マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

マウス胚性幹細胞のニューロン細胞への分化のプロトコールに加えて、分化プロセスを包括的に分析できる一連の実験も示しています。これらの技術は、初期の外胚葉胚発生に関連し、研究者にニューロン細胞の分化を解析するための選択肢を提供します。この手順を試みるときは、最適な状態で幹細胞から始めることが不可欠です。

したがって、EB、MPC、およびニューロンを新鮮で最適な培地で培養することが重要です。このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは、その成功と有効性、特に差別化部分に影響を与える可能性のある詳細が含まれているため、重要です。まず、吊り下げ式ドロップセル培養液をセットアップします。

10cmの細胞培養プレートの場合、分化培地20マイクロリットルあたり500細胞に濃度を調整します。20マイクロリットルの液滴50個に十分な細胞懸濁液を調製します。マイクロピペットまたはリピーターピペットを使用して、20マイクロリットルの細胞懸濁液を組織培養プレートの蓋に置き、液滴が互いに接近しすぎないようにして、液滴が合流するのを防ぎます。

プレートに5〜10ミリリットルのPBSを入れ、蓋を慎重にプレートに戻します。37°Cのインキュベーターで培養物をインキュベートします。2日後、蓋から液滴を採取し、10ミリリットルの分化培地を充填した10cmの細胞培養懸濁プレートに入れ、インキュベーター内で低速に設定したオービタルシェーカーにプレートを置きます。

さらに2日後、細胞をGの200倍で3分間遠心分離し、上清を取り除きます。胚様体を神経前駆細胞に分化させるには、細胞を5マイクロモルのレチノイン酸を含む分化培地に再懸濁します。プレートを2日間インキュベートし、プレートを傾けてピペッティングして、培地の少なくとも半分を新しい培地と交換します。

2日後にGの200倍で3分間遠心分離し、上清を除去して細胞を採取します。胚様体と神経前駆細胞をPBS中の4%PFAで室温で30分間固定します。次に、PFAを除去し、PBSで細胞を5分間洗浄します。

細胞をPBS 10、20、および30%スクロース溶液で摂氏25〜28度で連続的にインキュベートし、各インキュベーションは細胞がチューブの底に落ち着くまで30分以上続きます。そして、それを使用してサンプルをクライオモールドの中心に移し、余分な液体をピペッティングで排出します。サンプルを再懸濁せずに、最適な切断温度またはOCT溶液を金型に慎重に追加し、ピペットで余分な気泡を取り除きます。

サンプルを入れた型を実験室用ミキサーに低速で15分間置くと、胚様体と神経前駆細胞がOCT溶液の底に沈殿します。次に、型を液体窒素に入れてサンプルをすばやく凍結します。10%正常ロバ血清、および0.1%Triton X-100のPBS中のニューロンを含むOCT切片または培養室を室温で1時間ブロックします。

次に、サンプルを一次抗体でインキュベートし、5%正常ロバ血清と0.05%Triton X-100のPBSで希釈し、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、0.1%Triton X-100を用いてPBSでサンプルを5分間3回洗浄します。それらを二次抗体と共生させ、5%正常ロバ血清および0.05%Triton X-100のPBS溶液で希釈し、室温で1時間インキュベートします。

Triton X-100とPBSで洗浄を繰り返し、サンプルを1マイクログラム/ミリリットルのDAPIでインキュベートします。サンプルをカバースリップと封入剤でマウントし、乾燥させてから、蛍光顕微鏡でイメージングします。ニューロンの分化を行うために、E14細胞をガンマ線照射したマウス胚性線維芽細胞上で、線維芽細胞集団が希釈するまで培養しました。

E14細胞の多能性は、アルカリホスファターゼ染色により確認されました。分化後、胚体は丸い形をしており、サイズが絶えず大きくなりました。10日目までに、ニューロンに分化する神経前駆細胞は、細長い細胞形状をしていました。

免疫蛍光実験は、8日目に神経前駆細胞に対して、12日目にニューロンに対して行った。神経前駆細胞のネスティング、およびニューロンのニューロフィラメントの陽性染色が観察されました。Sox1プロモーター駆動型GFPレポーターを発現するマウス胚性幹細胞株を分化させ、胚性幹細胞と神経前駆細胞に対してフローサイトメトリーを行った。

NPC期の全細胞の58.7%がGFP陽性であり、ESC期の細胞は0%がGFP陽性であることがわかりました。E14胚性幹細胞、胚様体、神経前駆細胞に対してRNA配列実験を行いました。RNA配列ヒートマップの遺伝子は、その発現レベルに基づいてソートされました。

4つの遺伝子クラスターの遺伝子オントロジー解析により、それらが異なる細胞機能または経路に対応していることが示されました。このプロトコールを実施する場合、EBSは球形の黒ずんだ細胞塊として現れるはずです。EBSがこのように成長するようにするには、培地が黄色がかった色になり始めた場合は、初日に培地を交換します。

EBとMPCの両方が初期胚発生の重要な段階にあるため、MPC培養でも同じアプローチが重要です。ChIPseekやニューロン分化のさまざまな段階からのクロマチン確認キャプチャーアッセイなど、他の機能的ゲノムアッセイを実施して、根底にある生物学的プロセスを理解することができます。化学的および機能的ゲノミクスアッセイによるニューロン分化プロセスの統合により、研究者は初期胚発生の分子メカニズムをより明確に理解することができます。