Name: マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学ぶマウス胚性幹細胞から神経細胞への分化プロトコル。ハンギングドロップ法を用いた神経前駆細胞の誘導と、RT-qPCR・免疫蛍光・フローサイトメトリーによる多角的解析手法を解説する。

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この研究は、NIH(1R35GM133496-01)からZ.ガオへの助成金によって支えられた。ライアン・ホッブス博士の切り離し支援に感謝します。ペン州立医科大学の中核施設(ゲノム科学とバイオインフォマティクス、先端光顕微鏡イメージング、フローサイトメトリーなど)に感謝します。また、今村有香先生のRNA-seq解析のお手伝いに感謝します。

1. mESC文化
<ol><li>10 cmの組織培養処理プレートに0.1%のゼラチンをコーティングし、ゼラチンを少なくとも15〜30分間セットしてから吸い出します。</li>
	<li>種子γ照射マウス胚性線維芽細胞(MEF)は、予め温めたmESC培地(Dulbeccoの改変イーグル培地(DMEM)に15%の胎児ウシ血清(FBS)、非必須アミノ酸を含むMESCを培養する前日に、 β-メルカプトエタノール、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、LIF、PD0325901(PD)、およびChir99021(CH))</li>
	<li>e14細胞を培養する前に、γ照射されたMEFをプレート表面に沈着させます。</li>
	<li>37 °Cの水浴でE14 ESCを解凍し、すぐに暖かいmESC媒体と15 cmの円錐形の管の細胞を移す。細胞を200xgで3分間ペレットし、上清を取り除きます。</li>
	<li>細胞をmESC培地の10mLに再懸濁し、先に播種したγ照射されたMEFを含む培養プレート上の細胞をプレートに入れた。5%CO2未満の37°Cインキュベーターで細胞培養をインキュベートする。</li>
	<li>培養パスケージングの場合、培地を吸引し、滅菌1xPBSでプレートを洗浄する。プレート表面を覆うのに十分な0.05%のトリプシンを加え、37°Cで3分間インキュベートします。</li>
	<li>mESC培地とピペットでトリプシンを中和し、単一細胞懸濁液を生成します。細胞を200xgで3分間遠心し、上清を取り除きます。</li>
	<li>血球計または細胞カウンターで細胞を数え、10cm培養プレートに約5.0 x105個 の細胞を播種します。</li>
	<li>細胞をmESC培地の10mLに再懸濁し、先に述べたようにゼラチンコーティングされた組織培養プレート上の細胞をプレートし、培養をインキュベートする。 注: 細胞がコロニー内で分化するのを防ぐために、mESC を 2 日ごとに通過させることが推奨されます。フェノール赤は、pHインジケーターとしてのみ機能し、細胞密度に応じて、2日よりも早く黄色(より酸性)に変えることができます。したがって、毎日培地を変更する必要があるかもしれません。γ照射されたMEFは、いくつかの通路の後に最終的に死ぬでしょう。</li>
</ol>2. EB、NPC、およびニューロンの分化
<ol><li>前述のカルチャパスパサイジング プロトコルを実行し、セルをカウントします (手順 1.7 ~ 1.10)。</li>
	<li>ぶら下げ方法 (日 0)<ol>
<li>10cmの細胞培養プレートの場合、5.0 x 102細胞が20μL分化培地(15%FBS、非必須アミノ酸、βメルカプトエタノール、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピロビン酸を含むDMEM)に懸濁する約2.5 x 104細胞を数えます。細胞を含む約502μLの液滴は、10cmのプレートにメッキすることができる。</li>
		<li>適切な数の細胞をアリコートし、次いで細胞を200xgで3分間遠心し、上清を除去する。</li>
		<li>細胞密度5.0 x 102細胞 /20μL(例えば、分化培地1mLの2.5 x104細胞 )の適切な分化培地の細胞を再懸濁する。</li>
		<li>マイクロピペットまたはリピータピペットを使用して、細胞懸濁液の20μL液滴を組織培養プレートの蓋上に置く。液滴が互いに近すぎないようにして、液滴がマージされないようにします。 注:液滴は、プレート自体ではなく蓋の上に置かれるので、組織培養処理された取り付けプレートまたはサスペンションプレートのいずれかにメッキすることができます。より実現可能で無菌のアプローチのために、液滴を付着組織培養プレートにプレートし、以下に説明するように懸濁液プレートに移します。</li>
		<li>1x PBSの5~10 mLでプレートを満たし、蓋を慎重にプレートに戻します。培養液を37°Cインキュベーターで培養します。 注:PBSは、液滴が乾燥するのを防ぐために培養プレートに添加されます。</li>
	</ol></li>
	<li>2日目には、マイクロピペットを使用して蓋から液滴を回収し、10mLの分化培地で満たされた10cmの細胞培養懸濁液板に入れます。インキュベーターで低速で揺れる軌道シェーカー上の培養物をインキュベートします。</li>
	<li>4日目に、EBを収穫し、細胞を採取し、200xgで3分間遠心分離し、上清を取り除く。 注: その後の実験の要件に従って、1x PBS で EJB を洗浄することもできます。</li>
	<li>処置を継続し、EB分化を神経前駆細胞(NPC)に誘導し、5μMレチノイン酸(RA)で分化培地を調製する。</li>
	<li>100 x g で 3 分間のエブをペレットにして古い培地を取り除くか、古い培地を吸い出す前に EB が沈着するようにします。培養プレートに5μM RAを含む分化培地10mLを加えます。</li>
	<li>6日目に、プレートを傾けて上記のように培地をピペットアウトして、培地の少なくとも半分を5μM RAを含む新鮮な培地に置き換えます。 注:5日目と7日目には、少なくとも半分の媒体を新鮮なRA含有培地に置き換えるのが推奨されます。フェノール赤いインジケータのメモを取る;黄色がかった場合は、すべての媒体を置き換えるのが最善です。</li>
	<li>8日目に、細胞を採取し、200xgで3分間遠心し、上清を取り除いてNPCを収穫する。 注:NPCは、その後の実験のニーズに応じて1倍のPBSで洗浄することもできます。必要に応じて、NPCを凍結して再び解凍して、後で培養および分析することができます。NPCを培養する場合、アキュタスはトリプシンの代替として使用することもできます。</li>
	<li>手順を継続し、NPCをニューロンに分化するには、遠心分離によって15 mLの円錐管にNPCを収集し、トリプシンで解体し、37°Cで3分間インキュベートします。ピペットNPCは、すべてのNPC凝集体が解別され、トリプシンを培地で中和することを確実にする。</li>
	<li>40 μmナイロン細胞ストレーナーで細胞をフィルターし、N2培地(DMEM/F12培地+ 3 mg/mLグルコース + 3 mg/mL 脂質豊富なウシ)の密度1.5 x 105/cm2 でめっきする前に細胞を数える 血清アルブミン(LBSA)+1:100 N2サプリメント+ 10 ng/mL bFGF + 50 U/mLペン/ストレップ + 1 mM L-グルタミン) その後のPCRおよびウェスタンブロット実験のための組織培養処理プレート;または免疫蛍光実験のための組織培養室で。</li>
	<li>9日目に、古い媒体を新鮮なN2培地に交換します。</li>
	<li>10日目にN2培地をN2/B27培地(50%DMEM/F12および50%ニューラル基底、3mg/mL LBA、1:200 N2サプリメント、1:100 B27サプリメント、50 U/mLペン/ストレップ、1mM L-グルタミン)に切り替えます。</li>
	<li>11日から12日に、次のようにニューロンを収穫します。細胞を1x PBSで洗浄し、トリプシンを加え、37°Cインキュベーターで3分間培養してから、トリプシンを培地で中和し、遠心分離機を200xgで3分間培養します。</li>
</ol>3. mESCと分化セルの特性
<ol><li>アルカリホスファターゼ(AP)アッセイ 
	<ol>
<li>キットを使用してアルカリホスファターゼの活動を評価します( 材料表を参照)。</li>
		<li>培養プレートから培地を取り出し、1x PBSでESCを洗います。</li>
		<li>キットに付属の1mLの固定溶液(ホルムアルデヒドとメタノール)をプレートに加え、室温で2〜5分間インキュベートします。 注: 修正ソリューションの過剰インキュベーションは AP アクティビティを危険にさらす可能性があります。</li>
		<li>修正液を取り出し、1x PBSでESCを洗い、プレートにいくらかの量のPBSを残します。 注: AP アクティビティを損なわないよう、PBS で ESC を湿らせておいてください。</li>
		<li>A、B、Cの基板溶液を1:1:1比で混合してAPソリューションを準備します。最初にAとB溶液を混合し、C溶液を添加する前に2分間室温で混合物をインキュベートします。</li>
		<li>1x PBS を取り外し、先ほど用意した AP ソリューションを追加します。</li>
		<li>培養プレートをアルミ箔で包むか、暗い部屋でステップ3.5を行って、暗闇の中で約15分間ESCをインキュベートします。</li>
		<li>反応を監視し、溶液が明るくなったときに反応液を除去し、非特異的な染色を避けます。</li>
		<li>1x PBSでESCを2回洗います。</li>
		<li>ESCを1x PBSまたは取り付け媒体で覆うことで、サンプルの乾燥を防ぎます。 注: AP 表現には赤または紫の染色が表示されます。プレートは4°Cの冷蔵庫に収納できます。</li>
	</ol></li>
	<li>RT-qPCR 
	<ol>
<li>ESC と EB および NPC の手順 1.6 ~ 1.7 と 2.4 に従って、さまざまな段階でセルを収集します。</li>
		<li>RNA、DNA、およびタンパク質抽出溶液を使用してRNAを分離します( 材料表を参照)。</li>
		<li>逆転写キットを使用して cDNA を生成し( 資料表を参照)、製造元のマニュアルに従います。</li>
	</ol></li>
	<li>固定と埋め込み 
	<ol>
<li>上記のようにEBとNPCを収穫し(ステップ2.6)、室温で30分間1xPBSで4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液で固定します。</li>
		<li>PFAを取り出し、サンプルを1x PBSで5分間洗います。</li>
		<li>サンプルを1x PBS、10%、20%、および30%スクロース溶液を25\u201228 °Cで連続希釈し、30分のインキュベーション後にサンプルを次の溶液に移します。 注:サンプルは、埋め込みステップを続行する前に、4 °Cで30%スクロース溶液に保存することができます。</li>
		<li>サンプルを(積み重ねずに)凍結鋳型の中心に置く前に、スクロース溶液でピペットチップを濡らし、余分な液体をピペットアウトします。 メモ: フィルター ペーパーを使用して、余分なソリューションを削除することもできます。チップチップをスクロース溶液で濡らすと、先端の壁にEBやNPCが付着するのを防ぐことができます。</li>
		<li>サンプルを再中断することなく、最適な切削温度(OCT)溶液を慎重に金型に追加し、ピペットで余分な気泡を除去します。</li>
		<li>サンプルを用いてラボのミキサーに低速で金型を置き、サンプルを軽く攪拌して15分間温かく攪拌します。これは、OCT ソリューションで再中断された場合に、EB と NPC を最下位に解決するのに役立ちます。</li>
		<li>液体窒素またはドライアイスに金型を入れることで、サンプルを素早く凍結します。 メモ:サンプルは、次のステップに進む前に-70°Cの冷凍庫に保管することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>凍結切断 
	<ol>
<li>クライオスタットを -20 ~ -18 °C に冷却してから、サンプルを器具に移します。</li>
		<li>凍結したOCTブロックを金型から取り外し、ホルダーの表面に少しOCT溶液を置いてホルダーに固定します。</li>
		<li>切り離し中にサンプルが失われないように、EB と NPC がブレードに最も近いように OCT ブロックを位置合わせします。</li>
		<li>慎重にブロックの10 μmをセクションし、サンプルを含むスライスに細心の注意を払います。</li>
		<li>サンプルを含むOCTスライスを組織埋め込みガラススライドに素早く置き、OCTスライスを室温で1時間空気乾燥させます。 メモ:サンプルは、後で使用するために-70°Cで保存することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>免疫蛍光(IF) 
	<ol>
<li>OCTセクションまたは培養チャンバーは、ニューロンを10%正常ロバ血清/0.1%トリトンX-100で1x PBSで1時間室温で1時間ブロックします。</li>
		<li>サンプルを5%正常ロバ血清/0.05%トリトンX-100で希釈した一次抗体で、4°Cで一晩1x PBSでインキュベートする。</li>
		<li>1回の洗浄でサンプルを1x PBS/0.1%トリトンX-100で洗浄します。</li>
		<li>サンプルを5%正常ロバ血清/0.05%トリトンX-100で1時間室温で1時間希釈した二次抗体でインキュベートします。</li>
		<li>1x PBS/0.1% トリトンX-100でサンプルを洗浄し、各洗浄を5分間洗浄し、1 μg/mL DAPIでサンプルをインキュベートします。</li>
		<li>カバースリップといくつかの取り付け媒体でサンプルを取り付け、乾燥させます。</li>
		<li>蛍光顕微鏡でサンプルを観察します。</li>
	</ol></li>
	<li>RNA-セクの分析 
	<ol>
<li>様々な段階で細胞を収集し、RNA抽出を行う(ステップ3.2参照)。</li>
		<li>cDNAライブラリを準備し、Wangら8に記載されているプロトコルに従って深いシーケンシングとデータ分析を行う。</li>
		<li>R パッケージ、クラスタープロファイルを使用して遺伝子オントロジー (GO) 分析を実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>フローサイトメトリー 
	<ol>
<li>手順 1.6 ~ 1.7 に従って ESC を収集し、セルを培地で再中断します。手順 2.4 に従って、EB と NPC を収集し、セルをメディアで再中断します。</li>
		<li>40 μm ナイロンセルストレーナーを使用して、新しい 15 mL 円錐チューブにセルサスペンションをフィルターします。</li>
		<li>フローサイトメーター(施設のコア施設によって実行される)を使用してサンプルのGFP信号を測定します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Joshi, P., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+imaging+%28HCI%29+on+miniaturized+three-dimensional+%283D%29+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures.</a> Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).</li>
</ol>

著者は、競合する財政的利益はないと宣言しています。

マウス胚性幹細胞の神経分化の方法は何十年も確立されており、研究者は以前のプロトコルを変更したり、様々な目的のために新しいプロトコルを作成し続けています7,10,11.一連のアッセイを用いて、マウスやヒトESCの他の系統分化の解析に用いることができるニューロンへのmESCの分化段階の効率と進捗状況を総合的に分析しました。さらに、我々のアプローチは、vitro 8における神経分化に対する特定の遺伝子または経路の影響を評価するのに有用なツールであることが証明された。
我々の方法により、多能性非コミットESCは、レチノイン酸(RA)で処理され、高効率で神経系統にコミットし、ニューロン7をさらに生成するように誘導される。ES細胞の神経細胞への分化を改善し、異質性を低下させるためには、ES細胞を未分化状態<sup ...

開発中マウス胚盤胞1,2の内細胞塊からの初の導出以来、マウス胚性幹細胞(mESC)は幹細胞自己再生と分化を研究する強力なツールとして用いられてきた3。さらに、mESC分化を研究することは、神経変性疾患などの疾患の治療における幹細胞ベース療法における効率と安全性を向上させる可能性のある分子機構の多大な理解につながる4。動物モデルと比較して、このin vitroシステムは、実際と評価におけるシンプルさ、動物とは対照的に細胞株を維持する際の低コスト、および遺伝子操作における相対的な容易さなど、多くの利点を提供する。しかし、分化された細胞タイプの効率と品質は、多くの場合、mESCの異なるラインと分化方法5、6の影響を受けます。また、分化効率を評価する従来のアッセイは、堅牢性に欠ける選択されたマーカー遺伝子の定性的検査に依存しているため、遺伝子発現の世界的な変化を把握することができません。
ここでは、神経分化の系統的評価にアッセイの電池を使用することを目指しています。選択したマーカーとRNA-seqに対する従来のインビトロ分析を用いて、分化効率とこのプロセス中の転写変化を測定するためのプラットフォームを確立します。既に確立されたプロトコル7に基づいて、吊り下げ低下技術を通じて胚体(EB)を生成し、続いて上端菌量のレチノイン酸(RA)を用いて神経前駆細胞(NPC)を生成し、その後神経誘導培地でニューロンに分化した。分化の効率を調べるために、従来のRT-qPCRおよび免疫蛍光(IF)アッセイに加えて、RNA-seqおよびフローサイトメトリーを実施した。これらの分析は、ステージ固有の分化の進行を包括的に測定します。

<table><tbody><tr><td>0.05% トリプシン + 0.53mM EDTA 1X</td><td>コーニング</td><td>25-052-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.1% ゼラチン</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>脱イオン水で調製</td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>1X PBS</td></tr><tr><td>40-&mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 ヤギ抗マウス IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>抗体を 1:500 で希釈しました IF</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ染色キット II</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td></td></tr><tr><td>AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox</td><td>Azura Genomics</td><td>AZ-2105</td><td></td></tr><tr><td>B27</td>サプリメント <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto</td><td>BD</td><td>657338</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>11123149001</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer 高感度DNAキット</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Chir99021</td><td>ケイマンケミカルズ</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>C298-500</td><td>フィッシャー化学</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EB バッファー</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>111000200</td><td>Pharmco</td><td>脱イオン水で希釈</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>アトランタBiologicals</td><td>S10250</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 シーケンシングシステム</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>BDH1133-4LG</td><td>BDH VWR 分析</td><td>脱イオン水で希釈</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>MEF上清から採取</td></tr><tr><td>m18srRNAプライマー</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'MEM</td></tr> <tr><td>非必須アミノ酸</td><td>コーニング</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>mNanogプライマー</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGTGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'</td></tr><tr><td>mNes プライマー</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'mNeuroD1</td></tr> <tr><td>プライマー</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'mOct4</td></tr> <tr><td>プライマー</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6</td></tr> <tr><td>プライマー</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2</td></tr> <tr><td>supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Nestin 一次抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td> 抗体を IF Neural Thermo Fisher Scientific <td>用に 1:200 で希釈しました</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>ニューロフィラメント 一次抗体</td><td>DSHB</td><td>2H3</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit</td><td>BioO Scientific</td><td>NOVA-5138-07</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PD0325901 Cayman Chemicals</td><td>13034</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>脱イオン水で調製-</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>P217-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>-リン酸カリウム一塩基性無水物</td><td>0781-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>-塩化ナトリウム</td><td>BP358-10</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td></td></tr><tr><td>-リン酸ナトリウム、二塩基性、七水和物</td><td>SX0715-1</td><td>ミリポア</td><td></td></tr><tr><td>ランダムヘキサマープライマー</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>DMSO</td> ピルビン酸ナトリウム Corning 25-000-Cl スクロース Sigma 84097 で希釈した SO142 <td></td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Σ</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>1X PBS</td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064022</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 化合物</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> で調製<td></td></tr><tr><td>TriPure単離試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11667165001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Rapid</td><td>Illumina</td><td>20020616</td><td></td></tr><tr><td>&β;-メルカプトエタノール</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP176-100</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

マウス胚性幹細胞を神経系統に分化し、次に分化した細胞を特徴付ける一連のアッセイを行うステップバイステップの手順について述べています。E14マウス胚性幹細胞を使用して吊り下げドロップ法を介して胚体を形成し、次にレチノイン酸によって神経前駆細胞に分化し、最終的にニューロンに分化した。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)および免疫蛍光実験により、神経前駆物質およびニューロンが、8日目と12日目の分化後に対応するマーカー(神経前駆物質用のネチンとニューロンの神経フィラメント)をそれぞれ示すことが明らかになった。 Sox1 プロモーター主導のGFPレポーターを発現するE14ラインでのフローサイトメトリー実験は、8日目の細胞の約60%がGFP陽性であることを示し、この段階で神経前駆細胞の分化が成功したことを示した。最後に、RNA-seq分析を使用して、世界的な転写変化をプロファイリングしました。これらの方法は、神経細胞の分化中の細胞の同一性遷移を調節する際の特定の遺伝子および経路の関与を分析するのに有用である。

この方法の表現として、E14細胞に対してEB、NPC、およびニューロン分化実験を行いました。E14細胞は、γ照射されたMEF集団が希釈されるまでγ照射MEF(図1A)で培養した。E14細胞の多能性を確認した結果、ナノグおよびOct4マーカーに対してアルカリホスファターゼ(AP)染色(図1B)および後述のRT-qPCR(下記参照)を行うことで、E14細胞の多能性を確認した。 γ照射されたMEFフリーE14細胞を、図2Aに示すプロトコルを用いて分化のために誘導した。簡単に言えば、500個の細胞を含む20μLの分化培地液滴を培養板の蓋に播種した(詳細はプロトコルセクション2参照)。その後、形成されたEJBを回収し、新鮮な分化媒体に懸濁液に入れた。分化の4日目から8日目にかけて、5μM RAを培養プレートに加え、NPCを誘導し、分化されたEBsは円形形状を示し、そのサイズは分化中も増加し続けた(<strong class="xfig...

吊り下げドロップ法を用いて、マウス胚性幹細胞を神経細胞に分化する手順について説明する。また、RT-qPCR、免疫蛍光、RNA-seq、フローサイトメトリーを通して包括的なフェノミック解析を行っています。

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

マウス胚性幹細胞のニューロン細胞への分化のプロトコールに加えて、分化プロセスを包括的に分析できる一連の実験も示しています。これらの技術は、初期の外胚葉胚発生に関連し、研究者にニューロン細胞の分化を解析するための選択肢を提供します。この手順を試みるときは、最適な状態で幹細胞から始めることが不可欠です。したがって、EB、MPC、およびニューロンを新鮮で最適な培地で培養することが重要です。このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは、その成功と有効性、特に差別化部分に影響を与える可能性のある詳細が含まれているため、重要です。まず、吊り下げ式ドロップセル培養液をセットアップします。10cmの細胞培養プレートの場合、分化培地20マイクロリットルあたり500細胞に濃度を調整します。20マイクロリットルの液滴50個に十分な細胞懸濁液を調製します。マイクロピペットまたはリピーターピペットを使用して、20マイクロリットルの細胞懸濁液を組織培養プレートの蓋に置き、液滴が互いに接近しすぎないようにして、液滴が合流するのを防ぎます。プレートに5〜10ミリリットルのPBSを入れ、蓋を慎重にプレートに戻します。37°Cのインキュベーターで培養物をインキュベートします。2日後、蓋から液滴を採取し、10ミリリットルの分化培地を充填した10cmの細胞培養懸濁プレートに入れ、インキュベーター内で低速に設定したオービタルシェーカーにプレートを置きます。さらに2日後、細胞をGの200倍で3分間遠心分離し、上清を取り除きます。胚様体を神経前駆細胞に分化させるには、細胞を5マイクロモルのレチノイン酸を含む分化培地に再懸濁します。プレートを2日間インキュベートし、プレートを傾けてピペッティングして、培地の少なくとも半分を新しい培地と交換します。2日後にGの200倍で3分間遠心分離し、上清を除去して細胞を採取します。胚様体と神経前駆細胞をPBS中の4%PFAで室温で30分間固定します。次に、PFAを除去し、PBSで細胞を5分間洗浄します。細胞をPBS 10、20、および30%スクロース溶液で摂氏25〜28度で連続的にインキュベートし、各インキュベーションは細胞がチューブの底に落ち着くまで30分以上続きます。そして、それを使用してサンプルをクライオモールドの中心に移し、余分な液体をピペッティングで排出します。サンプルを再懸濁せずに、最適な切断温度またはOCT溶液を金型に慎重に追加し、ピペットで余分な気泡を取り除きます。サンプルを入れた型を実験室用ミキサーに低速で15分間置くと、胚様体と神経前駆細胞がOCT溶液の底に沈殿します。次に、型を液体窒素に入れてサンプルをすばやく凍結します。10%正常ロバ血清、および0.1%Triton X-100のPBS中のニューロンを含むOCT切片または培養室を室温で1時間ブロックします。次に、サンプルを一次抗体でインキュベートし、5%正常ロバ血清と0.05%Triton X-100のPBSで希釈し、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、0.1%Triton X-100を用いてPBSでサンプルを5分間3回洗浄します。それらを二次抗体と共生させ、5%正常ロバ血清および0.05%Triton X-100のPBS溶液で希釈し、室温で1時間インキュベートします。Triton X-100とPBSで洗浄を繰り返し、サンプルを1マイクログラム/ミリリットルのDAPIでインキュベートします。サンプルをカバースリップと封入剤でマウントし、乾燥させてから、蛍光顕微鏡でイメージングします。ニューロンの分化を行うために、E14細胞をガンマ線照射したマウス胚性線維芽細胞上で、線維芽細胞集団が希釈するまで培養しました。E14細胞の多能性は、アルカリホスファターゼ染色により確認されました。分化後、胚体は丸い形をしており、サイズが絶えず大きくなりました。10日目までに、ニューロンに分化する神経前駆細胞は、細長い細胞形状をしていました。免疫蛍光実験は、8日目に神経前駆細胞に対して、12日目にニューロンに対して行った。神経前駆細胞のネスティング、およびニューロンのニューロフィラメントの陽性染色が観察されました。Sox1プロモーター駆動型GFPレポーターを発現するマウス胚性幹細胞株を分化させ、胚性幹細胞と神経前駆細胞に対してフローサイトメトリーを行った。NPC期の全細胞の58.7%がGFP陽性であり、ESC期の細胞は0%がGFP陽性であることがわかりました。E14胚性幹細胞、胚様体、神経前駆細胞に対してRNA配列実験を行いました。RNA配列ヒートマップの遺伝子は、その発現レベルに基づいてソートされました。4つの遺伝子クラスターの遺伝子オントロジー解析により、それらが異なる細胞機能または経路に対応していることが示されました。このプロトコールを実施する場合、EBSは球形の黒ずんだ細胞塊として現れるはずです。EBSがこのように成長するようにするには、培地が黄色がかった色になり始めた場合は、初日に培地を交換します。EBとMPCの両方が初期胚発生の重要な段階にあるため、MPC培養でも同じアプローチが重要です。ChIPseekやニューロン分化のさまざまな段階からのクロマチン確認キャプチャーアッセイなど、他の機能的ゲノムアッセイを実施して、根底にある生物学的プロセスを理解することができます。化学的および機能的ゲノミクスアッセイによるニューロン分化プロセスの統合により、研究者は初期胚発生の分子メカニズムをより明確に理解することができます。

differentiation-characterization-neural-progenitors-neurons-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は、小分子ベースのオリゴデンドロサイト前駆細胞体（OPC）にマウス胚性幹細胞の分化のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、分化の30日間で高効率とOlig2 + NG2 +...

オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

我々は運動ニューロンにマウス胚性幹細胞のインビトロ分化の効率を改善するための新しいプロトコルを開発しました。として免疫組織化学的手法を用いてニューロンと運動ニューロンマーカーの発現によって証明機能を分化したES細胞は運動ニューロンを取得しました。...

運動ニューロンにマウス胚性幹細胞の効率的な分化

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ヒト胚性幹細胞の神経前駆細胞への分化

このビデオでは、マウス胚性幹細胞(mESC)から神経前駆細胞(NPC)をin...

マウス胚性幹細胞から神経前駆細胞を作製する技術

このビデオでは、神経前駆細胞をニューロンに分化させる細胞培養方法を紹介しました。成長因子を補充した栄養豊富な培地で細胞をインキュベートすることにより、前駆細胞は発達した軸索と樹状突起を持つニューロンに成熟しました。安定化剤は、細胞の生存率を確保し、分化プロセス全体を通じて酸化的損傷から保護します。...

神経前駆細胞のニューロンへの分化

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無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

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2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

このプロトコルでは、変更された胚様体-単層法を用いたマウス胚性幹細胞から皮質介在ニューロン前駆細胞と後細胞分裂の介在ニューロン前駆体を生成するためのメソッドについて説明します。これらの前駆細胞/前駆体生体外で使用することができますまたは蛍光ソート運命決定を研究するため新生児大脳新皮質に移植や治療への応用で使用されます。...

マウス胚性幹細胞の皮質介在ニューロン前駆細胞への分化

E13マウス胚神経節隆起から顕微鏡下神経幹細胞の分離法を紹介します。...

マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養

ここで提示するプロトコルは、ヒト胚性幹細胞の単細胞培養の生成とその後の神経前駆細胞への分化のためのプロトコルである。プロトコルは、シンプルで堅牢でスケーラブルで、薬物スクリーニングや再生医療用途に適しています。...

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

ここでは、低コストで使いやすい方法を確立し、胚性幹細胞からニューロンへの迅速かつ効率的な分化を導く方法を確立しました。この方法は、研究室間で普及に適しており、神経学的研究のための有用なツールとなり得る。...

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

学ぶマウス胚性幹細胞から神経細胞への分化プロトコル。ハンギングドロップ法を用いた神経前駆細胞の誘導と、RT-qPCR・免疫蛍光・フローサイトメトリーによる多角的解析手法を解説する。

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

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