Name: 脊髄損傷後のマウスにおける膀胱の分子解析のための単一細胞解離アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学ぶ脊髄損傷後のマウス膀胱の単一細胞解離法。高生存率の細胞懸濁液を調製し、フローサイトメトリーによる細胞集団解析を可能にする。細胞動態の理解と下流解析への応用に有用な手法です。

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この研究は、国立衛生研究所(R01 DK077195からR.M.A、R01 DK104641からR.M.AおよびD.R.Bへの助成金によって支されました。血液学/腫瘍学部門、ボストン小児病院、小児科、ハーバード大学医学部、ダナ・ファーバー癌研究所のスチュアート・オーキン博士からの貴重な意見を認めます。また、カイル・コスタがマウスの術後ケアを受けた場合、メアリー・タリアエンティ博士とハビバラ・ショジャイサーディ博士(ヤン・シ研究所博士、小児科、新生児医学部、小児科、新生児医学部、ボストン小児病院、ハーバード大学医学部)の技術支援と有益な議論に対する支援を認める。

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</ol>

利益相反は宣言されていません。

ここで説明するマウス脊髄損傷モデルは、膀胱収縮と外尿道括約筋弛緩との間の協調性の喪失による機能的な膀胱出口閉塞を作成する再現性のある方法を提供する。これは、尿路上皮および平滑筋コンパートメントの拡張を特徴とする傷害の早い時期に膀胱壁の深い改造を呼び起こす。げっ歯類のSCIモデルの実装における重要なステップには、(i)損傷後10\u201214日続く脊髄ショックの期間中の手動膀胱発現への厳格な注意が含まれる。(ii) 減量を最小限に抑える栄養豊かさ;(iii)特に反射的な空虚の復帰を超えて広がる実験のために尿のスケーリングの可能性の軽減。このモデルの制限には、一過性血尿中の血栓からのマウスの尿道閉塞の可能性、および手術後の逆行性射精後の精液凝固からの雄マウスの可能性が含まれる。
ここで説明する組織解離アプローチは、実験的侮辱から生じる組織の構造変化を考慮することの重要性を示している。単一細胞分析の増加に伴い、遺伝子発現に見られる違いは、単に解離誘発摂動の結果ではなく、疾患モデルに関連する根本的な生物学的変化を真に代表することが重要です。一般に公開されている発現データを使用することで、消化バッファーの配合を変更して、生存率を最大化しながら細胞外マトリックスの効果的な消化を確保することができました。将来のアプリケーションで考慮され得る追加の修正は、放放基菌Dの添加を含む、解離プロトコル15に敏感である即時初期遺伝子の転写を停止する。
ピペット技術は、組織を解離したり、すでに懸濁状態にある細胞を移す際に重要です。剪断力による細胞への物理的損傷を軽減するには、細胞の再懸濁時に穏やかにゆっくりとピペットすることが重要です。一般的に、広孔ピペットチップを使用することをお勧めします。標準的なヒントを使用する場合、そうでなければ細胞を損傷するせん断力を避けるために、穏やかに細胞懸濁液をピペット細胞懸濁液することが特に重要です。しかし、このプロトコルでは細胞ストレーナーを使用することは避けられませんが、細胞濃度は20%以上低下し、100μL以上の体積損失を伴います。正確な細胞数を確保するために、緊張した後に細胞濃度を決定することをお勧めします。
フローサイトメトリーでは、FMOコントロールは、重複する放出ピークからの信号のブリードスルーによるバックグラウンドの尺度を提供します。それらは、非特異的抗体結合の尺度ではなく、抗体がそのチャネルに含まれるときに存在し得るバックグラウンド染色である。非特異的抗体結合を説明するには、適切なアイソタイプコントロールを含める必要があります。背景染色の場合、負のコントロールを含める必要があります。これらのコントロールを組み合わせることで、細胞集団の正確な測定が保証されます。

正常な膀胱機能の摂動は、多くの個人の生活の質の低下につながることができます。傷害または疾患が正常な膀胱機能をどのように脱線させるかをよりよく理解するためには、膀胱内の細胞の正常な生物学的状態と、それらが実験的摂動の下でどのように変化するかを調べることが重要である。しかし、現在までに、尿膀胱内に存在する特定の細胞集団、およびそれらが傷害によってどのように変化するかを完全に特徴づけられてきた。
フローサイトメトリーや単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)などの単細胞プロファイリング法は、膀胱内の特定の細胞タイプに光を当てる可能性があります。しかし、これらのアプローチが有益な組織となるには、収穫された組織の生存率、遺伝子発現、および代表的な細胞集団の割合に影響を与えない方法で消化されなければならない。酵素分解を採用するプロトコルは、無差別プロテアーゼ活性1を介して表面マーカー発現に影響を与え、それによってフローサイトメトリーによる細胞同定に影響を与える一方、解離プロセス自体は、Van den Brinkと同僚2が最近述べたように、即時初期遺伝子の誘導につながる可能性がある。著者らは、解離に影響を受けた亜集団は小さいが、即時初期遺伝子の発現レベルが高いため、バルク発現研究で強い汚染シグナルを引き起こす可能性があることを示した。さらに、解離プロトコルの影響を受けた持続時間は、いくつかの亜集団に固有であることが示された遺伝子のバルク発現レベルを検出した。したがって、解離プロトコルの影響を考慮せずに生成された単一細胞データセットは、基礎生物学とは対照的に、解離法から生じる遺伝子発現変化をもたらす可能性がある。これらの観察は、公開された単一細胞転写法データは慎重に解釈されるべきであり、結果は独立した方法によって検証されるべきであることを示唆している。
しかし、過酷で長い解離方法は、細胞2の遺伝子発現を変化させる可能性がある。細胞の効果的な分離は、存在する細胞型の正確な表現を得るために不可欠である。膀胱は複数の細胞タイプを含む複雑な器官であるため、尿路上皮細胞や間質細胞のようないくつかの集団は比較的過小表現され得るのに対し、線維芽細胞などの他の細胞タイプは細胞外マトリックス内に存在し、単離することは困難であり得る。膀胱が脊髄損傷3、4または膀胱出口閉塞5、6で観察されたような著しい改造および線維症を受けた場合、解離はさらに困難になる。
ここでは、脊髄損傷マウス膀胱における下流単細胞解析のための最適化された組織解離方法について述べている。フローサイトメトリーを用いて、4つの酵素消化プロトコルを比較し、単一細胞懸濁液を生成し、細胞生存率をサポートし、細胞集団の正しい割合を維持する能力を比較した。この分析に基づいて、我々は、細胞死、細胞凝集体、非細胞核酸および下流分析の潜在的な阻害剤を最小限に抑えることは、高品質のデータを達成するために重要であると結論付ける。

<table><tbody><tr><td>2.5 X 拡大ルーペ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-0 Vicryl 縫合糸、6.5mm 針 3/8 円</td><td>ETHICON</td><td>J546</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m細胞ストレーナー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>BPBSのアキュターゼ、0.5mM EDTA</td><td>ミリポア</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>エアロゾルフィルターワイドオリフィスピペッターチップ(1000 &micro;L)</td><td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>エアゾールフィルターワイドオリフィスピペッターチップ(1000&micro;L)</td><td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗マウス CD326 (Ep-CAM)、ラットモノクローナル、IgG2a、κ;、アフィニティー精製</td><td>BioLegend</td><td>118213</td><td></td></tr><tr><td>BB515 ラット抗マウス CD45、ラットモノクローナル、IgG2b、&kappa;、クローン 30-F11</td><td>BD Biosciences</td><td>564590</td><td></td></tr><tr><td>BONN マイクロ解剖鉗子、ストレート、1x2 歯、長さ 3.75 インチ、先端幅 0.3mm、歯 0.12mm</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company株式 会社。</td><td>RS-5172</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>2115-250ML</td><td></td></tr><tr><td>CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-6412</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue</td><td>Biorad</td><td>1450003</td><td></td></tr><tr><td>Cell Staining Buffer</td><td>BioLegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td></td>LS004196</tr>コ<tr><td>ラゲナーゼIII型</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004182</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ、タイプ6</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS005319</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V Alexa Fluor 488 &ヨウ化プロピジウム(PI)</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーV13241</td><td></td></tr>ディ<tr><td>スパーゼII</td><td>シグマ</td><td>D4693-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>シグマ</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>エンロフロキサシン(バイトリル)</td><td>Bayer Health Care LLC、</td><td>NADA#140-913FDAによって承認されました。ロット番号:</td><td>AH01CGP 2.27% 注射液</td></tr><tr><td>ファルコン 15 ml コニカル遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 50 ml コニカル遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>352070</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗マウス Ly-6A/E (Sca-1) 抗体、ラットモノクローナル、IgG2a、&κ;、ヒ</td>ツジ精巣由来のアフィニティー精製<td>バイオレジェンド</td><td>122505</td><td></td></tr>ヒ<tr><td>アルロニダーゼ、タイプII</td><td>Sigma</td><td>H2126</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers(100 & マイクロ;m)</td><td>ミルテニー・バイオテック社</td><td>130-110-917</td><td></td></tr><tr><td>McPHERSON-VANNAS、マイクロ解剖スプリングハサミ、ストレート、長さ4インチ、先端幅0.15mm</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-5630</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-891-7959</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003119</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 抗マウス CD19 抗体, ラットモノクローナル, IgG2a, &kappa;, affinity purified</td><td>BioLegend</td><td>115509</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5抗マウスCD3&epsilon;抗体、アルメニアハムスターモノクローナル、IgG、アフィニティー精製</td><td>BioLegend</td><td>100309</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-mouse CD4 抗体、ラットモノクローナル、IgG2b、&kappa;、アフィニティー精製</td><td></td><td>BioLegend 100409</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-mouse CD8a 抗体、ラットモノクローナル抗体、IgG2a、&kappa;、アフィニティー精製</td><td>BioLegend</td><td>100709</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 抗マウス NK-1.1 抗体、マウスモノクローナル、IgG2a、κ;、アフィニティー精製</td><td></td><td>BioLegend 108715</td><td>ダンプチャネル</td></tr><tr><td>PE/Cy5 抗マウス TER-119/赤血球細胞抗体、IgG2b、κ;、アフィニティー精製</td><td>BioLegend</td><td>116209</td><td>ダンプチャネル</td></tr><tr><td>精製ラット 抗マウス CD16/CD32 (マウス BD Fc ブロック)、ラットモノクローナル、IgG2b、κ;、クローン 2.4G2</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10X)</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysis Buffer 1x</td><td>Biolegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Screw-Cap Microcentrifuge Tubes, 1.5 ml</td><td>VWR</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automated Cell Counter</td><td>Biorad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin)</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-7216</td><td>皮膚保護剤</td></tr><tr><td>TrypLEセレクト酵素(10X)、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A1217701</td><td></td></tr><tr><td>ベトロポリシン眼軟膏</td><td>Dechra獣医製品</td><td>NADA#065-016。FDAによって承認されました。</td><td>麻酔中に目を保護する</td></tr></tbody></table>

脊髄損傷後のマウスにおける膀胱の分子解析のための単一細胞解離アプローチ

A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

我々は、眼下切裂括約筋ジシナージア、機能的膀胱出口閉塞、およびそれに続く膀胱壁改修を引き出すマウスにおける脊髄損傷の実施について述べる。損傷を受けずコントロールマウスおよび脊髄損傷マウスにおける膀胱壁の細胞組成の評価を容易にするために、高い細胞生存率をサポートし、フローサイトメトリーによる離散亜集団の検出を可能にする最適化された解離プロトコルを開発した。
脊髄損傷は、胸部脊髄の完全な切除によって生じられます。組織収穫時に、動物は深い麻酔下でリン酸緩衝生理食塩基を透過させ、膀胱はタイロードの緩衝液に収穫される。組織は、一般に入手可能な遺伝子発現データベースの尋問によって決定されるマウス膀胱のコラーゲン含有量に基づいて最適化された消化バッファーのインキュベーションに先立って細かく刻まれる。単一細胞懸濁液の生成後、細胞生存率、細胞数および特定の亜集団の評価のために、物質をフローサイトメトリーによって分析する。我々は、この方法が90%以上の生存率を有する細胞集団を生み出し、間葉系および上皮起源の細胞を強く表していることを実証する。この方法は、マウス膀胱および潜在的に他の器官における離散細胞タイプの正確な下流分析を可能にする。

手術 胸部脊髄切除の成功は、多くのパラメータの評価によって決定され、その中で最も明白なのは後肢麻痺である。動物は前肢のみを使用して動き、後肢をドラッグします。それ以外の場合は、摂食、グルーミング、覚醒を含む活動レベルは通常正常です。さらに、動物は、損傷後10〜14日で反射空隙が戻るまで、12時間ごとに研究者による手動膀胱発現の必要性をもたらす意志膀胱制御を失う。安楽死後、傷害の成功の追加徴候は、主に膀胱と体重の増加に関連し、組織のリモデリングを示す。組織学的分析は、尿路上皮および平滑筋区画3の両方の内の過形成を明らかにする。
単細胞懸濁液の調製 一般に公開された発現データを用いて、細胞外マトリックスタンパク質に対する膀胱組織の濃縮を決定し(図2)、消化ミックスの処方を知らせるために使用した。コラーゲンは膀胱壁11,12の主要成分であるため、まずMouse ENCODEプロジェクト13によって生成されたRNAプロファイリングデータセットを用いて、マウス膀胱内で最も豊富なコラーゲンを特定することを求めた。我々の分析は、コラーゲン1A1、コラーゲン3A1、コラーゲン1A2およびコラーゲン6A1がマウス膀胱内で最も豊富なコラーゲン型であることを示した(図2A)。また、Tabula Muris(マウス(Musmusculus)からの単一細胞転写体データのコンペンディウム)8を使用して、コラーゲン1、3、6およびヒアルロナンのmRNA発現レベルを決定しました。このデータにより、組織間で共有される細胞タイプの遺伝子発現を直接および制御した比較が可能になります。この分析により、これらの細胞外マトリックス成分の発現は、ウロテリウムではなく間葉系細胞タイプにおいてより一般的であることを明らかにした(図2B)。
膀胱からの単離細胞の生存可能性に及ぼす解離の影響 フローサイトメトリー分析は、4つの異なるプロトコルを用いた酵素消化が、それぞれ83%、86%、93%または90%の生存率をもたらすことを実証した。したがって、プロトコルセクション3は、細胞生存率の保存にとって最も価値があると考えられた。また、細胞の約4%が壊死的であることを観察した(PI+/Annexin V-) (図4A)。これらの観察は、消化プロトコルの効率と細胞生存率に関するその後の利益を強調する。
膀胱内の細胞の異なる集団に及ぼす脊髄損傷の影響 我々は、対照と比較してSCIマウスの膀胱における総細胞数の有意な増加を観察した。SCI膀胱から得られたドットプロットのパターンも、脊髄損傷による進行中の臓器改修と若干異なっていた(図4B:第1列)。対照と比較して、SCI動物からの膀胱はCD45陽性細胞の有意な増加を示した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg"> 図1:肝臓の明るい色での代表的な灌流完了。(A) 灌流の開始時に肝臓の色を示す。(B)は、灌流終了時の明るい肝臓色を示す。(A)中のマウスは、膀胱肥大を生じ、脊髄損傷を有していない(B)のマウスとは異なり、骨盤から突出した膀胱肥大および突出を生じる2週間前に脊髄切除を有していた。この場合、膀胱は小さく、骨盤に隠されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg"> 図2:マウス膀胱における細胞外マトリックス(ECM)成分の転写発現。(A)43種類のコラーゲンタイプの棒グラフ。この式は、100 万回のマッピング済み読み取り (RPKM) あたりのトランスクリプトのキロベースあたりの読み取りによって記述されます (データは BioProject から収集されます: PRJNA66167)14.(B) 男性と女性の解離尿膀胱サンプル(男性と女性)のプールでマイクロ流体液滴ベースの3'末端カウントから得られた細胞タイプにおける遺伝子発現のバイオリンプロット。カウントは、100万ln(CPM+1)8あたり1+カウントの自然対数を使用して、各セルに対して対数正規化された。対数を取る前に、1 CPM の疑似カウントが追加されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg"> 図3:Gating戦略及びFMO制御により、蛍光の広がりを判定する。(A) 細胞集団の選択(B) シングルトのガッティング戦略。(C)壊死細胞のガッティング、PIおよびアネキシンV抗体を用いた早期および後期のアポトーシス細胞。(D\u2012F)多色流細胞測定の模式ドットプロット(例えば、A、B、C、Dフルオロクロム+(アネキシンVおよびPI)と共役する抗体)。これは、FMO制御によって示された蛍光膜Aチャネルを用いて、染色されていない対照と比較して、抗体に広がった蛍光を示す。オレンジ色の点線は、赤で染色されていない境界と比較してFMO格数境界を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg"> 図4:膀胱内の異なる細胞タイプのフローサイトメトリー。(A) アネキシン V/PI 二重染色フローチャート.各プロトコルに使用される酵素と化学の異なる組み合わせは、対応する生存率プロットの前に表されます。これらのデータは、プロトコルセクション3で最も高い生存率を示す。(B)単一チャネルで検出されたLy-6A/E(Sca-1)およびCD326(Ep-CAM)の強度を示す代表的なヒストグラム。(C) マウス膀胱の細胞集団に対するSCIの影響上パネルは、コントロール非外科的マウスおよび下パネルから得られた3つの解離された膀胱の染色の結果を示し、SCIを有する3つの動物に染色した結果を示す。最初の列は、セルの総母集団です。2 番目の列は、単一の格紙の選択を示しています。3番目の列は、B細胞、T細胞およびNK細胞に対して負の生細胞のサブ集団を示している。4番目の列は、CD45に陽性の生細胞の染色を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
			<td>金額(500mL)</td>
			<td>モルリティ</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化 ナトリウム</td>
			<td>4.091 g</td>
			<td>140mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>0.186 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>0.0476 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-グルコース</td>
			<td>0.9 g</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>1.19 g</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:タイロードの溶液の準備のためのコンポーネント。 示されたコンポーネントは、500 mLタイローデの溶液の調製用です。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
			<td>量</td>
			<td>プロトコルセクション 1</td>
			<td>プロトコルセクション 2</td>
			<td>プロトコルセクション 3</td>
			<td>プロトコルセクション 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>5 mg</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0.03 mM</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
<tr>
<td>コラゲナーゼタイプI型</td>
			<td>132.5単位</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
<tr>
<td>コラゲナーゼ III型</td>
			<td>96.4単位</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
<tr>
<td>コラゲナーゼ型VI型</td>
			<td>50単位</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>はい</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase</td>
			<td>10台</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>パパイン</td>
			<td>115台</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
<tr>
<td>パン コラゲナーゼ</td>
			<td>50単位</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヒアルロニダーゼ</td>
			<td>10.5単位</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
<tr>
<td>ディスパーゼII</td>
			<td>1.25単位</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>細胞解離解</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>はい</td>
			<td>-</td>
			<td>はい</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>組換え酵素</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>はい</td>
			<td>-</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:消化バッファーの調製のためのコンポーネント。 示された成分は、2.5 mLの消化混合(1 Uは37°Cで1分間に1μmol基質の加水分解を触媒する)の調製用である。 各酵素の単位の定義については、製品データシートを参照)。

このプロトコルの目的は、脊髄損傷のマウスモデルに最適化された組織解離プロトコルを適用し、フローサイトメトリーによる単一細胞分析のアプローチを検証することです。

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...

このプロトコルは、生物学的情報を使用して、高い細胞生存率を持つ単一細胞懸濁液の生成を促進するため、重要です。この技術の主な利点は、高い細胞生存率と単離された細胞タイプの適切な表現を保持するシングルセル懸濁液を生成できることです。外科的処置を実演するのは、私の研究室のフェローであるフセイン・アッタです。組織解離手順を実演するのは、Ali Hashemi 氏と FACS 分析の Yaser Heshmati 氏です。成体麻酔マウスでペダル反射に対する反応の欠如を確認した後、胸椎の最も顕著な棘突起を触診します。手術前に鎮痛剤と抗生物質を投与します。マウスの背面で、首の下部から最も目立つ棘突起のすぐ下まで、正中線の両側に1センチメートルの縦方向の長方形を剃ります。露出した皮膚を、10%ポビドンヨードと70%エタノールワイプを連続して3回消毒します。切開部位から外側に向かって循環的に行います。最後の拭き取り後、マウスを滅菌した4 x 4インチのガーゼスポンジで覆い、手術野の上に窓があります。脊髄損傷を誘発するには、まず背中の中央に1.5センチメートルの切開を行い、鋭い鈍的解剖を使用して、筋肉を棘突起とT9、T10、およびT11椎骨の椎弓板から分離します。細いハサミを使用して、T9とT10、T10とT11の間で棘間靭帯を鋭く分割してから、T10棘突起の両側椎弓切除術を行います。椎弓板が完全に切除されたら、はさみを使用して脊髄を横断します。側柱を完全にカットするには、両側の細いハサミの先端を繊細に掃きます。滅菌コットンチップアプリケーションを使用して、出血を圧縮します。恒常性を達成した後、7-0ポリグラクチン910連続縫合糸で皮膚を閉じ、術後の脱水を防ぐために1ミリリットルの生理食塩水を皮下に送達し、その後、完全に横臥するまで監視しながら動物を新鮮なケージに戻します。12時間ごとに、片手で動物を持ち、もう一方の手で下腹部をマッサージしながら、人差し指と親指を使用して膨張した膀胱を見つけて静かに圧迫し、動物が自分で排尿できるようになるまで手動の膀胱表現を刺激します。目的の膀胱細胞タイプのダウンストリーム分析のために、適切な実験時点で、動物が適切に麻酔されたら、骨盤から横隔膜までの正中線開腹術を行い、横隔膜を肋骨から切り離します。胸骨に平行な骨軟骨の境界をたどり、横隔膜から始めて最初の肋骨に進むまで、動物の両側の肋骨に沿って胸部を開きます。動物の頭の上に前胸壁を固定した後、細いハサミを使用して心膜を切り取り、23ゲージの針を灌流装置に接続します。針を左心室に挿入し、組織に穴を開けずに針をゆっくりと大動脈に進めます。針が所定の位置にあるとき、毎分15ミリリットルの流量で組織にPBSを注入し始め、細いハサミの先端を使用して、右心房にすばやく小さな切り込みを入れます。ドレナージが明確で、肝臓の色が明るくなったことが観察できる場合は、灌流を停止し、膀胱を血管茎と尿道から解放し、膀胱を氷冷したタイロード溶液を含む微量遠心チューブに入れます。シングルセル懸濁液を調製するには、すべての膀胱を採取したら、100マイクロリットルのタイロード溶液が入った1.5ミリリットルの微量遠心チューブを引き裂きます。秤量後、100マイクロリットルのタイロード溶液が入った10センチメートルのシャーレで膀胱をミンチにし、ワイドボアピペットチップを使用して組織片を膀胱あたり2.5ミリリットルの消化緩衝液に移します。Nutatorミキサーで組織を摂氏37度で40分間インキュベートし、5ミリリットルのピペットを使用してサンプルを1分間粉砕してから、解離した細胞と組織を遠心分離で収集します。ペレットを1ミリリットルの細胞剥離溶液に再懸濁し、細胞をさらに10分間Nutatorミキサーに置きます。インキュベーションの終了時に、別の遠心分離で細胞を回収し、ペレットを1ミリリットルの赤血球溶解バッファーに再懸濁します。1分後、9ミリリットルのPBSを添加して溶解を停止し、70マイクロメートルのストレーナで細胞を50ミリリットルのチューブにろ過し、細胞を再度遠心分離し、ペレットを200マイクロリットルのFCブロックを添加した染色緩衝液に再懸濁します。氷上で10分間インキュベートした後、遠心分離により細胞を回収し、光から保護された氷上で適切な量の蛍光色素標識抗体マスターミックスにペレットを20分間再懸濁します。インキュベーションの終了時に、細胞を1ミリリットルの細胞染色緩衝液で洗浄し、ペレットを5マイクロリットルのFITC Annexin Vと1マイクロリットルのヨウ化プロピジウムを補充した100マイクロリットルの新鮮な細胞染色緩衝液に再懸濁します。室温で15分後、400マイクロリットルのアネキシン結合バッファーを細胞に加え、反転して混合します。フローサイトメトリーで細胞を解析するには、まず未染色の細胞サンプルを使用して細胞の側方散乱パラメータと前方散乱パラメータを設定し、次に530ナノメートルから575ナノメートルを超える蛍光発光を測定して、死細胞を除外します。各ドットブロットのグリッドを使用して、最初の崩壊におけるネガティブポピュレーションを定義し、蛍光マイナス1コントロールを使用して、ネガティブポピュレーションとポジティブポピュレーション培地が整列するまでスペクトルのオーバーラップを補正します。次に、特定の対象マーカーを持つ細胞の100,000イベントを測定し、必要に応じて対象細胞集団のゲートを作成します。すべてのサンプルを実行したら、適切なフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用してデータを解析します。コラーゲン1A1、コラーゲン3A1、コラーゲン1A2、コラーゲン6A1は、マウスの膀胱内で最も多く存在するコラーゲンタイプです。コラーゲン1、3、6、およびHAのmRNA発現レベルを決定するための分析は、これらの細胞外マトリックス成分の発現が、尿路上皮よりも間葉系細胞集団でより一般的であることを明らかにした。フローサイトメトリー解析では、複数の異なる酵素消化プロトコルにより、生存率の高い細胞集団が得られ、この解析で使用した3つ目の消化プロトコルが細胞保存に最も効果的であると判断されました。この方法を使用すると、脊髄損傷マウスの膀胱から単離された細胞の総数の有意な増加を得ることができ、それを対照膀胱と比較することができる。対照と比較して、脊髄損傷動物の膀胱もCD45陽性細胞の有意な増加を示しています。ステップ7.1は、心母集団の同定に重要です。ゲーティング戦略は、目的の細胞から情報を得る必要があります。SCI動物の膀胱は、異なる細胞集団を持っています。このプロトコールは、細胞ソーティング、初代細胞培養、シングルセルシーケンシング、および生存可能な単一細胞を必要とするその他の分子および細胞の下流工程に使用できます。このプロトコルは、高い生存率を提供するため、細胞集団の損失が少なくなりますが、これはシングルセルRNAシーケンシングなどのシングルセル解析技術の重要なポイントです。

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出典: Yang, E. ほか尿路感染症のマウスモデルから生成された単一細胞内細菌群集の単離で、単一細胞解析のための単一細胞解析。 J. Vis. Exp. (2019年)このビデオは、感染したマウス膀胱から細胞内細菌群集を含む単一上皮細胞を口腔マイクロピペッティングを用いて手動分離する方法を示し、尿路感染症モデルにおける生存可能な宿主関連 大腸菌...

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エクスビボ マウス尿路上皮細胞におけるアデノウイルス-Cre媒介遺伝子欠失のオルガノイドモデル

このプロトコルはRNAの分析および細胞培養のようなそれに続く適用を促進する大人のマウス脊髄からの浄化されたastrocytesそしてミクログリアの隔離を概説する。これには、単離された細胞の品質と収量の両方を向上させるように設計された詳細な細胞解離方法と手順が含まれています。...

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マウス創傷モデルおよび単一細胞懸濁液の調製

学ぶ脊髄損傷後のマウス膀胱の単一細胞解離法。高生存率の細胞懸濁液を調製し、フローサイトメトリーによる細胞集団解析を可能にする。細胞動態の理解と下流解析への応用に有用な手法です。

脊髄損傷後のマウスにおける膀胱の分子解析のための単一細胞解離アプローチ

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