レタス品種におけるビタミンCの定量化のためのUPLC-UV法(ラクチサティバ L.)と野生の親戚の作物(Lactuca spp.)
June 30th, 2020
UPLC-UVを使用して、他の植物に転移可能な ラクトゥカ spp.でビタミンCを定量化するための迅速かつ信頼性の高い方法を提示します。重要なステップは、安定した条件下でのサンプル調製およびビタミンC抽出、アスコルビン酸へのデヒドロアスコルビン酸の減少、およびクロマトグラフィー手順の最適化です。
ビタミンCは、果物や野菜の栄養価の指標です。私たちは、特にレタスで、世界中で最も消費された葉野菜でそれを定量するための簡単で信頼性の高い方法が必要です。この方法は、ビタミンCの分解を防ぎ、その精度と感度のおかげで、強化された抽出とアスコルビン酸とデヒドロアスコルビン酸の両方の迅速で信頼性の高い定量を提供します。
この方法は、栄養ファクトラベルを作成するために食品技術で使用することができます, 健康と植物の繁殖に食品の影響を研究する医学で, 異なる種のビタミンC含有量を増加させます.イネス・メディナ・ロザノとの手順を実証すると、ホセ・エンジェル・アランフエロとアランツァズ・カステラノス、私の研究室の2人のアナリストになります。植物サンプルを調製するには、植物ごとに少なくとも1つの外側と1つの内葉を収穫し、すぐにマイナス80°Cの貯蔵にそれらを置く前に、液体窒素で葉を凍結します。
凍結した植物サンプルを凍結乾燥するには、凍結乾燥機の凍結乾燥機室内のトレイに上限のないサンプルチューブを置き、指示に応じて凍結乾燥剤をプログラムします。コンデンサ温度をマイナス80.2°Cに保ち、112で真空定数を維持し、材料が完全に乾燥しているときは、20ミリリットルのポリプロピレンチューブで、凍結乾燥したサンプルに直径10ミリメートルのステンレス鋼のボールを追加します。そして、マルチチューブボルテクサーを使用して、適切な時間と強度で、サンプルを細かいほこりに粉砕します。
アスコルビン酸の標準ストックおよび希釈液を調製するために、正確に10ミリグラムのアスコルビン酸標準を精密バランスで計量する。そして、サンプルに移動相の90ミリリットルで。磁気撹拌機を使用してサンプルを溶解し、体積フラスコを使用して得られた溶液の100ミリリットルを正確に測定します。
必要に応じて、ギ酸とpH2で酸性化し、追加の超純水を添加する。次いで、ストックから5つの希釈液を調製し、較正曲線を得た。低光強度の下で作業し、50ミリグラムの凍結乾燥した地盤サンプルと5ミリリットルの抽出溶媒を15ミリリットルのポリプロピレン遠心分離管に加え、溶液を5秒間渦巻く。
1分あたり2000回転で軌道シェーカーで10分間サンプルを振った後、室温で10分間超音波浴にチューブを移し、遠心分離によってサンプルを集めます。次いで、0.22ミクロン再生セルロースフィルターを介して上清をひずみ、5ミリリットルアンバーバイアルに、アスコルビン酸とデヒドロアスコルビン酸の両方を抽出1で抽出する。葉試料中のアスコルビン酸濃度を決定するための希釈液を調製するには、200マイクロリットルの抽出物1を加え、800マイクロリットルの超純水を2ミリリットルの琥珀色の液体クロマトグラフィーバイアルに加え、PTFE/シリコーンプラグでバイアルを閉じます。
アスコルビン酸の抽出のために、200マイクロリットルの抽出物を2ミリリットルの琥珀色の液体クロマトグラフィーバイアルに移し、200マイクロリットルの還元溶液をバイアルに加える。プラグと渦でバイアルを5秒間閉じます。室温で30分間インキュベーションした後、光から保護し、0.4モル硫酸の200マイクロリットルを使用し、反応を停止させ、アスコルビン酸を安定化させ、酸性pHにする。
サンプル中のアスコルビン酸濃度の合計を決定するための希釈を調製するために、400マイクロリットルの超純水を加え、合計アスコルビン酸抽出物2にする。プラグでバイアルを閉じます。実験を開始する少なくとも1時間前に、すべての動作ソリューションがUPLCシステムにロードされていることを確認し、3つのUPLCモジュールのスイッチをオンにします。
内部キャリブレーションプロセスが終了したら、ソフトウェアを開いて、インストゥルメンタルプログラムをロードします。ソフトウェアがロードされたら、第四級溶媒マネージャをクリックし、マウスの右ボタンをクリックしてコンソールを起動し、UPLC管理コンソールにアクセスします。「システム、制御および起動」をクリックして、UPLC装置の調製と安定化に進み、プライム溶剤、QSM、チェックA、B、C、D、シール洗浄およびプライムの持続時間を5分以上、すべてのUPLCラインを5分間パージします。
SM をクリックし、45 秒以上の洗浄溶剤を確認します。パージ溶剤をチェックし、35サイクルでインジェクターをパージして清掃します。UPLCをメソッド条件に平衡化するには、メソッドとQSMに平衡化し、毎分0.3ミリリットルに流れを設定します。
溶媒A〜2%溶媒B〜0%溶媒C 98%および溶媒D〜0%を方法およびSMに平衡化し、試料を摂氏5度、カラムを摂氏30度に設定した。[方法と他] に [均衡] をクリックし、[ランプオン] を選択して [開始] をクリックします。機器を少なくとも1時間安定させます。
安定性を確認するには、[コンソールシステムおよびQSMの起動]をクリックし、[QSMシステム圧力]を選択して、カラム内の圧力を確認します。圧力変化に識別可能な傾向がなく、デルタ値が圧力の平方インチ当たり10ポンド未満である場合は、クイックスタート画面で、分析する標準とサンプルの名前をマトリックスに記入します。標準でアスコルビン酸濃度を決定するには、UPLC装置に各希釈液の5マイクロリットルを注入し、最も希釈から最も濃縮された溶液に始まるクロマトグラフィーを行います。
葉試料中のアスコルビン酸とアスコルビン酸濃度の合計を決定するには、希釈した抽出物1個を5マイクロリットル注入し、それぞれ2個ずつ抽出し、クロマトグラフィー分析用UPLC装置に注入します。アスコルビン酸とアスコルビン酸の総濃度を計算するには、ソフトウェアでクイックスタート、プロジェクトの閲覧、チャンネル、標準またはサンプルの名前、およびPDAチャンネル1、1.2ナノメートルで245ナノメートルをクリックします。標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラムを開くには、クロマトグラムの開始点をクリックし、それを終点までドラッグして、対応するピークを標準およびサンプルに統合します。
次にアスコルビン酸標準希釈液からのデータを用いて、較正曲線を構築し、クロマトグラフィで決定された吸光度値を表し、試料の吸光度値を補間し、アスコルビン酸および全アスコルビン酸濃度を求める、式に従う。ラクトゥカマトリックスにおけるビタミンC定量は、信頼性の高い結果を保証できるクロマトグラフィーアプローチの開発を必要とする。ここで、非最適化プロトコル提示とアスコルビン酸ピークから生じるクロマトグラムと、鉱夫の肩で未確認のクロマトグラムが観察される。
それにもかかわらず、抽出およびクロマトグラフィー条件を改善した後、未知の化合物の干渉なしに分解されたアスコルビン酸ピークを達成することができる。また、HPLC紫外線の代わりにUPLC紫外線装置を使用することで、保持時間と走行時間を短縮できます。アスコルビン酸ピークの干渉は、クロマトグラフィープロセス中の分離が不十分なため、ビタミンC含有量の過小評価を一貫して生じる。
重なり合うピーク領域は、それらの間の最も深いポイントで垂直のドロップによって統合されます。さらに、最適化されていないプロトコルを使用することで、結果から有用な結論を抽出できなくなります。すべてのサンプルが同様のビタミンC含有量を有するように見えるように、 その形態のいずれか。
これに対し、最適化されたプロトコルを使用すると、異なるタイプのサンプル間で統計的に有意な差を検出できます。複数のサンプルを収集し、サンプルを正しく保存し、酸化剤へのサンプルの暴露を最小限に抑え、ビタミンCの両方の形態を定量化してください。
概要
この研究は、UPLC-UVを使用してLactuca spp.のビタミンCを定量化するための信頼性の高い方法を提示します。この方法は、アスコルビン酸およびデヒドロアスコルビン酸の両方の抽出と定量化を向上させ、様々な分野での応用を可能にします。
研究の主要構成要素
科学の分野
- 食品技術
- 植物生物学
- 栄養科学
背景
- ビタミンCは果物や野菜の栄養価にとって重要です。
- レタスは世界で最も消費される葉物野菜です。
- 信頼性の高い定量化方法は、栄養表示と健康研究に不可欠です。
- この方法は、抽出中のビタミンCの劣化を防ぎます。
研究の目的
- ビタミンC定量化の迅速で信頼性の高い方法を開発すること。
- アスコルビン酸とデヒドロアスコルビン酸の抽出プロセスを最適化すること。
- 食品技術と植物育種への応用を促進すること。
使用した方法
- サンプルの準備には、植物サンプルの凍結と凍結乾燥が含まれます。
- アスコルビン酸の標準溶液を校正用に調製します。
- サンプルのクロマトグラフィー分析にはUPLC-UVを使用します。
- 抽出と定量化の手順は精度のために詳細に説明されています。
主な結果
- この方法は抽出効率を向上させます。
- ビタミンCの正確な定量化が達成されます。
- 結果は栄養表示と健康研究に適用できます。
- この方法は他の植物種にも適応可能です。
結論
- 開発された方法は迅速で信頼性が高く、感度が高い。
- 栄養分析と植物育種に大きな助けとなる可能性があります。
- 将来の応用は様々な食品技術にまで拡大する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of vitamin C in plant matrices is critical for early-stage discovery and validation of nutritional biomarkers in food and agricultural biotechnology pipelines. The optimized UPLC-UV protocol enables sensitive, reproducible measurement of both ascorbic acid and dehydroascorbic acid, supporting robust hypothesis testing and mechanistic de-risking in trait selection and nutritional profiling. This capability enhances predictive confidence for R&D teams prioritizing crop improvement and functional food development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise quantification of vitamin C forms for nutritional biomarker validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing ascorbic acid and dehydroascorbic acid contributions.
- Facilitates detection of statistically significant differences across plant genotypes.
- Improves confidence in trait selection for crop breeding programs.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible workflow for vitamin C quantification in diverse plant matrices.
- Delivers quantitative outputs suitable for high-throughput screening and comparative studies.
- Reduces assay variability by minimizing sample oxidation and optimizing chromatographic separation.
- Enables reliable evaluation of nutritional content in breeding and food technology pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Aligns nutritional biomarker measurement with translational research in plant-based health interventions.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of functional food candidates.
- Provides risk-adjusted data for advancing nutritional traits in crop development.
Pipeline & Workflow Integration
This UPLC-UV method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for nutritional biomarker validation and trait selection in plant biotechnology.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification for vitamin C biosynthesis and stability.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility for quantitative comparison of plant lines.
- Analytics: Provides robust chromatographic readouts and calibration-based quantification for cross-sample analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment for functional food and crop improvement studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse plant species and processed food matrices with minimal modification.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in nutritional trait validation.
- Operational Value: Standardizes sample handling and quantification, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions in crop and food product pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of high-value nutritional traits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatographic analysis and sample preparation.
- Needs access to UPLC-UV instrumentation and analytical software for calibration and quantification.
- Demands strict sample handling protocols to prevent oxidation and degradation.
- Adaptable to various plant and food matrices with minor protocol adjustments.
- Potential limitations include sensitivity to sample preparation errors and chromatographic interferences.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:03
Plant Material Preparation
1:57
Ascorbic Acid (AA) Standard Preparation
2:34
AA and Dehydroascorbic Acid (DHAA) Extraction
3:40
DHAA Reduction for Total AA (TAA) Extraction
4:31
Ultra-High-Performance Liquid Chromatography-Ultraviolet Preparation
6:46
AA Determination
7:21
AA and DHAA Quantification
8:18
Results: Representative Vitamin C Quantification in Lactuca Species
9:44
Conclusion
