SHP2(PTPN11)ホスファターゼ阻害剤による細胞標的関与の評価

チロシンホスファターゼSHP2は、細胞シグナル伝達の主要なメディエーターであり、細胞の生存および増殖を促進する。私のチームは、がん治療のための低分子SHP2阻害剤を見つけることに焦点を当てています。我々の技術は、細胞内の低分子SHP2阻害剤の標的関与と同様に、細胞浸透剤を確立するための迅速かつ強力な方法を提供する。

これは、探索リソースが効率的に送信されるように保証します。がん治療の魅力的なターゲットとしてSHP2。そして、いくつかのSHP2阻害剤は、臨床試験中である。

有効性プロファイルの改善を用いて次世代阻害剤の発見を促進する当社の技術。手順のデモンストレーションは、研究助手のセレステ・ロメロと、私たちの研究室の研究助教授のダグラス・シェフラーです。3ミリリットルの細胞剥離試薬を用いて、プレートからHEK293 T細胞を剥離し始める。

細胞を12ミリリットルの増殖培地で希釈し、1,400倍Gで遠心分離して4分間回収します。細胞の口蓋を10ミリリットルの増殖培地で再懸濁し、トリパンブルーと細胞カウンターで細胞の濃度と生存率を測定する。プレート700,000は、6つのウェル培養プレートの各ウェルに指数関数的に成長し、摂氏37度で24時間、および5%の二酸化炭素をインキュベートします。

翌日、2マイクログラムの血漿DNAを200マイクロリットルのトランスフェクションバッファーに希釈します。プラズマDNAを10秒間ボルテックスし、Gの1,400倍で4分間中央分離する。希釈したDNAに4マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加えます。

それを10秒間渦を起させ、遠心分離を繰り返します。DNAを摂氏23度で10分間インキュベートし、6つのウェルプレートに取り付けられたHEK293 T細胞にトランスフェクションミックスを加え、さらに24時間培養器に戻します。アッセイプレートを調製するために、DMSOの希薄インヒビター溶液は、10ミリモルのストック濃度のために、それらを384ウェル低死量ソースプレートに分配し、即時使用する。

0.5%DMSO未満の目標最終容積で384ウェルリアルタイムPCRプレートに液体ハンドラを使用して、阻害剤または車両の所望の容積を見つけます。不活性ガスパージでプレートシーラーを使用してプレートを密封します。トランスフェクト細胞を調製するために、成長培地を事前にインキュベートし、37°Cの水浴で剥離試薬を販売する。

インキュベーターから細胞を取り出し、ウェルから培地を軽く吸引します。各ウェルに0.3ミリリットルの細胞剥離試薬を加え、プレートをゆっくりと前後に揺らし、プレート底面を完全に覆います。2分間摂氏23度でプレートをインキュベートします。

各ウェルに1ミリリットルの成長培地を加え、ウェル内の細胞を穏やかにピペットします。その後、細胞を収集するために1,400回Gで細胞を遠心分離機15ミリリットルファルコン遠心分離管に移した。培地を軽く吸引し、次いで細胞ペレットを2ミリリットルの成長培地で再懸濁する。

パンブルーとセルカウンターを試して、セルの生存率が90%を超えているかどうかを確認します。細胞を1マイクロリットル当たり125個の細胞の濃度に希釈し、細胞を2時間以下の間懸濁させて最適な生存率を維持する。SHP2阻害剤によるインキュベーションの場合、細胞を無菌単一チャネル溶液トラフに分配する。

遠心分離機は、前に調製した384ウェルリアルタイムPCRプレートを2、500倍Gで5分間、シールを取り除き、125マイクロリットルのマルチチャネルピペットを使用して、希釈した細胞の5マイクロリットルを所望のウェルに加える。蓋を入れずに30秒間Gの42倍のプレートを遠心し、蓋を取り付け、摂氏37度と二酸化炭素5%で1時間インキュベートします。熱プロファイル勾配または等温実験のための原稿の方向に従って、サーモサイクラーをプログラムします。

サーモサイクラーヒートパルスプログラムを起動し、サーマルブロックにアッセイプレートを置きます。プログラムが終了したら、アッセイプレートを取り外します。ライセンス検出マスターミックスの5マイクロリットルでアッセイプレートの各ウェルを補います。

42倍Gでプレートを30秒間遠心し、暗闇の中で摂氏23度で30〜60分間保存します。最適化された統合時間を用いてマイクロプレートリーダーを使用して化学発光を測定します。野生型SHP2の熱勾配実験は、折り畳まれたタンパク質に典型的な狭い融解遷移を有するシグモイド細胞熱プロファイルをもたらした。

野生型SHP2のインキュベーションは、アロステリック阻害剤SHP099を用いて、有意かつ測定可能な程度まで熱プロファイルに安定化した。SHP2の安定化は、アロステリック化合物のようなSHP099の効力をもとに追跡される。10マイクロモルで、より強力なRMC-4550は、野生型SHP2のSHP099よりも大きな安定化度を生み出した。

そのユニークなメカニズムのために、アロステリック阻害剤のようなSHP099は、SHP2-E76Kを含む多くのSHP2発癌性変異体に対してあまり効果がありません。これらの既知の特性と一致するのは、SHP099によるSHP2-E76Kの限界熱安定化のみが観察される。EPLタグタンパク質の発現レベルは、シグナル強度に劇的に影響を与える可能性があります。

一過性で安定して統合された野生型細胞の熱プロファイル。同一の資産条件下で表示されます。異なる曲線の正規化は、EFC検出システムの広い範囲を明らかにし、同等の熱プロファイルを与える。

384ウェルプレートの短い軸に熱勾配を生成するサーマルサイクラー能力を利用して。一連の等温滴定は単一の版で行うことができる。最適な温度で、完全な10ポイントの線量応答を使用した等温滴定は、RMC-4550に有用なEC50を生み出した。

この資産の原理は、PROTAC化合物によって誘導される細胞内のタンパク質の分解を監視するために使用することができる。我々は、細胞テルマシフト技術を用いて変異型SHP2および白血病の阻害剤を発見し、頻繁なSHP2発癌性変異体に特異的な薬物がこれらの癌の治療に大きな影響を及ぼすであろう。