal Cord. , (2020).</li>
<li>de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+transcranial+direct-current+stimulation+with+gait+training+in+patients+with+neurological+disorders%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroengineering+and+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review.</a> Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114(2019).</li>
<li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gamma+and+alpha+spinal+motor+neurons+activity+by+trans-spinal+direct+current+stimulation%3A+effects+on+reflexive+actions+and+locomotor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity.</a> Physiological Reports. 4 (3), (2016).</li>
<li>Bolzoni, F., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+and+postsynaptic+effects+of+local+cathodal+DC+polarization+within+the+spinal+cord+in+anaesthetized+animal+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations.</a> The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).</li>
<li>Cogiamanian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+Spinal+Direct+Current+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation.</a> Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).</li>
<li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-spinal+direct+current+stimulation+alters+muscle+tone+in+mice+with+and+without+spinal+cord+injury+with+spasticity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).</li>
<li>Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+long-lasting+subcortical+facilitation+by+transcranial+direct+current+stimulation+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat.</a> The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).</li>
<li>Manuel, M., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha%2C+beta+and+gamma+motoneurons%3A+functional+diversity+in+the+motor+system%27s+final+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway.</a> Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).</li>
<li>Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+unit+recruitment+order+during+voluntary+and+electrically+induced+contractions+in+the+tibialis+anterior%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior.</a> Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).</li>
<li>Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+and+behaviour+of+motor+units+in+the+tibialis+anterior+during+voluntary+contractions%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Applied+Physiology+%3D+Revue+Canadienne+De+Physiologie+Appliquee%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions.</a> Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).</li>
<li>Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+properties+of+motoneurons+innervating+different+muscle+unit+types+in+rat+gastrocnemius%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius.</a> Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).</li>
<li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-spinal+direct+current+stimulation+modifies+spinal+cord+excitability+through+synaptic+and+axonal+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms.</a> Physiological Reports. 2 (9), (2014).</li>
<li>Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics%2C+high-frequency+oscillations%2C+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li>
<li>Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+limits+of+cathodal+transcranial+direct+current+stimulation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurophysiology%3A+Official+Journal+of+the+International+Federation+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).</li>
<li>Bączyk, M., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+direct+current+are+reproduced+by+intermittent+depolarization+of+myelinated+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).</li>
<li>Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motoneuron+firing+properties+are+modified+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> Journal of Applied Physiology. 126 (5), Bethesda, Md. 1232-1241 (2019).</li>
<li>Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+modifications+of+motoneuron+firing+properties+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> European Journal of Neuroscience. , (2019).</li>
<li>Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+the+ratio+of+injected+current+to+electrode+area+tell+us+about+current+density+in+the+brain+during+tDCS%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurophysiology%3A+Official+Journal+of+the+International+Federation+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).</li>
<li>Rahman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+effects+of+acute+direct+current+stimulation%3A+somatic+and+synaptic+terminal+effects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects.</a> The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).</li>
<li>Bikson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+uniform+extracellular+DC+electric+fields+on+excitability+in+rat+hippocampal+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro.</a> The Journal of Physiology. 557, Pt 1 175-190 (2004).</li>
<li>Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+control+of+motor+outputs+by+intrinsic+and+externally+induced+electric+field+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).</li>
<li>Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-current+relationships+of+rat+hindlimb+alpha-motoneurones%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones.</a> The Journal of Physiology. 573, Pt 3 663-677 (2006).</li>
</ol>

著者は開示する利益相反はありません。

正しく行われれば、記載されたプロトコルの外科部分は約3時間以内に完了するべきである。手術中の動物の安定した生理的状態、特に体温や麻酔の深さを維持する上で特に注意する必要があります。明らかな倫理的配慮とは別に、適切な麻酔の欠如は、神経解剖または解剖の間に過度の四肢の動きを引き起こし、準備または早期実験終了の損傷につながる可能性があります。脊髄を微小電極で貫通する前に動物を麻痺させると、麻酔の深さと心拍数を監視し、動物の体重と肺容量に基づいて適切な換気パラメータを適用することが重要です。望ましい生理学的パラメータからの逸脱は、手順の成功を確実にするために直ちに修正されなければならない。手術後、安定した記録状態は、少なくとも4時間維持することが可能であるべきである。
モトニューロンの浸透後、記録安定性が重要である。制御記録中は、変動がレオベース電流とリズミカルな発火の閾値に大きな影響を与えるため、膜電位が一定に保たれます。椎骨柱の適切な固定は基本的な安定性を提供する必要がありますが、気胸の目標は呼吸によって誘発される脊髄の動きを減少させることです。さらに, 1 つは、筋肉の収縮が完全に消...

トランス脊髄直流刺激(tsDCS)は、健康と疾患,1、2、32における脊髄回路興奮性を修飾する1強力な方法として認識を得ている。3この技術では、選択した脊髄セグメントの上に位置する活性電極の間に一定の電流が渡され、参照電極は腹側またはより多くのロストレル4に位置する。いくつかの研究は、tsDCSが神経因性疼痛5、痙攣性6、脊髄損傷7、またはリハビリテーションを促進するために、特定の病的状態の管理に使用できることを既に確認している。研究者は、tsDCSが細胞膜を横切る細胞内および細胞外空間との間のイオン分布の変化を誘発することを示唆しており、これは現在の向き9、10、1110,に9応じて神経活動を促進または阻害することができる。11しかし、最近まで、モトニューロンに対するこの影響の直接的な確認は欠けていた。
ここでは、ニューロン脊髄ネットワークのアノダルまたは陰極偏光に応答してモトニューロン膜および発火特性の変化を観察するために、麻酔付きラットの腰椎脊髄モトニューロンからの電気電位の記録を生体内で行う詳細なプロトコルについて説明する。細胞内記録は、ニューロンの特性の調査のいくつかの領域を開き、以前に使用された細胞外技術99、1212のために利用できない。例えば、tsDCSによって誘導される直接電流流れに対するモトニューロン膜電圧応答を正確に測定し、スパイク発生の電圧閾値を示したり、アクション電位パラメータを解析したりすることができる。また、この技術により、入力抵抗などのモトニューロン受動膜特性を判断し、細胞内刺激電流とモトニューロンのリズミカルな発火頻度との関係を観察することができます。記録されたモトニューロンの抗ドロミック同定は、機能的に同定された神経(すなわち、屈筋または伸長器にエフェレントを提供する神経)の刺激に基づいて、さらに内在性運動ユニットの種類(速い対低速)を同定することを可能にし、分極が成熟した脊髄神経系の個々の要素に異なる影響を与えるかどうかをテストする機会を与える。記録の安定性と信頼性に関する記録および高い要件に先行する広範な手術のために、この技術は非常に困難であるが、1つのモトニューロンの電気生理学的特性の直接的かつ長期的な評価を可能にする:tsDCSの適用前、適用中および適用後、その急性作用および持続効果の両方を決定するために重要である13。モトニューロンが直接筋筋線維14を活性化し、筋収縮および発達力15のフィードバック制御に関与するように、16は運動部または筋肉収縮特性に対するtsDCSの観察された影響は、モトニューロンの興奮性または発火特性の変調にリンクされ得る。,

<table><tbody><tr><td>Durgs and solutions</td><td>-</td><td></td><td>--</td></tr><tr><td>Atropinum sulfuricum</td><td>Polfa Warszawa</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck</td> <td>346351-NaHCO3</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Merck</td><td></td> <td>106329-Pancuronium</td></tr> <tr><td>Jelfa</td><td>PharmaSwiss/Valeant-Neuromuscular</td><td></td> <td>blocker</td></tr><tr><td>Pentobarbital ナトリウム</td><td>Biowet Pu?awy Sp. z o.o</td><td>-</td><td>主な麻酔薬</td></tr><tr><td>クエン酸ポタシウム</td><td>Chempur</td><td>6100-05-06-Tetraspan</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Braun-HES</td><td></td> <td>solution</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical equipment</td><td>-</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>-21 ブレード</td><td>FST</td><td>10021-00</td><td>メスブレード</td></tr><tr><td>焼灼器</td><td>FST</td><td>18010-00</td><td>-</td></tr><tr><td>胸部チューブ</td><td>ミラ</td><td>CT1215</td><td>-</td></tr><tr><td>デュモン #4 鉗子</td><td>FST</td><td>11241-30</td><td>筋鉗子</td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>デュラ鉗子</td></tr><tr><td>デュモン #5F 鉗子</td><td>FST</td><td>11255-20</td><td>神経鉗子</td></tr><tr><td>デュモン #5SF 鉗子</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>ピア鉗子</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>FST</td><td>11008-13</td><td>鈍い鉗</td></tr><tr><td>子鉗子</td><td>FST</td><td>11053-10</td><td>皮膚鉗</td></tr><tr><td>子止血</td><td>FST</td><td>13013-14-Rongeur</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>FST</td><td>16021-14</td><td>椎弓切除術用</td></tr><tr><td>ハサミ</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>静脈ハ</td></tr><tr><td>サ</td>ミ <td>FST</td><td>15002-08</td><td>デュラハサミ</td></tr><tr><td>はさみ</td><td>FST</td><td>14184-09</td><td>気管カット</td></tr><tr><td>はさ</td>み用はさみ<td>FST</td><td>104075-11</td><td>筋肉はさ</td></tr><tr><td>みはさみ</td><td>FST</td><td>14002-13</td><td>皮膚はさみ</td></tr><tr><td>気管チューブ</td><td>-</td><td></td><td>カスタムメイド</td></tr><tr><td>静脈カテーテル</td><td>Vygon</td><td>1261.201</td><td>-</td></tr><tr><td>血管カニューレ鉗子</td><td>FST</td><td>18403-11</td><td>-</td></tr><tr><td>血管クランプ</td><td>FST</td><td>18320-11</td><td>静脈クランプ用</td></tr><tr><td>血管拡張プローブ</td><td>FST</td><td>10160-13</td><td>静脈解剖</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>用<tr><td>Sugrgical 材料</td><td>-</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>ゲルフォーム</td><td>ファイザーGTIN</td><td>00300090315085</td><td>止血剤</td></tr><tr><td>シルク縫合糸 4.0</td><td>FST</td><td>18020-40</td><td>-</td></tr><tr><td>シルク縫合糸 6.0</td><td>FST</td><td>18020-60</td><td>-</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>-</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>Axoclamp 2B</td><td>分子デバイスは</td><td>製造中止</td><td>細胞内増幅器/新モデル Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>CapStar-100 呼気終末 CO2 モニター</td><td>CWE</td><td>11-10000</td><td>ガスアナライザー</td></tr><tr><td>グラス S-88</td><td>A-M</td><td>システム販売終了</td><td>定電流刺激装置</td></tr><tr><td>ホメオサーミック ブランケットシステム フレキシブルプローブ付き</td><td>ハーバード大学装置</td><td>507222F</td><td>暖房システム</td></tr><tr><td>ISO-DAM8A</td><td>WPI</td><td>74020</td><td>細胞外増幅器</td></tr><tr><td>マイクロドライブ</td><td>-</td><td>-</td><td>カスタムメイド/交換 IVM/サイエンティフィカ</td></tr><tr><td>P-1000 マイクロ電極引き手</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>Microelectrode 引き手</td></tr><tr><td>SAR-830/AP 小動物用人工呼吸器</td><td>CWE</td><td>12-02100</td><td>呼吸器</td></tr><tr><td>サポートフレーム</td><td></td><td>--</td><td>カスタムメイド/交換用ラボ標準ベース 51601/Stoelting</td></tr><tr><td>脊椎クランプ-</td><td></td><td>-</td><td>カスタムメイド/交換用ラット脊椎アダプター 51695/Stoelting</td></tr><tr><td>TP-1 DC 刺激装置</td><td>WiNUE</td><td>-</td><td>tsDCS刺激装置</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>その他</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-1B150-4ガラス毛細血管</td><td>WPI</td><td>1B150-4</td><td>微小電極製造用</td></tr><tr><td>脱脂綿</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-フレキシブルチューブ</td><td>-</td><td>-</td><td>呼吸器およびCO2分析装置接続用</td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>WPI</td><td>MF28G67-5</td><td>マイクロピペット充填用</td></tr><tr><td>銀線</td><td></td><td></td> 神経<td>電極用</td></tr></tbody></table>

生体内でのトランス脊髄直流刺激時の型同定されたラット脊髄モネニューロンの細胞内記録

In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

生体内の脊髄モトニューロンの細胞内記録は、無傷の脊髄ネットワークにおける細胞の電気生理学的特徴を決定するための「ゴールドスタンダード」を提供し、古典的なインビトロまたは細胞外記録技術に対して有意な利点を有する。生体内細胞内記録の利点は、完全に成熟した神経系を持つ成体動物に対してこの方法を行うことができることであり、したがって、多くの観察された生理学的メカニズムを実用的なアプリケーションに翻訳することができる。この方法論的論文では、この手順を、脊髄神経ネットワーク内で起こる偏光プロセスを模倣する外部応用定電流刺激と組み合わせて説明する。トランス脊髄直流刺激(tsDCS)は、様々な神経学的傷害の後のリハビリテーションにおける神経調節的介入として、またスポーツにおいてますます使用される革新的な方法である。tsDCSが神経系に及ぼす影響は未だに解明されておらず、その作用の背後にある生理学的メカニズムはほとんど知られていない。tsDCSを細胞内記録と同時に応用することで、脊髄神経回路網の分極化に応じて、モトニューロン膜の性質やリズミカルな発火の特性の変化を直接観察することができ、tsDCSの作用を理解するために重要です。さらに、提示されたプロトコルに、内在筋とその機能(屈筋対伸長器)に関するモトニューロンの同定と生理学的タイプ(速い対低速)が含まれる場合、分極によって異なる影響を受けると思われる脊髄回路の同定された成分に対するtsDCSの影響を選択的に調査する機会を提供する。提示された手順は、細胞内の記録のための外科的調製と、結果の調製の安定性と再現性を達成するために必要なステップに重点を置いて刺激に焦点を当てています。アノーダルまたは陰極tsDCSアプリケーションの方法論の詳細は、実用的かつ安全上の問題に注意を払いながら議論される。

細胞浸透の安定した条件が確保された場合、作用電位およびいくつかの膜特性のパラメータは、細胞内記録に基づいて計算することができる。 図1Aは 、細胞内刺激によって誘発される典型的な正交性作用電位を示し、データ包含のすべての基準(少なくとも-50 mVの静止膜電位、および50mVより高いスパイク振幅、陽性のオーバーシュート)を満たす。スパイク振幅、後偏波振幅、または後偏光半分光時間(AHP-HDT)などの作用電位パラメータを測定することができる。ラットモトニューロンの後者のパラメータの値は、高速と低速のモトニューロン(AHP-HDT &gt; 遅い場合は20 ms、AHP-HDT &lt;高速モトニューロンの場合は20ms)を区別するための信頼できる基準として機能します。 図1B は、1nAの100ms過分極電流パルスに対するセル応答を示し、そこからモトニューロンのピークおよびプラトー入力抵抗(IR)の両方が電圧偏向から決定することができる。 <strong class="x...

このプロトコルは、同時のトランス脊髄直流刺激を用いたラット腰椎モトニューロンの生体内細胞内記録について説明する。この方法により、膜の特性を測定し、脊髄のアノーダルまたは陰極分極化の前後にモトニューロンのリズミカルな発火を記録することができます。

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

このプロトコルは、脊髄系の機能に対するトランス脊髄直流刺激の影響を直接調査するために、脊髄モトニューロンの細胞内記録を使用する。この技術の主な利点は、完全に成熟した神経系で細胞内記録を行うことができるということです。実験観察の実用化への翻訳を促進する。ペダル反射への応答の欠如を確認した後、麻酔6ヶ月の雄のウィスターラットは、解剖顕微鏡と数21ブレードを使用して、胸骨から顎への縦方向の皮膚切開を行う。そして、右頸静脈を露出させるために鈍い解剖を使用してください。分岐点なしで静脈のセクションの下に2、4-0の合字を置きます。そして、静脈セグメントの近位端に1つの緩い結び目を作ります。そして、セグメントの遠位端に1つの緩い結び目。心臓に近位静脈をクランプし、静脈の遠位端をリゲートします。虹彩はさみを使用して、クランプと遠位合字の間に切開を行います。そして、静脈のフラップを保持し、静脈がクランプによってブロックされるポイントに事前に充填されたカテーテルを導入する。クランプを外し、カテーテルを数ミリメートル静脈に押し込みます。気管チューブの配置には、鈍い鉗子を使用して、ステルノイド筋肉を覆う2つの下顎腺を分離します。そして、中線でステルノヒノイド筋肉を分離し、気管を露出させる。気管の下に 3 つ 4-0 の合字を配置し、気管チューブ挿入ポイントの下に 2 ノット、上に 1 ノットを作成します。その後、気管チューブを第3気管軟骨の下の気管に挿入します。そして、事前に準備された合字で所定の位置にチューブを固定します。後肢神経を解剖するには、21番の刃を使用して、アキレス腱から股関節まで、左後肢の後部側に縦切りを作ります。そして、膝関節の後ろにある、膝窩の前部と後部領域の間に切り傷を作るためにはさみを使用してください。上腕二頭筋の2つの頭部を切り、坐骨神経を露出させる。そして、胃頭筋の内側頭から横方向の頭部を分離し、脛骨神経とその枝を露出させる。その後、数55鉗子を使用して、内側胃腸および横胃腸およびソレウス神経を慎重に解剖する。筋肉のそれぞれの接続を維持しながら、周囲の組織からそれらを切断します。.ラミネクトミーを行うために、数21の刃を使用して、仙骨から胸椎までの縦切開を行う。そして、胸部の最も低い胸部セグメントとして、胸椎を識別します。次に、細かい回転器を使用して、Th13からL2椎骨までの棘プロセスとラミナエを除去し、脊髄の腰部を露出させます。椎骨柱を固定するには、閉じたループ加熱システムに接続された37°Cの加熱パッド上のカスタムメイドのフレームにラットを置きます。そして、皮膚のフラップを使用して、露出した脊髄の上に深いプールを形成します。Th12横方向のプロセスの下に金属クランプを配置し、L3のスピンプロセスで、37°Cの鉱物油でプールを充填します。皮膚フラップを使用して、露出した脛石、内側胃腸および側面胃腸およびソレウス神経の上にミネラルオイルの深いプールを作ります。そして、双極性銀線刺激電極上に神経を置きます。次に、各神経に対して別々の刺激チャネルを使用して、電極を正方形のパルス刺激装置に接続します。表面電極の配置のために、解剖顕微鏡の下で、露出した脊髄の左尾側に銀球電極を置く。後ろの筋肉に挿入された参照電極と。両方の電極を差動DCアンプに接続します。一定の電流刺激器を使用して、内側胃食道および側胃腸およびソレウス神経を刺激し、0.1ミリ秒の持続時間の正方形のパルスを3つのヘルツ周波数で繰り返し、帯電性ボレーを観察する。シミュレーションの最後に、表面電極をロストラリーに動かし、刺激を繰り返して、各神経のバレーの振幅が最も高い脊髄セグメントを特定する。最大ボレーの位置を決定した後、ラットを麻痺させるために静脈内に神経筋遮断剤を送達する。アシスタントはげっ歯類の互換性のあるキャップの指名者と一直線に外気管の管を外の換気装置に接続している間。硬膜およびピアマーターを開くには、55番鉗子を使用して硬膜を静かに持ち上げ、L5セグメントからL4セグメントまで組織を硬膜状に切断します。次に、超薄型5SF鉗子のペアを使用して、血管間の後列を覆うピアに小さなパッチを作ります。正確には内側胃腸および横胃腸およびソレウス神経からの最大のアフェレントボレーのレベルで。トランス脊髄直流刺激電極を配置するには、Th12椎骨の背骨側に生理食い浸したスポンジを置きます。そして、アクティブなトランス脊髄直流刺激電極でスポンジを押すために微細な操作を使用します。次に、カスタムプールされたマイクロ電極をマイクロマニピュレータに取り付け、1〜2ミクロンのステッピング運動と立体キャリブレーションを可能にする。そして、15〜20度内側の横の角度で、pia内の選択されたパッチにマイクロピペットチップを駆動します。モトニューロン膜および焼成特性を記録するために、細胞内増幅器のブリッジモードにおいて、それぞれの神経枝を刺激して、全てまたは何も出現しない、抗血色作用電位のモトニューロンを同定する。現在の切り替え速度モードが4〜8キロヘルツの細胞内増幅器の不連続電流クランプモードでは、0.5ミリ秒の細胞内脱分極電流パルスを使用して、モトニューロンにおける矯正作用電位を呼び起こす。細胞入力抵抗を計算するには、1ナノグラム電流を超分極する40短い100ミリ秒パルスで、モトニューロンを刺激する。単一のスパイクを引き出すために必要な脱分極電流の最小振幅として実底値を決定するには、振幅を増加させると50ミリ秒の方形波パルスでモトニューロンを刺激する。次に、振幅を増加させると、脱分極電流の500ミリ秒の方波パルスを注入します。0.1〜2ナノアンプステップで、モトニューロンのリズミカルな放電を呼び起こす。トランス脊髄直流刺激の場合は、モトニューロンの安定した浸透を維持しながら、直流のトランス脊髄適用により偏光手順を開始する。ここで、典型的な異方性作用電位は、データ包含の全ての基準を満たす細胞内刺激によって誘発される、図示される。本分析では、1ナノグラムの100ミリ秒超分極電流パルスに対する細胞応答を示す。そこからモトニューロンのピークとプラトー入力抵抗の両方が、電圧偏向から決定することができ、観察することができる。この膨張した電圧トレースは、実際の基本スパイクの、スパイクの電圧閾値を明確に示す。電圧ゲート付きナトリウムチャネルが活性化され、作用電位を開始する膜脱分極のレベルを示す。これらのグラフは、細胞内電圧トレースの例を示しています。2つのモトニューロンから、脱分極電流の500ミリ秒四方パルスで細胞内刺激を受ける。トランス脊髄直流刺激アプリケーションの前、中、後。アノダルトランス脊髄直流刺激は、増加したモトニューロン興奮性およびリズミカルな発火の高い周波数に向けて作用することが判明した。陰極トランス脊髄直流刺激をしながら、発火抑制に向けて行動した。さらに、両方のタイプのトランス脊髄直流刺激の効果は、分極の期間を上回った。不完全な細胞浸透のためにデータ包含基準が損なわれた場合、不正確なデータを取得できます。微小電極抵抗とキャパシタンスまたは脊髄不安定性を補うことができない。損傷は脊髄ショックを引き起こし、さらなる記録を不可能にする可能性がありますので、解剖中に脊髄に損傷を与えないことが不可欠です。組織サンプルをさらに組織学的または免疫細胞の化学分析のために採取することが可能です。例えば、c-fos発現の測定は、神経活動の代理として使用することができる。

in-vivo-intracellular-recording-type-identified-rat-spinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

この新しい方法は、単一の成体マウスの運動ニューロンとその筋線維による力の測定を同時に細胞内記録を可能にします。正常および遺伝子改変動物における運動単位の電気的および機械的特性の組み合わせ調査は、神経筋システムの研究のための画期的な製品です。...

腰椎運動ニューロンおよび成体マウスでそのモーターユニットによる力の同時細胞内記録<emインビボ&gt;</em

このビデオは、先端の細いガラス製マイクロピペットと特殊なセットアップを使用して、単一脳ニューロンからの電気信号の記録を示しています。マイクロピペットはラットの脳に慎重に挿入され、ブザーを鳴らしてニューロンを貫通し、内部のニューロンの電気信号を記録します。...

単一ニューロンからの細胞内シグナルのin vivo記録

このビデオでは、経脊髄直流刺激下でのラット運動ニューロンのin...

ラットの脊髄運動ニューロンの経脊髄直流刺激

このビデオでは、尺骨神経に電気刺激を加え、最適な信号を得るために電極を調整し、神経機能を評価するために刺激を増やすことにより、ラットの複合筋活動電位(CMAP)を記録する手順を示しています。この方法により、神経疾患における末梢神経機能のin...

ラットにおける化合物筋活動電位のin vivo測定

このビデオは、ラットのC線維神経伝導の単線維記録を示しています。麻酔をかけたラットを切開して坐骨神経を露出させ、下肢に感覚と運動の供給を提供します。その後、個々のCファイバーが露出します。足に埋め込まれた刺激電極を用いて電気刺激を行い、1本の神経線維から反応を記録します。...

ラットの坐骨神経C線維のin vivo単線維記録

GABA作動性シナプス前抑制は、モータと脊髄ネットワークでの感覚信号の統合のための重要な脊髄の強力な阻害のメカニズムです。基礎となる一次求心性の脱分極は、後根電位（DRP）の記録により測定することができる。ここでは、マウスにおけるDRP のインビボ記録する方法を実証する。...

後根潜在的記録によりマウスにおける脊髄シナプス前抑制を測定する<em&gt;インビボ</em

若いマウスで脊髄の斜めスライスを準備する方法を示します。この調製により、腹根の刺激が可能になります。...

前根刺激のための斜め脊髄スライスの調製

シングルファイバー記録は、中枢および末梢神経系に適用可能な効果的な電気生理学的手法である。付着した坐骨神経を持つ無傷のDRGの調製と共に、伝導障害のメカニズムが調べられる。両方のプロトコルは、末梢神経系と痛みとの関係の理解を向上させます.

インビボシングルファイバー記録と無傷の後部根神経を用いて伝導障害のメカニズムを調べる

この方法は、ラット内側胃腸筋の3種類の運動単位におけるけいれんおよびテタニック収縮および作用電位の力の記録を可能にする。単一のモーターユニットの機能的な分離は、軸索の電気刺激によって誘導される。...

ラット内側胃腸筋単一運動ユニットの機能的分離

このプロトコルは研究者が脊髄を分け、細胞生存率を同時に維持することの彼らの技術を改善するのを助けることができる高い時空間決断の脊髄の刺激(SCS)への運動ニューロンの電気応答を調査するのにパッチ・クランプを使用して方法を記述する。...

脊髄刺激時の運動ニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録のための脊髄スライスの ex vivo 調製

心機能の記録と心臓にロックされた脊髄後角ニューロンの分析と並行して、脊椎マルチチャネル細胞外記録のプロトコルについて説明します。この方法は、鍼治療によって誘発される胸部内臓機能変化の根底にある脊椎メカニズムを研究するための時間的に同期したフレームワークを提供します。...

ラット脊髄背角における心臓ロックニューロン応答に対する体細胞刺激のコードプロファイルの研究

学ぶトランス脊髄直流刺激下でのラット脊髄モネニューロンの細胞内記録法。成熟した神経系における膜特性と発火パターンの評価により、神経可塑性と神経リハビリテーションへの応用可能性を解明する。

生体内でのトランス脊髄直流刺激時の型同定されたラット脊髄モネニューロンの細胞内記録

さらに動画を探す