脊髄損傷後のマウスにおける膀胱の分子解析のための単一細胞解離アプローチ

このプロトコルは、生物学的情報を使用して、高い細胞生存率を持つ単一細胞懸濁液の生成を促進するため、重要です。この技術の主な利点は、高い細胞生存率と単離された細胞タイプの適切な表現を保持するシングルセル懸濁液を生成できることです。外科的処置を実演するのは、私の研究室のフェローであるフセイン・アッタです。

組織解離手順を実演するのは、Ali Hashemi 氏と FACS 分析の Yaser Heshmati 氏です。成体麻酔マウスでペダル反射に対する反応の欠如を確認した後、胸椎の最も顕著な棘突起を触診します。手術前に鎮痛剤と抗生物質を投与します。

マウスの背面で、首の下部から最も目立つ棘突起のすぐ下まで、正中線の両側に1センチメートルの縦方向の長方形を剃ります。露出した皮膚を、10%ポビドンヨードと70%エタノールワイプを連続して3回消毒します。切開部位から外側に向かって循環的に行います。最後の拭き取り後、マウスを滅菌した4 x 4インチのガーゼスポンジで覆い、手術野の上に窓があります。

脊髄損傷を誘発するには、まず背中の中央に1.5センチメートルの切開を行い、鋭い鈍的解剖を使用して、筋肉を棘突起とT9、T10、およびT11椎骨の椎弓板から分離します。細いハサミを使用して、T9とT10、T10とT11の間で棘間靭帯を鋭く分割してから、T10棘突起の両側椎弓切除術を行います。椎弓板が完全に切除されたら、はさみを使用して脊髄を横断します。

側柱を完全にカットするには、両側の細いハサミの先端を繊細に掃きます。滅菌コットンチップアプリケーションを使用して、出血を圧縮します。恒常性を達成した後、7-0ポリグラクチン910連続縫合糸で皮膚を閉じ、術後の脱水を防ぐために1ミリリットルの生理食塩水を皮下に送達し、その後、完全に横臥するまで監視しながら動物を新鮮なケージに戻します。

12時間ごとに、片手で動物を持ち、もう一方の手で下腹部をマッサージしながら、人差し指と親指を使用して膨張した膀胱を見つけて静かに圧迫し、動物が自分で排尿できるようになるまで手動の膀胱表現を刺激します。目的の膀胱細胞タイプのダウンストリーム分析のために、適切な実験時点で、動物が適切に麻酔されたら、骨盤から横隔膜までの正中線開腹術を行い、横隔膜を肋骨から切り離します。胸骨に平行な骨軟骨の境界をたどり、横隔膜から始めて最初の肋骨に進むまで、動物の両側の肋骨に沿って胸部を開きます。

動物の頭の上に前胸壁を固定した後、細いハサミを使用して心膜を切り取り、23ゲージの針を灌流装置に接続します。針を左心室に挿入し、組織に穴を開けずに針をゆっくりと大動脈に進めます。針が所定の位置にあるとき、毎分15ミリリットルの流量で組織にPBSを注入し始め、細いハサミの先端を使用して、右心房にすばやく小さな切り込み

ドレナージが明確で、肝臓の色が明るくなったことが観察できる場合は、灌流を停止し、膀胱を血管茎と尿道から解放し、膀胱を氷冷したタイロード溶液を含む微量遠心チューブに入れます。シングルセル懸濁液を調製するには、すべての膀胱を採取したら、100マイクロリットルのタイロード溶液が入った1.5ミリリットルの微量遠心チューブを引き裂きます。秤量後、100マイクロリットルのタイロード溶液が入った10センチメートルのシャーレで膀胱をミンチにし、ワイドボアピペットチップを使用して組織片を膀胱あたり2.5ミリリットルの消化緩衝液に移します。

Nutatorミキサーで組織を摂氏37度で40分間インキュベートし、5ミリリットルのピペットを使用してサンプルを1分間粉砕してから、解離した細胞と組織を遠心分離で収集します。ペレットを1ミリリットルの細胞剥離溶液に再懸濁し、細胞をさらに10分間Nutatorミキサーに置きます。インキュベーションの終了時に、別の遠心分離で細胞を回収し、ペレットを1ミリリットルの赤血球溶解バッファーに再懸濁します。

1分後、9ミリリットルのPBSを添加して溶解を停止し、70マイクロメートルのストレーナで細胞を50ミリリットルのチューブにろ過し、細胞を再度遠心分離し、ペレットを200マイクロリットルのFCブロックを添加した染色緩衝液に再懸濁します。氷上で10分間インキュベートした後、遠心分離により細胞を回収し、光から保護された氷上で適切な量の蛍光色素標識抗体マスターミックスにペレットを20分間再懸濁します。インキュベーションの終了時に、細胞を1ミリリットルの細胞染色緩衝液で洗浄し、ペレットを5マイクロリットルのFITC Annexin Vと1マイクロリットルのヨウ化プロピジウムを補充した100マイクロリットルの新鮮な細胞染色緩衝液に再懸濁します。

室温で15分後、400マイクロリットルのアネキシン結合バッファーを細胞に加え、反転して混合します。フローサイトメトリーで細胞を解析するには、まず未染色の細胞サンプルを使用して細胞の側方散乱パラメータと前方散乱パラメータを設定し、次に530ナノメートルから575ナノメートルを超える蛍光発光を測定して、死細胞を除外します。各ドットブロットのグリッドを使用して、最初の崩壊におけるネガティブポピュレーションを定義し、蛍光マイナス1コントロールを使用して、ネガティブポピュレーションとポジティブポピュレーション培地が整列するまでスペクトルのオーバーラップを補正します。

次に、特定の対象マーカーを持つ細胞の100,000イベントを測定し、必要に応じて対象細胞集団のゲートを作成します。すべてのサンプルを実行したら、適切なフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用してデータを解析します。コラーゲン1A1、コラーゲン3A1、コラーゲン1A2、コラーゲン6A1は、マウスの膀胱内で最も多く存在するコラーゲンタイプです。

コラーゲン1、3、6、およびHAのmRNA発現レベルを決定するための分析は、これらの細胞外マトリックス成分の発現が、尿路上皮よりも間葉系細胞集団でより一般的であることを明らかにした。フローサイトメトリー解析では、複数の異なる酵素消化プロトコルにより、生存率の高い細胞集団が得られ、この解析で使用した3つ目の消化プロトコルが細胞保存に最も効果的であると判断されました。この方法を使用すると、脊髄損傷マウスの膀胱から単離された細胞の総数の有意な増加を得ることができ、それを対照膀胱と比較することができる。

対照と比較して、脊髄損傷動物の膀胱もCD45陽性細胞の有意な増加を示しています。ステップ7.1は、心母集団の同定に重要です。ゲーティング戦略は、目的の細胞から情報を得る必要があります。

SCI動物の膀胱は、異なる細胞集団を持っています。このプロトコールは、細胞ソーティング、初代細胞培養、シングルセルシーケンシング、および生存可能な単一細胞を必要とするその他の分子および細胞の下流工程に使用できます。このプロトコルは、高い生存率を提供するため、細胞集団の損失が少なくなりますが、これはシングルセルRNAシーケンシングなどのシングルセル解析技術の重要なポイントです。