Name: SHP2(PTPN11)ホスファターゼ阻害剤による細胞標的関与の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学ぶ SHP2阻害剤の細胞標的関与評価法。384ウェル形式の細胞熱シフトアッセイを用いて、野生型およびがん原性変異体の標的結合を検出し、がん治療薬の効率的な創薬プロセスを支援する強力な手法を解説する。

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この研究は、国立衛生研究所補助金1R21CA195422(L.T.)、エプスタインファミリー財団賞(N.D.P.C.)、NCIがんセンターサポートグラントP30CA030199によって支援されました。さらに、このプロジェクトは、化学生物学コンソーシアム契約No.の下で、国立がん研究所、国立衛生研究所からの連邦資金の全部または一部で資金提供されています。HHSN261200800001E.本書の内容は、必ずしも保健福祉省の見解や方針を反映したものではなく、商号、商用製品、または組織に関する言及も、米国政府による支持を意味するものではありません。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

1. 細胞培養・試薬の製造
<ol><li>10%の牛血清、1x抗生物質/抗ミコティック、20 mM HEPES、および1 mMのナトリウムピルビン酸を用いて500mLの成長培地を処方する。4 °Cで保管。</li>
	<li>凍結したオリジナルストックボトルから、セルラー熱シフト試薬(EA試薬、溶汁バッファー、基材)を解凍します。</li>
	<li>試薬と緩衝液を2 mLアリコートとして分配し、-20°Cで保管する。 注:再現性のために凍結/解凍を避け、アッセイ手順に必要な試薬の量のみを使用してください。</li>
</ol>2. HEK293T細胞の増殖と維持
<ol><li>クライオ貯蔵から低い通路付着HEK293T細胞を得る。</li>
	<li>37 °C、5%CO2で成長培地中のHEK293T細胞を維持する。</li>
	<li>1:14の比率で4日ごとに細胞を分割します。 注: 最適なパフォーマンスを得るために、HEK293T セルは 25 回を超える通過を許可されていません。</li>
</ol>3. 一過性トランスフェクション用 HEK293T 細胞製剤
<ol><li>細胞脱離試薬の3 mLを使用して16 mLプレートからHEK293T細胞を取り外します。</li>
	<li>12 mLの成長培地で希釈します。1,400 x g で4分間遠心分離して細胞を採取する。</li>
	<li>10 mL成長培地でペレットを再懸濁します。トリパンブルーとセルカウンターを使用して細胞の濃度と生存率を測定します。</li>
	<li>プレート7.0 x 105 指数関数的に成長HEK293T細胞は、トランスフェクションの約24時間前に6ウェル細胞培養プレートでウェルあたり増殖する。 注: プラスミドがトランスフェクションされるごとに 1 つの井戸を予約してください。</li>
	<li>37°Cで24時間インキュベート、5%CO2.</li>
</ol>4. HEK293T細胞のトランスフェクション
<ol><li>pICP-ePL-N-SHP2-WTまたはpICP-ePL-N-SHP2-E76K(〜200 ng/μL)の精製プラスミドストックから、2μgのプラスミドDNAを200 μLのトランスフェクションバッファーに希釈しました。</li>
	<li>ボルテックスは10s、遠心分離機は1,400 x g で4分間です。</li>
	<li>希釈したDNAに4μLのトランスフェクション試薬を加えます。ボルテックスは10s、遠心分離機は1,400 x g で4分間です。</li>
	<li>23°Cで10分間インキュベートします。</li>
	<li>培養器から成長するHEK293T細胞を含む6ウェルプレートを取り除きます。6ウェルプレートに取り付けられた細胞にトランスフェクションミックスを加えます。37°Cで24時間インキュベートし、5%CO2。
</li>
</ol>5. アッセイプレートの準備
<ol><li>テストする化合物のDMSOで10 mMストックソリューションを準備してください。</li>
	<li>阻害剤溶液を384ウェル低デッドボリュームソースプレートに分配し、すぐに使用します。</li>
	<li>0.5%未満のDMSO(v/v)の目標最終容積で384ウェルリアルタイムPCRプレートに液体ハンドラを使用して、インヒビターまたは車両(DMSO)の所望の容積を見つけます。不活性ガスパージでプレートシーラーを使用してプレートを密封します。 注: 阻害剤の用量応答アッセイの場合は、各阻害剤濃度に等量の DMSO が使用されるように、DMSO を適宜バックフィルするようにしてください。最良の結果を得るには、プレートを23°Cで保存し、24時間以内にプレートを使用してください。</li>
</ol>6. トランスフェクトされた細胞の剥離と準備
<ol><li>37°Cの水浴中のプレインキュベート成長培地及び細胞剥離試薬。インキュベーターからトランスフェクトされた細胞を除去します。プレートのウェルから優しく吸引するメディア。 注:異なるトランスフェクトプラスミドを含むすべてのウェルに新しい吸引器を使用してください。</li>
	<li>0.3 mLの細胞剥離試薬を加えます。プレートをゆっくりと前後に揺らし、プレート底面を完全に覆います。23°Cで2分間インキュベートします。</li>
	<li>各ウェルに1mLの成長培地を加えます。ウェル内のピペットメディアと細胞を穏やかに、15 mLファルコン遠心分離管に移します。1,400 x g で4分間遠心分離して細胞を採取する。</li>
	<li>穏やかに、しかし徹底的にメディアを吸引する。 注:細胞剥離試薬中の残留フェノールレッドは、アッセイを妨げる可能性があります。</li>
	<li>細胞ペレットを2 mLの成長培地に慎重に再懸濁させる。トリパンブルーとセルカウンターを使用して細胞の濃度と生存率を測定します。 注: 最良の結果を得るには、セルの生存率を 90% 以上にする必要があります。</li>
	<li>細胞を125個の細胞/μLの濃度に希釈します。例えば、5 μL のアッセイでは、これは~625 細胞/μL です。最適な生存率のために細胞は2時間以下の懸濁液に保つ。</li>
</ol>7. SHP2阻害剤を用いる細胞のインキュベーション
<ol><li>細胞を無菌単一チャネル溶液トラフに分配する。</li>
	<li>23°Cで5分間2,500xgでSHP2阻害剤沈着により予め調製された遠心分離機384x gウェルリアルタイムPCRプレート。</li>
	<li>コンパウンドプレートからシールを取り外します。125 μL のマルチチャンネルピペットを使用して、希釈した細胞を 5 μL を所望のウェルに加えます。</li>
	<li>プレートに蓋をせずに30sの42 x gでプレートを遠心します。プレートをスピンダウンした後、プレートに蓋シールを取り付け、アッセイプレートを37°C、5%CO2で21時間インキュベートします。</li>
</ol>8. 化学発光試薬マスターミックスの調製
<ol><li>メッキ細胞の後に-20°Cの保存から必要な量の検出試薬(EA試薬、リシスバッファー、および基質)を取り除きます。23°Cで試薬を解凍する。 注:転送の便宜上、プレートに堆積したセルの総体積の1.5倍のボリュームを準備してください。使用後は試薬を再利用しないでください。</li>
	<li>EA-10の条件を使用して試薬のマスターミックスを準備します, 以下のように成分と体積分率で構成されています: EA試薬 (0.17), リシスバッファー (0.17), 基板 (0.67). 注: 試薬比は、サプライヤーのマニュアルで指定された最適化実験に基づいています。</li>
</ol>9. 等温または熱プロファイル勾配熱パルス
<ol><li>熱パルスの送達のための勾配対応サーモサイクラーをプログラムします。<ol>
<li>熱プロファイル勾配実験では、サーモサイクラーを次の例の仕様で事前にプログラムします。</li>
		<li>熱パルス:3分所望の融解温度(垂直または水平勾配+-15°C;例38-68°Cは24ウェルに広がり、1.25°Cの温度増分を生み出す)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>平衡回収ステップ:ランプ速度= 1 °C/sで3分20°C<ol>
<li>等温実験では、プロトコルを次のように設定します。</li>
		<li>熱パルス:3分55°C 平衡回収ステップ:ランプ速度= 1°C/sで3分20°C 注:サーモサイクラーが希望する温度に達したときにプレートを正確に配置することは困難なため、再現性を高めるために、3分パルスを開始する前に15 sをカウントダウンするようにプログラムを設定します。この実験で使用されるサーモサイクラーについては、 材料表を参照してください、 蓋は熱パルスの間に維持されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. ライシス検出と測定
<ol><li>マルチチャンネルピペットを使用して分析する各ウェルに等量(5 μL)を添加して、リシス検出マスターミックス付きアッセイプレートを補います。</li>
	<li>プレート42 x g を30s用に遠心分離する。暗闇の中で23°Cで30〜60分間保管してください。</li>
	<li>384ウェル形式で発光を検出できるマイクロプレートリーダーを用いて化学発光を測定します。プレートタイプと積分時間を最適化して発光測定を行います(積分時間1000ms、決済時間0s)。値をカウント/s として測定し、さらに分析するために出力します。</li>
</ol>11. データ分析
<ol><li>2Dグラフと統計ソフトウェアを使用して発光データを分析します。</li>
	<li>非線形回帰とボルツマンシグモイドモデルを使用して正規化された発光データ(車両制御に正規化)を分析して、熱プロファイルを生成します。 注: 熱プロファイル実験では、計算された V50(曲線の底部と上端の中間点である温度) が SHP2 の融解温度を定義します。等温実験では、EC50 は、半最大応答を与える阻害剤の濃度を定義する。</li>
</ol>

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著者らは、この記事の内容と利益相反がないことを宣言しています。

細胞内のSHP2ホスファターゼへの低分子の直接結合を確認できる標的関与アッセイを発表しました。このアッセイは、低親和性阻害剤と高親和性阻害剤を区別し、重要なことに、GOF発癌性SHP2-E76K変異体に対するSHP099型のアロステリック阻害剤による効力の欠如を確認することができる。この小型アッセイの強みは、SHP2阻害剤スクリーニングキャンペーンに統合される能力です。未知の化学物質によってSHP2に対する細胞内結合を確認するアッセイの能力は、スクリーニング資源を効率的に展開することができることを保証する重要な能力である。全体的に、小型化された議定書は強く、信頼できる。
アッセイの重要な側面はタイミングです。最良の結果はHEK293T細胞のトランスフェクション後24時間得られる。SHP2-WTおよびSHP2-E76Kタンパク質は毒性があるようには見えない。しかし、長期にわたる高発現は実験の感度を低下させ、再最適化を必要とする。細胞を取り外してアッセイに備えるために慎重に取り扱うことは、追加の重要な考慮事項です。しかし、標準的な細胞培養法は、高品質のデータを生成するのに十分です。この...

チロシンリン酸化は、細胞11,2におけるシグナル伝達において重要な役割を果たす。この翻訳後修飾は、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)によって触媒され、タンパク質チロシンホスファターゼ(Ptps)によって逆転されます。したがって、異常PTKまたはPTP機能は、多くの遺伝または獲得したヒト疾患33、4、5、64,5,6につながる。Src相モロジー2(SH2)ドメイン含有ホスファターゼ2(SHP2)は、プロトオンコジーンPTPN117によってコードされる広く発現された非受容体型PTPであり、Ras/Raf/ERK、PI3K/Akt、またはJAK/STATシグナル伝達経路の活性化によるシグナル伝達を伴う多数の生理学的プロセスの主要な調節因子である。通常、SHP2活性は異常なシグナル伝達を防ぐために厳しく調節される。基礎条件下ではSHP2はそのN末端SH2ドメインによって自動抑制され、触媒ホスファターゼドメイン内の活性部位へのアクセスをブロックする(図1A)9、10。9,10Figure 1A細胞活性化の際、チロシンリン酸化結合タンパク質はSHP2をリクルートし、活性な立体構造を採用し、活性部位がその基質にアクセスできるようになりました。多くの癌においてSHP2活性が上昇している。PTPN11における体細胞機能利得(GOF)突然変異は、主に白血病において同定されており、N-SH2ドメインのホスファターゼドメインへの結合を防止し、構成的に活性なSHP2(図1B)11を生じる。11PTPN11における生殖細胞系GOF突然変異は、ヌーナン症候群の症例の50%を担い、悪性腫瘍のリスクが高い発達障害である12。PTPN11変異がまれである固形腫瘍では、リン酸化結合タンパク質のレベルが高いほどSHP2活性が増強される(図1C)。SHP2は免疫チェックポイントシグナル伝達にも重要であり、BTLAやPD−1などのチェックポイント受容体は主要なシグナル伝達分子を脱リン酸化してSHP2をリクルートし、免疫細胞活性化13、14、1514,15を予防する。13
低分子のPtPsを標的にすることは、PtPsの活性部位が高度に保存され、高い荷電性を有するため、困難でした。活性部位を標的とする阻害剤は、しばしば強力であるが、不十分な選択性および経口バイオアベイラビリティ1616、17、18、19、20、21、22を示す。,17,18,19,20,21,22実際、報告された多くのSHP2阻害剤は、細胞23における選択性の低下と有効性の欠如に苦しんでいる。最近、優れた効力と優れた選択性を有するSHP2のアロステリック阻害剤(例えば、SHP09924およびRMC-455025)が報告され、SHP2阻害剤への新たな関心を引き起こしている。SHP099およびRMC-4550に基づく化合物は、現在、第I相臨床試験中に、受容体チロシンキナーゼ(RTK)経路活性化26,27,27で固形腫瘍を治療する。画期的な一方で、これらの化合物は、血液癌患者28、29、30,29,30のかなりの数の血液癌患者で白血病を駆動するSHP2発癌性変異体の多くに対して効果がない。SHP2発癌性変異体に対するSHP099様化合物の効力の欠如は、SHP2変異体で破壊される不活性で閉じた立体構造を結合して安定化させることによってSHP2活性を阻害するため、そのユニークなアロステリック機構に由来する。また、最近の報告31に基づいて、SHP099様阻害剤で治療された患者における適応抵抗機構は、かなり考えられる。その結果、その活性、開放状態を標的とする次世代SHP2阻害剤の開発は、激しい研究の対象となっている。
細胞内の新規SHP2阻害剤の特性評価は、リード最適化プロセスの不可欠な側面である。重要なことに、生理学的条件下での阻害剤の実証された標的関与は、薬用化学のリソースが有望な細胞有効性を有する化合物に効率的に展開されるというさらなる信頼を提供する。過去には、その標的に対する低分子阻害剤の結合を評価するいくつかの方法が開発されてきたが、主にプロテインキナーゼ32に対して。SHP2細胞標的エンゲージメントアッセイを開発するために、セルラー熱シフトアッセイ33を利用した。このアッセイは、タンパク質34に対するインビトロ熱シフト(PTS)アッセイと同様に、標的タンパク質の熱安定性を監視し、これは典型的には小分子の結合によって変化する。元のアッセイは、抗体を利用して標的タンパク質レベルを定量化する低スループットアッセイです。あるいは、β-ガラクトシダーゼ酵素フラグメント相補(EFC)アッセイを利用した熱シフトアッセイの最近報告された変異体を選択した(図2)35。35これらの実験では、目的のタンパク質は、増強されたProLabelタグ(ePL、βガラクトシダーゼの42アミノ酸断片)を運ぶN-またはC末端融合タンパク質として細胞内で発現される。細胞は384ウェルPCR適合プレートに移され、目的の化合物と共にインキュベートされます。サーモサイクラーは、細胞に温度勾配を適用するために利用され、そのタンパク質は熱安定性に基づいて温度が上昇するにつれて変性し、凝集する。候補化合物が目的のタンパク質に結合し安定化する能力は、そのタンパク質の熱安定性の向上をもたらす。したがって、細胞の溶解に続いて、候補化合物によって安定化されたタグ付きタンパク質は、車両制御でインキュベートされた細胞のタグ付きタンパク質よりも高い温度で溶液中に残る。レポーター酵素アクセプタ(EA)は、可溶性ePLタグ付きタンパク質を補体することができ、発光基質を用いた検出可能なβガラクトシダーゼ活性をもたらす。
我々は最近、384ウェル形式36で野生型SHP2(SHP2-WT)および頻繁なSHP2発癌変種(SHP2-E76K)用の堅牢なセルラー熱シフトアッセイを開発した。ここでは、細胞内のSHP2阻害剤による標的関与を確実に検出し、阻害力と細胞熱シフトデータとの間の高い相関を示すこのアッセイの詳細なプロトコルを報告する。一般的なアッセイのワークフローを 図 3に示します。当社のプラットフォームは、N末端タグ付きフルレングスePL-SHP2融合タンパク質を使用しています。対応する pICP-ePL-N-SHP2-WT および pICP-ePL-N-SHP2-E76K 発現プラスミドの生成については、当社の最近の出版物36を参照してください。このアッセイは、熱勾配を使用してSHP2熱プロファイルを確立し、阻害剤の存在下または不存在下でのSHP2融解温度を決定するために行うことができる。いったん熱プロファイルが確立されると、等温条件下でも実施でき、阻害剤の線量応答評価が可能になります。両方のタイプの実験を以下に説明する。

<table><tbody><tr><td>384井戸勾配付き熱循環器</td><td>エッペンドルフAG</td><td>X50時間</td><td></td></tr><tr><td>384ウェル低デッドボリュームマイクロプレートエコー認証</td><td>ベックマン・クールター社</td><td>LP-0200</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養プレート</td><td>グライナー・バイオ・ワン</td><td>657 160</td><td>蓋付きの無菌</td></tr><tr><td>抗生物質-抗菌薬(Anti Anti)100 X</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>セルカウンター</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>カウンテスII FL</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグル・ミディアム 1X + グルタMAX</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>10566-016</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>エコー音響液体ハンドラー</td><td>ベックマン・クールター社</td><td>エコー550</td><td></td></tr><tr><td>電子マルチチャネルピペット</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>E1クリップチップ</td><td></td></tr><tr><td>胎児用牛血清</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>26140-079</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>HEPESバッファ</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>15630-680</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>InCell Pulseスターターキット</td><td>ユーロフィンズ・ディスカバーX社</td><td>94-4007</td><td>成分にはEAバッファー、リシスバッファー、基板が含まれます</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>テカン・トレーディングAG</td><td>スパーク</td><td></td></tr><tr><td>単一チャネル解トラフ</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S253012005</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>11360-010</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>サーマルマイクロプレートシーラー</td><td>アジレント・テクノロジーズ社</td><td>プレートロック</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェクション試薬</td><td>ポリプラストランスフェクション</td><td>ジェットプライム</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express試薬</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Twin.tec 384 リアルタイムPCRプレート</td><td>エッペンドルフAG</td><td>30132734</td><td></td></tr></tbody></table>

shp2(ptpn11)ホスファターゼ阻害剤による細胞標的関与の評価

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

PTPN11プロトオンコジーンによってコードされるSrc相同症2(SH2)ドメイン含有ホスファターゼ2(SHP2)は、受容体チロシンキナーゼ(RTK)駆動細胞シグナル伝達の主要なメディエーターであり、細胞の生存および増殖を促進する。また、SHP2は、BおよびT細胞活性化を阻害する免疫チェックポイント受容体によってリクルートされる。異常なSHP2機能は、多くの癌の発達、進行、転移に関与している。実際、低分子SHP2阻害剤は最近、いくつかの発癌性Ras突然変異を有する腫瘍を含むRas/Raf/ERK経路活性化を伴う固形腫瘍の治療のための臨床試験に入った。しかし、現在のクラスのSHP2阻害剤は、白血病で頻繁に発生するSHP2発がん型変異体に対して有効ではなく、発癌性SHP2を標的とする特定の低分子の開発が現在の研究の対象となっている。SHP2のような細胞質タンパク質を含むほとんどの創薬キャンペーンの共通の問題は、化学発見を促進する主要なアッセイは、多くの場合、候補化合物の細胞標的関与を報告しないインビトロアッセイであるということです。細胞ターゲットエンゲージメントを測定するためのプラットフォームを提供するために、野生型と変異型の両方のSHP2細胞熱シフトアッセイを開発しました。これらのアッセイは、細胞内のSHP2阻害剤の標的関与を確実に検出する。ここでは、SHP2阻害剤の評価と特性評価のための貴重なツールを提供するこのアッセイの包括的なプロトコルを提供します。

SHP2-WTの熱勾配実験は、折り畳まれたタンパク質に対して典型的かつ一貫した狭い融解遷移を有するシグモイド細胞熱プロファイルをもたらした(図4A)。SHP2 は、2 つの SH2 ドメインと触媒ドメインの 3 つの独立したドメインで構成されています (図 1)。自動抑制された閉じた立体構造では、これらのドメインは自己関連付け;熱プロファイル実験で観察された融解遷移は、おそらくこの状態を細胞に反映した。10 μMでのアロステリック阻害剤SHP099によるSHP2-WTのインキュベーションは、SHP2-WT熱プロファイルを有意かつ測定可能な程度まで安定化させた(図4A)。これは、制御結合SH2ドメインと触媒サブユニットとの間に「分子接着剤」37として作用するSHP099様阻害剤の公知の結合様式を反映している。重要なことに、当社のセルラー熱シフトアッセイは、SHP099が細胞に浸透し、標識されたSHP2-WTに結合で...

無傷の細胞における候補阻害剤による標的関与を評価する能力は、創薬にとって極めて重要である。このプロトコルは、野生型SHP2またはその発癌性変異体を標的とする阻害剤の細胞標的関与を確実に検出する384ウェルフォーマットの細胞熱シフトアッセイについて説明する。

SHP2(PTPN11)ホスファターゼ阻害剤による細胞標的関与の評価

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

チロシンホスファターゼSHP2は、細胞シグナル伝達の主要なメディエーターであり、細胞の生存および増殖を促進する。私のチームは、がん治療のための低分子SHP2阻害剤を見つけることに焦点を当てています。我々の技術は、細胞内の低分子SHP2阻害剤の標的関与と同様に、細胞浸透剤を確立するための迅速かつ強力な方法を提供する。これは、探索リソースが効率的に送信されるように保証します。がん治療の魅力的なターゲットとしてSHP2。そして、いくつかのSHP2阻害剤は、臨床試験中である。有効性プロファイルの改善を用いて次世代阻害剤の発見を促進する当社の技術。手順のデモンストレーションは、研究助手のセレステ・ロメロと、私たちの研究室の研究助教授のダグラス・シェフラーです。3ミリリットルの細胞剥離試薬を用いて、プレートからHEK293 T細胞を剥離し始める。細胞を12ミリリットルの増殖培地で希釈し、1,400倍Gで遠心分離して4分間回収します。細胞の口蓋を10ミリリットルの増殖培地で再懸濁し、トリパンブルーと細胞カウンターで細胞の濃度と生存率を測定する。プレート700,000は、6つのウェル培養プレートの各ウェルに指数関数的に成長し、摂氏37度で24時間、および5%の二酸化炭素をインキュベートします。翌日、2マイクログラムの血漿DNAを200マイクロリットルのトランスフェクションバッファーに希釈します。プラズマDNAを10秒間ボルテックスし、Gの1,400倍で4分間中央分離する。希釈したDNAに4マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加えます。それを10秒間渦を起させ、遠心分離を繰り返します。DNAを摂氏23度で10分間インキュベートし、6つのウェルプレートに取り付けられたHEK293 T細胞にトランスフェクションミックスを加え、さらに24時間培養器に戻します。アッセイプレートを調製するために、DMSOの希薄インヒビター溶液は、10ミリモルのストック濃度のために、それらを384ウェル低死量ソースプレートに分配し、即時使用する。0.5%DMSO未満の目標最終容積で384ウェルリアルタイムPCRプレートに液体ハンドラを使用して、阻害剤または車両の所望の容積を見つけます。不活性ガスパージでプレートシーラーを使用してプレートを密封します。トランスフェクト細胞を調製するために、成長培地を事前にインキュベートし、37°Cの水浴で剥離試薬を販売する。インキュベーターから細胞を取り出し、ウェルから培地を軽く吸引します。各ウェルに0.3ミリリットルの細胞剥離試薬を加え、プレートをゆっくりと前後に揺らし、プレート底面を完全に覆います。2分間摂氏23度でプレートをインキュベートします。各ウェルに1ミリリットルの成長培地を加え、ウェル内の細胞を穏やかにピペットします。その後、細胞を収集するために1,400回Gで細胞を遠心分離機15ミリリットルファルコン遠心分離管に移した。培地を軽く吸引し、次いで細胞ペレットを2ミリリットルの成長培地で再懸濁する。パンブルーとセルカウンターを試して、セルの生存率が90%を超えているかどうかを確認します。細胞を1マイクロリットル当たり125個の細胞の濃度に希釈し、細胞を2時間以下の間懸濁させて最適な生存率を維持する。SHP2阻害剤によるインキュベーションの場合、細胞を無菌単一チャネル溶液トラフに分配する。遠心分離機は、前に調製した384ウェルリアルタイムPCRプレートを2、500倍Gで5分間、シールを取り除き、125マイクロリットルのマルチチャネルピペットを使用して、希釈した細胞の5マイクロリットルを所望のウェルに加える。蓋を入れずに30秒間Gの42倍のプレートを遠心し、蓋を取り付け、摂氏37度と二酸化炭素5%で1時間インキュベートします。熱プロファイル勾配または等温実験のための原稿の方向に従って、サーモサイクラーをプログラムします。サーモサイクラーヒートパルスプログラムを起動し、サーマルブロックにアッセイプレートを置きます。プログラムが終了したら、アッセイプレートを取り外します。ライセンス検出マスターミックスの5マイクロリットルでアッセイプレートの各ウェルを補います。42倍Gでプレートを30秒間遠心し、暗闇の中で摂氏23度で30〜60分間保存します。最適化された統合時間を用いてマイクロプレートリーダーを使用して化学発光を測定します。野生型SHP2の熱勾配実験は、折り畳まれたタンパク質に典型的な狭い融解遷移を有するシグモイド細胞熱プロファイルをもたらした。野生型SHP2のインキュベーションは、アロステリック阻害剤SHP099を用いて、有意かつ測定可能な程度まで熱プロファイルに安定化した。SHP2の安定化は、アロステリック化合物のようなSHP099の効力をもとに追跡される。10マイクロモルで、より強力なRMC-4550は、野生型SHP2のSHP099よりも大きな安定化度を生み出した。そのユニークなメカニズムのために、アロステリック阻害剤のようなSHP099は、SHP2-E76Kを含む多くのSHP2発癌性変異体に対してあまり効果がありません。これらの既知の特性と一致するのは、SHP099によるSHP2-E76Kの限界熱安定化のみが観察される。EPLタグタンパク質の発現レベルは、シグナル強度に劇的に影響を与える可能性があります。一過性で安定して統合された野生型細胞の熱プロファイル。同一の資産条件下で表示されます。異なる曲線の正規化は、EFC検出システムの広い範囲を明らかにし、同等の熱プロファイルを与える。384ウェルプレートの短い軸に熱勾配を生成するサーマルサイクラー能力を利用して。一連の等温滴定は単一の版で行うことができる。最適な温度で、完全な10ポイントの線量応答を使用した等温滴定は、RMC-4550に有用なEC50を生み出した。この資産の原理は、PROTAC化合物によって誘導される細胞内のタンパク質の分解を監視するために使用することができる。我々は、細胞テルマシフト技術を用いて変異型SHP2および白血病の阻害剤を発見し、頻繁なSHP2発癌性変異体に特異的な薬物がこれらの癌の治療に大きな影響を及ぼすであろう。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオでは、抗GFP抗体でコーティングされたビーズを使用して、GFPタグ付き野生型および変異PD-1タンパク質の共免疫沈降を行う技術を示します。ビーズ結合したPD-1-GFPタンパク質は、PD-1と相互作用するSHP2タンパク質とインキュベートされ、SHP2の相互作用に重要な役割を果たすPD-1の特定の構造モチーフを同定することができます。...

トランスフェクション細胞における酵素受容体相互作用を研究するための免疫沈降アッセイ

ここでは、様々 な細胞モデルにおけるシグナル伝達経路の変化を識別するために抗体のアレイのためのプロトコルを提案する.薬/低酸素/超紫外光・放射、または過剰発現/ダウンレギュレーション/ノックアウトによって発生、これらの変更は様々...

抗体のアレイによるシグナル伝達経路の尋問でチロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性の評価

ここでは、co 免疫沈降法及び酵素採用し酵素活性細胞膜受容体の特定のタンパク質ドメインの貢献を同時に勉強するビーズの酵素活性測定のためのプロトコルを提案する.

受容体と酵素間の機能的相互作用を研究するため Co 免疫沈降分析

本稿は、化学剤のスクリーン ライブラリに阻害剤と T 細胞受容体のシグナル伝達に影響を与えるそれらのターゲットを識別するためフロー ベース フローサイトメトリー分析を使用します。ここで説明する方法は、ハイスループットス...

T 細胞受容体を介してライブラリ化学阻害剤のスクリーニングのメディエーターの同定

キナーゼ阻害剤のスクリーニングのための自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイの生成のための詳細なプロトコルが提示される。...

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

ここでは、細胞および組織からの内因性リンタンパク質ホスファターゼおよびそれらの相互作用タンパク質の濃縮、ならびに質量分析ベースのプロテオミクスによるそれらの同定および定量のためのプロトコルを提示する。...

リンタンパク質ホスファターゼとそのインターアクターを同定するための質量分析ベースのアプローチ

このプロトコルは、ラパマイシン制御ホスファターゼの設計、作成、および適用について説明しています。この方法は、生細胞におけるホスファターゼ活性化の高特異性と厳密な時間制御を提供します。...

ラパマイシン制御チロシンホスファターゼの開発と応用

RASopathyiesは、RAS-MAPK経路の過剰活性化によって引き起こされる多系統遺伝性症候群です。検証を待っている潜在的に病原性の多様体が次々と出現する一方で、前臨床のエビデンスが乏しいため治療が制限されています。ここでは、Teen-reporter ZebrafishのライブFRETイメージングにより、RASopathy関連ERK活性化レベルとその薬理学的調節を胚発生時に試験および交差検証するためのin...

ライブFRET顕微鏡法および免疫蛍光法による初期ゼブラフィッシュヌーナン症候群モデルにおけるERK活性調節を評価するための効率的なプロトコール

ここでは、酵母表面表示基質を酵素修飾アッセイに使用するためのプロトコールを紹介します。このプラットフォームは、代表的な酵素修飾アッセイとして、チロシンホスファターゼSHP-2の基質の1つに対する脱リン酸化活性の分析を使用して実証されました。...

酵母表面表示タンパク質の酵素修飾およびフローサイトメトリー評価

このプロトコルは、回復し、単一細胞レベルの分子遺伝学的解析の非対象の背景セルの混合物から珍しいターゲット セルを準備することです。DNA の品質は非処理の単一細胞であるし、により、単一セルに適用 (両方のスクリーニング...

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

学ぶ SHP2阻害剤の細胞標的関与評価法。384ウェル形式の細胞熱シフトアッセイを用いて、野生型およびがん原性変異体の標的結合を検出し、がん治療薬の効率的な創薬プロセスを支援する強力な手法を解説する。

SHP2(PTPN11)ホスファターゼ阻害剤による細胞標的関与の評価

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