Name: 大規模混合ステージ カエノハブディティス・エレガンス集団の 文化とアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学ぶ大規模培養プレートを用いたCaenorhabditis elegansの大量集団培養法。スポット漂白とM9溶液回収、フローサイトメトリー解析により、オミクス研究のための約240万匹の安定した集団を確立する手法です。

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エイーソンラボのメンバーに、この原稿に関する有益な議論とフィードバックに感謝します。特に、B.Mガルシア。いくつかの株は、研究インフラプログラムのNIHオフィス(P40 OD010440)、およびNSFリビングコレクションCSBR 1930382によって資金提供されているCeNDRによって資金提供されているCGCによって提供されました。この作業は、NIH(U2CES030167)からの助成金によって支えられていました。

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著者らは開示するものは何もない。

LSCPとして様々な容器を使用することができます。このプロトコルでは、標準的なガラス焼き皿が使用されました。使用されているLSPCは外側の寸法が35.56 x 20.32 cm、内径は27.94 x 17.78 cm、深さは約4.45cmで、蓋を取り付けました。したがって、ここで使用される細菌の量は、混合ステージワームの大規模な集団を生み出すために上記の寸法を有するLSCPのために最適化されています。細菌の体積および濃度は実験の必要性に合うように調節することができる。
LSCP法の任意のステップでカビ、真菌、または他の細菌源による汚染が発生する可能性があるため、サンプルを慎重に処理します。プロトコルの任意のステップを開始する前に、作業スペースは70%エタノールと10%漂白剤で洗浄されていることを確認してください。可能であれば、30分間UV光で使用領域を扱い、各ステップを開始する30分前にHEPAエアフィルターをオンにします。
制御された設定(すなわち、20°Cに設定されたCT室)でLSCPを成長させることによって、ユーザーはより容易にサンプルの成長を追跡し、潜在的な汚染を文書化することができる。LSCPの表面が汚染された場合は、可能な限り汚染を切り取り、汚染を制御できない場合はサンプルを成長させたり捨てたりします。汚染に迅速に対処して不要な成長を減らし、リソースのワームを上回らないようにすることが不可欠です。
この方法は 、C.エレガンスの大規模な混合人口文化を成長させたい人のためのものです。市販のペトリ皿や液体培養で行われているようにLSCP上のワームの同期集団を成長させることは可能かもしれないが、著者らはこの選択肢をテストしていない。さらに、ユーザーが特定のサンプルで平均で約 240 万個以上のワームを増殖させたい場合は、別の方法を推奨します4.成長の成功は、パイプラインで処理される負担に依存します。著者らは 、15C.エレガン 株の少なくとも5つの生物学的複製において約240万匹のワームの集団を正常に成長させることができ、この方法が堅牢であることを示した。
実験を開始する前に、特定のワームの年齢と健康は、胎児性とその後の人口増加時間に影響を与えることができることに注意してください。このパイプラインで使用する前に、最小限のストレスでワームが健全な状態で維持されるようにしてください。ストックサンプルは、時間の経過とともに遺伝的ドリフトを低減するために、生成され、凍結され、-80°Cに保たれていることを前提としています。
特定の実験のニーズに応じて、LSCP上の開始グラビッド成人の数を変更することができます。LSCP上の開始グラビッド成人の数を変更すると、成長率が変化し、収穫までの時間が変わります。5人のグラビッド成人は、次の理由で各LSCPを播種するために使用されます:(1)一度に多くの C.エレガン 株をLSCPに播種する簡単で迅速で効率的な方法が必要であり、(2)成長不均一性につながる可能性のある選ばれたグラビッド成人の年齢差を減らすために必要でした。
この方法により、ユーザーは、すべてのライフ サイクル ステージが存在するワームの大規模な集団を収穫することができます。現在の方法が利用可能な場合 、C.エレガンス の大規模なサンプルを収集するには、下流の作業に必要なワームの数を得るために漂白剤の同期が必要です。このアプローチを考えると、漂白同期や複数の処理ステップに関連する困難なしに、発酵槽や大規模な液体培養でこれまで可能な限り多くのワームを成長させることができます。当社のプロトコルにより、目的の株を効率的にターゲットにし、サンプル自体を成長させる際に最小の処理時間を使用し、下流パイプラインで必要に応じてワームまたは集団の段階を分離することができます。
LPFCは、特定のLSCPにおける人口分布と規模を文書化するためのツールとして利用されました。LPFCは、ワームのサイズ(TOF)と光密度に基づいてワームを分析、ソート、ディスペンスする連続的なフローシステムです。所定のワームがフローセルを通過すると、軸方向の光損失検出器は、ワームが通過するのにかかる時間の長さのために488 nm-固体レーザーによって遮断された信号光の量をキャプチャし、ユーザーにワームのTOFと光学密度を与えます。蛍光コレクション光学および検出器はまた、各サンプルの蛍光感受性および収集を最大にするために利用することができる。LPFCコレクションパラメータは計測器によって異なります。ユーザーは、さまざまなプラットフォームを使用してワームのサイズをキャプチャでき、LPFC が使用できない場合はこのプロトコルを使用する場合に限定されません。
著者らは、液体クロマトグラフィー(質量分析、NMR分光法、RNAシーケンシング)を介して 、C.エレガン スの様々な株中の未知の代謝産物を同定するために、ここで説明した方法で栽培されたサンプルを使用している。著者らは、このパイプラインを使用して新しい株を容易に処理できるため、さまざまな C.elegans 株を含むこのパイプライン内のサンプルの増殖にこの方法を引き続き使用する予定である。

C.エレガンスは、自然の生息地の様々な世界中で発見された小さな自由に生きている線虫1です。その相対的な成長の容易さ、速い生成時間、再生システム、および透明な身体は、発達生物学、老化、神経生物学、および遺伝学2、3で広く研究されている強力なモデル生物を作る。C.エレガンスの豊富な研究は、特定の生物における複雑な生物学的成分とその関係との間でフェノタイプを包括的に結びつけるため、-omics研究で使用する最有力候補となる。
C.エレガンスを共同-omics研究に使用するには、単一のサンプルを分割し、比較分析のための多様なプラットフォームや機器に使用できる動物の大規模な混合ステージ集団を生成する方法が必要です。このようなサンプルを生成するパイプラインを作成するには、食事、環境、ストレス、人口構造、サンプルの取り扱いと収集に対する鋭い意識が必要です。そのため、標準的で再現可能な培養条件を大規模パイプラインに統合することが重要です。C.エレガンスの研究では、2つの伝統的な方法がワームを培養するために使用されている - 寒天ペトリ料理と液体培養4.
歴史的に、大量のC.エレガンが必要な場合、それらは液体培養4で栽培されている。液体培養中に大量のワームを生成するステップは、多くの場合、過剰な成体のキューティクルを破裂させ、所望の集団サイズを達成するために胚を放出する漂白剤の同期を含む複数の処理ステップを必要とする。しかし、漂白剤の同期を使用する場合、人口増加は国勢調査の開始サイズに依存し、その後の増加と人口数に影響を与えます。さらに、C.エレガンス株は、そのキューティクル感受性、暴露時間、および漂白剤同期に対するストレス応答が異なり、一度に多くの株を一度に5、6、7、8、9でアッセイすることが困難になる。
さらに、液体培養におけるワームの増殖は、多世代にわたって増殖すると過密状態が容易に発生し、食物10の存在にもかかわらずダウアー形成につながるため、収穫前に1世代のワームのみを増殖させることが推奨されることが多いため、数世代の移送ステップが必要である。ダウアー形成は、アスカロシドのような小さなシグナル伝達分子を介して起こり、しばしば「ダウアーフェロモン」11、12、13、14と呼ばれ、液体培地中に放出され、集団の成長に影響を及ぼす。さらに、液体培養でのワーム集団の増加は、培養中に過剰な細菌蓄積を引き起こし、下流の表現型アッセイにきれいなサンプルが必要な場合に困難を生み出す。最後に、液体培養が汚染されると、真菌胞子や細菌細胞が培地15全体に分散しやすいように維持することがより困難である。
C.エレガンスを栽培するもう一つの伝統的な方法は、寒天ペトリ料理にあります。市販のペトリ皿は、液体培養物に見られるように過密と高いダウアー形成の急速な影響なしに混合ステージワームの複数の世代を容易に成長することができます。しかし、伝統的な寒天ペトリ皿のワーム増殖の欠点は、最大の市販のペトリ皿が漂白剤同期ステップに加えずに-omics研究のために大きなワーム集団を生み出さないことです。要約すると、寒天ペトリ皿にC.エレガンスの混合ステージ集団を培養することは、-omicsデータを収集するのに適していますが、液体培養なしに非常に大きな集団を生成する方法が必要でした。
ここでは、大規模な培養プレート(LSCP)上で大規模な混合ステージC.エレガンス集団を培養および収集する方法を紹介する。このパイプラインを通じてサンプルを収集すると、オミックス実験に必要なデータ(ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクスなど)と共に、フェノミスティックおよび母集団データを収集するのに十分なサンプルが得られます。さらに、LSCP法は、動物の最小限の操作、より少ないユーザーの準備時間を必要とし、厳しい環境制御を提供し、全体的な再現性のための研究全体で各サンプルの取り扱いが一貫していることを保証します。

<table><tbody><tr><td>10 mL 滅菌血清学的ピペット</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>10 ulピペットチップ</td><td>VWR</td><td>89079-438</td><td></td></tr><tr><td>100 ul ピペットチップ</td><td>VWR</td><td>89079-442</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL 目盛りシリンダー</td><td>VWR</td><td>10124-380</td><td></td></tr><tr><td>1000 ulピペットチップ</td><td>VWR</td><td>89079-488</td><td></td></tr><tr><td>15 mL円錐形チューブ</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>190プルーフエタノール</td><td>VWR</td><td>89125-166</td><td></td></tr><tr><td>2リットル ワイドネック アーレンマイヤーフラスコ</td><td>VWR</td><td>75804-654</td><td></td></tr><tr><td>50 mL円錐形チューブ</td><td>VWR</td><td>75874-294</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>シグマ</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>シグマ</td><td>A9539-500G</td><td></td></tr><tr><td>BVCコントロールG液体吸引システム</td><td>バキューブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>シグマ</td><td>C3045-25G</td><td></td></tr><tr><td>クロロックス漂白剤</td><td>VWR</td><td>89414-502</td><td></td></tr><tr><td>コンビロン制御温度室</td><td>コンビロン</td><td></td><td>https://www.conviron.com/environmental-rooms</td></tr><tr><td>Corning Low Volume 384 ウェルブラック、クリアフラットボトムのポリスチレンTC処理マイクロプレート</td><td>VWR</td><td>89089-866</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャー・サイエンティフィック アクスピン 3R</td><td>フィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フラットボトム24ウェルプレート</td><td>VWR</td><td>29443-952</td><td></td></tr><tr><td>ハネウェル True HEPA 清浄機 465平方フィート</td><td>ホームデポ</td><td>204390560</td><td></td></tr><tr><td>HT115 <エム>大腸菌(DE3)</td><td>CGC</td><td>HT115(DE3)</td><td>https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)</td></tr><tr><td>キムワイプズ</td><td>VWR</td><td>470224-038</td><td></td></tr><tr><td>大規模培養プレート(LSCP)</td><td>パイレックス</td><td>1090948</td><td>パイレックス2クォートガラス製ベーキングディッシュ(赤い蓋付き)</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>シグマ</td><td>C86677-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR</td><td>97062-998</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡プレーンスライド</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>ミリポアフィルター</td><td>ミリポール</td><td>1.11727.2500</td><td></td></tr><tr><td>分子デバイス ImageXpress</td><td>分子デバイス</td><td>モデル番号:IXMコンフォーカル</td><td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref、著者はMetaXpressソフトウェアバージョン6.5.4.532を使用していました。</td></tr><tr><td>ナイスタチン(10mg/mL)</td><td>シグマ</td><td>N6261-25MU</td><td></td></tr><tr><td>ペプトン</td><td>シグマ</td><td>P7750-100G</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿(6cm)</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>ピペットコントローラー</td><td>VWR</td><td>613-4180</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャー</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム単塩基</td><td>VWR</td><td>0781-500G</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>フィッシャー</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>赤色蛍光微小球</td><td>ポリサイエンス</td><td>19507-5</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>746398-500G</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td>111357</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性ナトリウム無水</td><td>フィッシャー</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>標準ギルソンピペットセット</td><td>ギルソン</td><td>FA10002M、FA10004M、FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン(100mg/mL)</td><td>シグマ</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>ユニオンバイオメトリカCOPAS BioSorter</td><td>ユニオンバイオメトリカ</td><td></td><td>https://www.unionbio.com/biosorter/、著者が使用した:Flow Pilotソフトウェアバージョン1.6.1.3。</td></tr></tbody></table>

大規模混合ステージ カエノハブディティス・エレガンス集団の 文化とアッセイ

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

カエノハブディティス・エレガンス(C.エレガンス)は、発生生物学、老化、神経生物学、遺伝学を研究するための貴重なモデル生物であり続けています。C.エレガンスの大きな研究体は、複雑な生物学的成分と別の生物との関係を解剖するために、大規模な動物全体の研究に統合する理想的な候補になります。C.エレガンスを共同-omics研究に使用するには、比較分析のために多様なプラットフォームで単一のサンプルを分割してアッセイできる動物の大量集団を生成する方法が必要です。
ここでは、大規模な培養プレート(LSCP)とその後の表述法データ上に豊富な混合ステージ C.エレガン 群集団を培養および収集する方法を提示する。このパイプラインは、オミックス実験に必要なデータ(ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクスなど)と共に、フェノミクスおよび集団データを収集するのに十分な数の動物を産み出します。さらに、LSCP法は動物自身への操作を最小限に抑え、ユーザーの準備時間を減らし、厳しい環境管理を提供し、各サンプルの取り扱いが全体的な再現性のために研究全体で一貫していることを保証します。最後に、所定のLSCPにおける C.エレガンス のライフステージの母集団規模および人口分布を文書化する方法が提示される。

LSCP法を用いたC.エレガンスの成長は、12.2日間にわたってサンプルあたり平均約240万個の混合ステージワームを生み出す。LSCP法を用いたC.エレガンスの成長により、動物の取り扱いと操作が少なく、C.エレガンスの大規模な混合ステージ集団を生成することができ、これは大規模なオミックス研究に最適です(図1)。LSCPが成虫のワームでいっぱいになり、人口規模が大きく、細菌が最小限に抑えられると、ユーザーは収穫して人口規模を推定できます。この点は、母集団が -omics パイプラインで使用するのに十分かどうかを評価することによって品質管理としても役立ちます (図 2)。集団動態は、株自体、株の挙動(すなわち、穴あけ菌株は、より低いワーム回復を有する傾向があった)、および成長の成功(すなわち、汚染)に依存する。LSCP法は、カエノールハブディティス遺伝学センター(CGC)変異体とカエノハブディティスエレガンス自然多様性資源(CeNDR)野生株25の混合物を含むC.エレガンスの15株について試験した。ひずみ遺伝子型は補足表3に記載されています。
LSCP法は、人口規模が約94,500から9,290,000に増加しました。基準株内の平均母集団サイズPD1074、及び株間の平均集団サイズは約240万ワームであった(図3)。平均12.2 LSCP増殖日数の間にC.エレガン株間の推定人口サイズに有意な差は認められなかった(図4)。PD1074 LSC は、完全な混合ステージ人口に成長するのに 10 ~ 14 日かかりました。PD1074全体の平均成長時間は10日であった。最も遅い成長株は最大20日間成長し、最も急速に成長している株は最低10日間成長した(図4)。
したがって、このLSCP法を使用すると、ユーザーは、発達のタイミングと背景の専門知識をほとんど知らない研究に興味のある新しい株を簡単に統合することができます。摘み取りによって維持されなければならない株および形型は、胎児性の欠陥を有し、異種性である、または成長欠陥を有するこのパイプラインではうまく機能しない可能性があることに注意してください。
大粒子フローサイトメトリーとサンプルのイメージングにより、人口分布を文書化できます。 多種多様なプラットフォームを使用して、人口増加の成功を測定できます。
再現性のある -omics 測定では、一貫した培養を行うことが重要です。培養再現性の指標は、特定の菌株に対するワーム数と一貫したサイズ分布です。我々は、参照株のサンプル分布を示す, PD1074 – 元のN2ブリストル株の変種, LPFC23,26と成長成功のためのプロキシとしてマイクロ共焦点顕微鏡画像を使用して.LPFC分布(図5)でL1段階からグラビッド成体までワームを測定し、その後のイメージング(図6)、およびサンプル全体の人口分布の変動(図7)を用いて、このパイプラインがC.エレガンスの混合ステージ集団を生成したことがわかります。
混合ステージサンプルの母集団分布を詳しく見るために、飛行時間(TOF)全体にわたって各領域内に入るワームの割合(すなわち、体長)分布(図7A,B)を見て、35のPD1074 LSCの分布を見ました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig01.jpg"> 図 1: LSCP ワームの拡張パイプラインの概要(A) ラボで受け取ると、すべての菌株を調製し、-80°C2で長期保存のために凍結した。(B)冷凍ワームストックから「マスターチャンク」プレートを用意し、15°Cで保存し、1ヶ月以内に使用した。(C)各サンプルは、LSCPで成長する前に世代間ストレスを軽減するために、4つの連続したチャンクステップを経た。(D) 5人のグラビッド成人をステップ(D)の「チャンク4」6cmプレートから選び、LSCPの5つの所定の領域で漂白したスポットを採る。(E) LSCPは制御温度室に置かれ、LSCPが成虫の虫でいっぱいになるまで20°Cで成長し、人口規模が大きく、残された細菌は最小限であった。(F) ワーム集団は、下流のステップのために収集され、収集された。(G) アリコートは LSCP から作成され、下流の目的のアプリケーション用にフラッシュ凍結された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig02.jpg"> 図 2: LSCP の収穫と人口規模の推定の概要(A)50 mLのM9を使用して、NGMA表面からワームを洗浄した。ウォーム懸濁液を50mL円錐管に配管した。工程(A)を2回繰り返した。(B)15 mLのウォーム懸濁液を新しい15 mL円錐管に注いだ。ワームは遠心分離機によってペレット化された。M9+破片は、虫ペレットを乱さずに吸引した。ステップ(B)は、150mLのワーム懸濁液すべてを回収するまで繰り返した。(C)虫ペレットを洗浄し、M9で3回遠心分離し、残りの残骸を除去した。サンプルがクリーンになったら、10 mLのddH2O. (D) サンプルの連続希釈を作成して、ワームの母集団サイズを推定するために、そのサンプルペレットを再懸濁した。ワームを正確に数え込む希釈係数を使用しました。使用される希釈係数はLSCPの母集団サイズによって変化した。(E) 希釈因子が選択されると、その希釈の3つのアリコート複製からのすべてのワームがきれいなスライドにパイプされ、ワームは解剖顕微鏡の下で数えられた。(F)サンプルは適切なサイズのアリコートに分割された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig03.jpg"> 図3:平均240万個の混合ステージワームで生成されたLSCP法。LSCPは、人口増加の最小人口規模は約94,500人で、人口増加率は約9,290,000人と最も大きい。すべての株にわたる平均人口の大きさは240万ワームであった。C.エレガンス株名の下のバーは、株がCGC変異体であるかCeNDR自然分離物であるかを示す。LSCP サンプルサイズは、ひずみごとに表示されます。TukeyのHSDテストを使用してすべてのペアの比較を行いました。C.エレガンス株(F(14,108)=0.7,p = 0.77)にわたる推定集団サイズ間では有意な差は認されなかった。色付きのバーは、それぞれのC.エレガンス歪み表現の標準カラー表示を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig04.jpg"> 図4:LSCP法は、10~20日間でワームの混合ステージ集団を大量に生成した。与えられたC.エレガンスLSCPは、サンプルが成虫の虫でいっぱいになるまで成長し、大きな人口に達し、最小限の細菌の芝生が残っていました。LSC は、負担に応じて、完全な混合ステージの人口に成長するのに 10 ~ 20 日かかりました。株全体の平均成長時間は12.2日であった。LSCP サンプルサイズは、ひずみごとに表示されます。各誤差範囲は、平均から1標準偏差を用いて構築した。同じ文字で接続されていないレベルは大幅に異なります。TukeyのHSDテストを使用してすべてのペアの比較。C. エレガンス株(F(14,108) = 8.8,p <0.0001*全体で必要なLSCPの成長時間の大きな違いが見つかりました。色付きのバーは、それぞれのC.エレガンス歪み表現の標準カラー表示を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2.jpg"> 図5:野生型の基準株PD1074の混合集団と増殖測定。野生型の基準株の1つのLSCP成長の代表的なLPFC分布、元のN2ブリストル株の変種、(PD1074)は、混合ステージ集団のサイズ分布および事象数を文書化する。X 軸は、ソートされたワームの長さ (飛行時間、TOF) を表示します。y軸は、ソートされたワームの光学密度(光学的な絶滅、EXT)を表示します。各データ ポイントは、サンプルに記載されたワームです。画像解析に使用された各 TOF 領域は、異なる色で表示されます。TOF 領域が 20 個 (R2 ~ R21) に 20 個作成され、TOF は 50 ~ 2050 に及ぶ。各 TOF 領域の詳細は補足表 1 を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig06.jpg"> 図 6: R2 から R12 までの TOF 領域から分類されたワームのイメージは、PD1074 LPFC 分布を示しています。領域R2では、L1ワームを同定することができ、領域R9では主にグラビッド成人が同定され、2つの発達幼虫の極端にまたがり、分布における段階が予想される場所の流細胞計分布内のおおよその領域を与える。スケールバーは1mmを表します。代表画像は 図5に示すLPFC分布から撮影され、色付きのボックスは 図5の領域に対応している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig07.jpg"> 図 7: 野生型参照株 PD1074 における飛行時間 (TOF) 領域全体の母集団分布。ワームが発見された地域を示す TOF 領域全体にわたるワームの配布。各 PD1074 LSCP は、個別の色として表されます。(A) X 軸は、LSCP について観測およびカウントされた 20 の TOF 領域 (R2 ~ R21) を示し、全体のサイズ分布を表示します。y 軸は、所定の TOF 領域に入ったボディ サイズを持つ、与えられた LSCP からのワームのパーセントを示します。(B) ワーム集団の小さな割合がR7-R21領域の間に入ると、各領域内に入ったワームの割合のログが、人口分布を表示するために取られた。X 軸は R7-R21 TOF 領域を表示します。y 軸は、所定の TOF 領域に入ったボディ サイズを持つ、与えられた LSCP のワームのパーセントのログを表示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:LSCPが成長して処理された成長条件の平均日次温度(°C)。制御温度(CT)室の報告された温度は、サンプルの成長および採取の6ヶ月のスパンを通して文書化され、収集された。1日の平均気温はここで報告されます。プロジェクト期間中にLCSPが成長した温度間に有意な差は認められなかった(F(5,24) = 2.59,p = 0.0524)。 全体の温度差は、サンプルの成長と生成の6ヶ月間にわたって0.003 °C以下に及びました。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453supfig01.jpg" target="_blank">こちらをダウンロードしてください。</a>
補足表1:画像処理のためにワームを384ウェルプレートに分類するために使用されるTOFゲート領域。 ビン分割された領域は、50 ~ 2050 の TOF ディストリビューション全体で 100 の TOF にまたがって作成されました。ゲート領域は、ニーズに合わせて変更および最適化できます。画像解析に使用された各 TOF 領域は、異なる色で表示されます。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table1_FINAL.xlsx" target="_blank">こちらの表をダウンロードしてください。</a>
補足表2:TOF領域の384ウェルプレートテンプレートと複製レイアウト。 すべてのサンプルは、イメージング用の384ウェルプレートに選別されました。並べ替え用に選択したリージョンごとに 4 つのレプリケートが作成されました。ゲート領域は、ニーズに合わせて変更および最適化できます。このプロトコルで作成および使用される特定のゲート領域については、補足表 1 を参照してください。画像解析に使用された各 TOF 領域は、異なる色で表示されます。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table2_FINAL.xlsx" target="_blank">こちらの表をダウンロードしてください。</a>
補足表3:このプロトコルで使用 されるC.エレガン株 は、CGC株とCeNDR株の混合物を含む。 ひずみ、遺伝子型、ひずみソース、および詳細をこの表に記載します。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table3_FINAL.xlsx" target="_blank">こちらの表をダウンロードしてください。</a>

オミックス研究でカエノハブディティス・エレガンス(C.エレガンス)を使用するには、比較分析のためにプラットフォーム間で1つのサンプルを測定できるワームの集団を大量に生成する方法が必要です。ここでは、大規模な培養プレート(LSP)上でC.エレガン群集団を培養し、人口増加を記録する方法を紹介する。

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この手法により、大規模なワーム集団を収集し、最小限の操作で複数のオミクスプラットフォームに使用できます。この技術により、複数のオミクス実験で混合ステージC.elegans集団を収集し、各サンプルの全体的な画像を得ることができます。大規模な培養プレートにグラビッド大人のスポット漂白のために、ブンゼンバーナーの上にワームピックを炎上し、細菌の芝生の端から大規模な培養プレートに新鮮な大腸菌をすくうためにピックを使用しています。スポット漂白のための4番目のチャンクプレートから単一のグラビッド大人を選び、大腸菌の芝生から離れた大規模な培養プレートの一角に作りたてのアルカリ次亜塩素酸溶液の5マイクロリットルを追加します。肉体の大人をアルカリ性次亜塩素酸溶液に入れ、線虫をタップしてキューティクルを破壊し、卵を放出します。合計5人の大人が同じように大腸菌の芝生の周りに均等に置かれている場合は、蓋をプレートに戻します。大規模な培養プレートからサンプルを収穫するには、50ミリリットルのM9溶液を1つの大規模な培養プレート表面に注ぎ、プレートを旋回して、M9が線虫増殖培地アガロース表面全体を覆うことを確認します。M9と無菌血清ピペットをプライムし、M9とワームの集団がプレートの一角に集まるようにプレートを傾けます。プライミングされたピペットを使用してワーム懸濁液を吸引し、ワームを50ミリリットルの円錐チューブに追加します。細菌の塊や破片を破壊するためにロッカーの上にチューブを置きます。すべてのワームが3つのプレートすべてから採取されたら、各チューブから15ミリリットルのワームを3つの15ミリリットルの円錐形チューブのそれぞれに移し、遠心分離によってチューブ内のワームを沈下します。慎重にワームペレットを乱すことなく上清を吸引し、各チューブにワーム懸濁液の13ミリリットルを追加します。ペレットを再中断し、できるだけ多くの細菌や破片を洗い流し、再びワームを遠心分離するためにチューブを反転させます。各ワーム集団が収集されたら、洗浄ごとに新鮮なM9溶液の10ミリリットルでワームペレットを3回洗浄します。最後の洗浄後、洗浄した各ワームペレットを10ミリリットルの二重蒸留水で再び中断します。母集団サイズ推定では、各チューブから100マイクロリットルのワームサンプルの3つの100マイクロリットルのアリコートをサンプル当たり900マイクロリットルのM9溶液で素早く希釈し、そのアリコートを使用して連続希釈を行います。ストックワームサンプルサスペンションをロッカーに置き、アリコートが数えられている間に培養物を連続的に動かし、均質になるまでワーム希釈液を混ぜます。最初の1~10個のワームサンプルから5マイクロリットルの溶液をガラス顕微鏡スライドに加え、光顕微鏡でワームを数えます。サンプルに 50 個未満のワームがある場合は、1:100 と 1:1,000 の希釈液を数えます。50 を超えるワームがある場合は、次のシリアル希釈に移動します。各希釈の各アリコート複製を3回数えた後、希釈数を平均して、ワームの推定母集団サイズを決定する。その後、ワームサンプルを適切な実験アリコートに分割し、フラッシュはマイナス80°Cの貯蔵のために液体窒素中のサンプルを凍結します。大粒子流サイトメトリー用のワームサンプルを調製するには、M9溶液の最終体積に約5倍の10〜第4混合段階ワームアリコートを希釈し、1ミリリットルの大腸菌あたり1ミリグラムの200マイクロリットルと0.5マイクロモル赤蛍光マイクロスフェア溶液の1:50希釈液をワームサスペンションに加える。ロッキングで室温で20分間インキュベーションした後、遠心分離によってワームと微小球を収集し、新鮮なM9溶液でワームを2回洗浄して、余分な細菌と非内部化された微小球を除去します。2回目の洗浄後、ペレットをM9溶液5ミリリットルで再懸濁する。ペレットがきれいに見える場合は、ワームに50ミリモルモルナトリウムアジドを加えたM9の5ミリリットルを追加し、ロッカーにチューブを置いて正確なカウントとサイジングのためにワームをまっすぐにし、安楽死させる。人口分布のドキュメントでは、校正された384ウェルプレートテンプレートを開き、20個のゲートオブジェクトを4つのウェルに分配し、サンプルの20のバー領域ごとに各ゲート領域の4つの技術的複製を取得するようにテンプレートを設定します。40ミリリットルのワームサンプルを大きな粒子フローサイトメーターに積み込み、サンプルを連続的に攪拌しながらサンプルの選別を自動的に開始し、サンプルからサンプルのオブジェクトを調整された384ウェルプレートに落ち着かせ、同時に分配するのを防ぎます。サンプル全体をソートし、ゲート領域の最大数を384ウェルプレートに分配したら、サイトメーターからサンプルを取り出し、器具を洗浄します。大規模な培養プレート法は、カエノハブディティス遺伝学センター変異体とカエノハブディティスエレガンス自然多様性資源野生株の混合物を含むC.Elegansの15株で試験した。この分析では、大規模な培養プレート法により、人口規模は約94,500から9,290,000程度の値を得た。参照株PD1074および株全体における平均集団サイズは約240万ワームであった。C.elegans株間の推定人口サイズには、平均12.2の大規模な培養プレート成長日の間に有意な差は見つからなかった。PD1074大規模培養プレートは、12.2日の平均成長時間で完全な混合段階の集団に成長するのに10〜14日かかりました。最も遅い成長株は最大20日間成長し、最も急速に成長している株は最低10日間成長した。PD1074のこのサンプル分布では、大粒子フローサイトメーター上でL1段階からグラビッド成体を通してワームを測定した。その後のイメージングとサンプル間の母集団分布の変動の視覚化は、パイプラインがC.elegansの混合ステージ集団を生成することを明らかにした。サンプル コレクション全体でワームを正確にカウントして、成長と調査で比較可能なデータを取得することが重要です。この収集アプローチは、RNAシーケンシング、ゲノミクス、その他のオミクス分析に適用して、C.elegans集団内で起こる複雑なダイナミクスに対する理解を深めることができます。この技術により、複数のオミクス実験で混合ステージC.elegans集団を収集し、各サンプルの全体的な画像を得ることができます。

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