Name: 液相電子顕微鏡用化学固定哺乳類細胞のグラフェンエンクロージャ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶ液相電子顕微鏡用のグラフェンエンクロージャ技術で、哺乳類細胞の膜タンパク質を標識し、がん細胞の受容体を生体環境で可視化する方法です。電子線による損傷を軽減し、新たな治療戦略の開発に貢献します。

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D.B.ペッキースの細胞培養プロトコルの助け、原稿を見直したF・ワインバーグ、実験と数字の助けを求めるT・トランパート、フィギュアの助けを求めるS・スモルカ、INMを通じた彼の支援にE.アルツに感謝します。この研究は、エルゼ・クレナー・フレゼニウス・スティフトゥンによって資金提供されています。

1. ポリL-リジン(PLL)とフィブロネクチン様タンパク質(FLP)によるマイクロチップおよびコーティングの洗浄
<ol><li>SiN膜(2.0 x 2.6mm)のマイクロチップを50mLのアセトンに入れます。マイクロチップは平らな面を上に向けて慎重に処理します。フラットビークピンセットを使用してエッジを壊さないようにします。SiNウィンドウの破損を防ぐためにピンセットで取り扱う場合は、マイクロチップの上面に触れないようにしてください。 注:マイクロチップの損傷を防ぐために、ポリテトラフルオロエチレンコーティングまたはカーボンチップピンセットを使用することもできます。</li>
	<li>慎重にビーカーを振ってチップを2分間洗い、マイクロチップがひっくり返らないのを見てください。</li>
	<li>マイクロチップを50mLのエタノールに移し、ビーカーを慎重に振って2分間洗浄します。余分なアセトンが乾燥しないように、転送が速く行われます。</li>
	<li>マイクロチップを50mLの水で10分間洗います。</li>
	<li>20 mLのエタノールの作りたてのビーカーにマイクロチップを浸します。</li>
	<li>乾燥のためにクリーンルームのティッシュにマイクロチップを置く。</li>
	<li>プラズマは、70 mTorrで11.5 sccm O2 と35 sccm Ar、50 Wの無線周波数(RF)ターゲットでマイクロチップを5分間洗浄します。</li>
	<li>滅菌細胞の仕事のために層流フードにマイクロチップを置く。</li>
	<li>水に0.01%PLLの溶液を準備します。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で15μg/mL FLPの溶液を調製します。</li>
	<li>層流フードの下に24ウェルプレートを準備し、次の順序でソリューションの1 mLで5ウェルを個別に充填:ウェル1 - PLL;まあ2 - 水;まあ3 - 水;まあ4 - FLP;まあ 5 – PBS と ウェル 6 – PBS. 注:マイクロチップを示された24または96ウェルに数秒間ピンセットで浸して洗浄手順を行います。指示された時間と温度のために、示された溶液中の24または96ウェルのマイクロチップをインキュベートしてインキュベーションステップを行います。マイクロチップを数秒以内に別の井戸に移します。</li>
	<li>マイクロチップをPLL溶液に5分間インキュベートします。その後、マイクロチップを水で2回洗います。</li>
	<li>5分間、FLPでマイクロチップをインキュベートします。その後、PBSでマイクロチップを2回洗います。</li>
	<li>細胞の播種のための無血清培地の50 μLで事前に充填された新しい96ウェルプレートのウェル(マイクロチップごとに1つ)に両方のマイクロチップを移します。</li>
	<li>マイクロチップを37°Cおよび5%CO2でインキュ2ベートし、細胞懸濁液が調製されるまで調製する。</li>
</ol>2. SiN膜マイクロチップ上の細胞の播種
<ol><li>滅菌作業を確実にするために、すべての消耗品と装置を積層フローフードに設置します。</li>
	<li>乳癌細胞株SKBR3を、増殖培地と一緒に細胞培養フラスコで1回洗浄する。10%の胎児子牛血清(FCS)を含むダルベッコの修飾ワシ培地(DMEM)、および1%非必須アミノ酸(NEAAs)を増殖培地として使用してください。</li>
	<li>フラスコから分離した細胞まで細胞脱離液の1 mLで細胞をインキュベートします。</li>
	<li>フラスコの脱離した細胞に5mLの増殖培地を加える。この懸濁液を遠心分離管に移します。</li>
	<li>20μLの細胞懸濁液をヘモサイトメーターにピペット20μLし、細胞濃度を得る。次の数式を使用します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61458/61458equ01.jpg">.</li>
	<li>分散した細胞懸濁液を2.5 x 105 細胞/mLで調製します。次の方法で、準備されたセル懸濁液の必要量を計算します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61458/61458equ02.jpg"> 目的のボリュームに成長培地で埋める。</li>
	<li>細胞懸濁液の100 μLを、SiN膜を上向きにしたPLLおよびFLPコーティングされたマイクロチップを含む96ウェルプレートの2つのウェルに加え、各ウェルが25,000個の細胞を含むように、50 μLの無血清培地を加えます。</li>
	<li>プレートを37°Cで5%CO2で5分間2インキュベートし、細胞がマイクロチップに付着するのを待ちます。 注: この時点で、セルはまだ接着していないため、マイクロチップからセルを取り外すことができます。</li>
	<li>マイクロチップ上の細胞の密度を反転した顕微鏡で確認します。セルがウィンドウを覆い、フラットアウトして接着するのに十分なスペースがあることを確認します( 図 1Aを参照)。 注: 必要に応じて、この時点でさらにセルを追加できます。</li>
	<li>マイクロチップを200 μLの成長培地を含む新しいウェルに移し、一晩で37°Cと5%CO2 でインキュベートします。</li>
	<li>翌日の午後には、細胞が平坦化して視覚的に検査された合流性(すなわち、細胞で覆われた窓領域の分率)に付着した場合、両方のマイクロチップを無血清培地(血清飢餓培地)に移す(すなわち、細胞で覆われた窓領域の分画)約2/3( 図1B参照)。異なる実験25の比較のために必要に応じて定義された開始条件で細胞を持って来るために必要に応じて無血清培地に変更する。</li>
	<li>37°Cおよび5%CO2で一晩2インキュベートする。 注: 細胞量は他の細胞株の増殖速度や細胞形態によって異なる場合があることに注意してください。</li>
</ol>3. HER2のラベルと固定
<ol><li>補足表 1に記載されているとおりに、ソリューションを準備します。<ol>
<li>滅菌作業を確実にするために層流フードの下で働く。ラベリングプレートIと呼ばれる96ウェルプレートを使用し、マイクロチップあたり6つのウェルを200 μLのラベリングプレートI溶液で充填します:PBS/BSA、PBS/BSA/GS、抗体模倣体、PBS/BSA、PBS/BSA、PBS/BSA。マイクロチップごとにウェルプレートの1行(例えば、A1からA6)を使用してください。ラベリングプレートを37°Cに温める。</li>
		<li>ヒュームフードの下で、固定プレートと呼ばれる24ウェルプレートを準備し、500 μLの固定プレート溶液(CB、FA、CB、PBS、PBS、PBS、PBS/グリシン、PBS/BSA)でマイクロチップあたり8ウェルを充填します。 注意:CBは吸入または経口摂取によって急性毒性であり、水に有害である。適切な保護を備えたヒュームフードの下で作業し、安全データシート(SDS)に従ってCBを処分します。FAは腐食性であり、皮膚および健康に有害である。ヒュームフードの下で作業し、取扱いと処分に関する情報については、SDSを参照してください。</li>
		<li>ラベリングプレートIIと呼ばれる96ウェルプレートを準備し、マイクロチップあたり4つのウェルを200 μLのラベリングプレートIIソリューション(QD、PBS/BSA、PBS/BSA、PBS/BSA)で満たします。 注:ここでは、24ウェルプレートは、井戸内のマイクロチップをよりよく見るために使用されます。抗体模倣体(ステップ3.2)およびQD(ステップ3.4)を少なく使用するには、これらのステップに96ウェルプレートを使用してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>セルにHER2にラベルを付けます。<ol>
<li>これらのプレートが準備できたら、マイクロチップをラベリングプレート1の第1列のウェルに入れることでラベリングを開始する。</li>
		<li>マイクロチップをPBS/BSAで、ラベルプレートIとマークされた96ウェルプレートで洗浄します。</li>
		<li>ブロック非特異的部位は、PBS/BSA/GSを37°Cおよび5%CO2で5分間インキュベートすることにより、抗体模倣体の非特異的結合を防2ぐ。</li>
		<li>37°Cおよび5%CO2で10分間、200 nM抗体模倣体をインキュベー2トする。</li>
		<li>PBS/BSAでマイクロチップを3回洗います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>セルを固定します。<ol>
<li>マイクロチップをヒュームフードの24ウェル固定プレートに移します。 注:ここから無菌作業は必要ありません。</li>
		<li>CBで数秒間一度洗います。</li>
		<li><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li><li><li> </li><li></ol><ol><li><li> </li><li><li><li><li><li> </li><li> </li></ol><ol><li><ol><li> </li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li> </li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li> </li><li></li><li><li><li></ol><ol><li></li><li><li><li></li><li><li></li><li></li><li> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61458/61458equ03.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61458/61458equ04.jpg"> </li><li> <img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/61458/image001.png"></li><li></li><li><li><li></li></ol><ol><li><ol><li><li><li><li><li></ol></li><li><li> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61458/61458equ05.jpg"></li></ol>

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<li>Chung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

タンパク質の機能をよりよく理解するためには、無傷の細胞の血漿膜中のタンパク質の位置に関する情報を得ることが重要です。この情報を得るための方法としては、超解像蛍光顕微鏡11,2が挙げられる。超解像顕微鏡は、過去数年間でさらに発展してきましたが、その分解能は、細胞実験の実用的な条件のために約20nmに制限されていますが、典型的な受容体タンパク質は1〜10nmの範囲のサイズを有します。EMでは、単一細胞および単一分子レベルでタンパク質を可視化するのに十分な分解能を持つタンパク質のイメージングが可能です。しかし、断面化のために、従来のEM法は、通常、細胞をそのまま26に残さないため、細胞膜内のタンパク質のコンテキストおよび空間分布に関する重要な情報が失われることになる。クライオ-TEMを有する全細胞の方法は6に開発されており、タンパク質標識とクライオEM27を組み合わせることが可能であり、またクライオ-STEMは28を実証している。しかし、cryo-EMワークフローは、細胞の超構造とタンパク質構造を研究するために最適化されており、膜タンパク質空間分布を分析する目的ではあまりありません。臨界点乾燥法は、別の全細胞調製方法であるが、サンプルはいくつかの乾燥工程に供され、その技術は非常に時間のかかる29である。膜タンパク質は凍結破壊7を介しても調べられてきた。この方法では、細胞は固定され、凍結され、そして破壊される。破壊された部分は炭素層と白金層によって複製され、生物学的サンプルは除去される。その後、レプリカを EM30で分析できます。細胞全体のコンテキスト内の膜内のタンパク質の分布に関する情報が失われるため、凍結画分では全細胞分析が不可能です。
ここで提示される方法は、標本99、3131を薄くスライスすることなく細胞膜を研究することを可能にする。細胞は、EM画像と相関する蛍光画像から膜タンパク質の局在化が見えるようにそのまま保持されます。単一細胞および水和状態の無傷細胞内の単一分子レベルでタンパク質を研究することは、このグラフェン囲い方法9を用いてQD標識タンパク質のSTEMを用いて2nmの分解能で可能であることが示された。細胞を本来の状態に保つことは、タンパク質機能を理解し、治療アプローチのための新薬を開発するために重要な単一細胞および単一分子レベルで分析が可能であるように、膜タンパク質の空間分布を維持するので、非常に重要です。
EMを用いて生物学的試料をイメージングするもう一つの重要な側面は、電子ビームによって引き起こされるサンプルの放射損傷である。解決策は、炭素32の薄層間に試料を封入するなど、可能な限り電子線量の低減または種々のコーティング方法を含むことが多い。我々の方法は、グラフェンコーティングが非コーティングされたサンプルの細胞表面に出現するビーム誘発物を減少させることを示している。化学固定、グラフェン被覆生物試料の検査は2、D=(7.8±0.4)x 103 D e-/Å2までの電子線照射下で、試料に現れる明るいスポットなどの放射線損傷を伴わずに、電子線照射下で可能です。精巧なサンプル調製を伴う他のEM法と比較して、例えば、染色、埋め込み、(cryo-)切除、破砕等、ここで説明する方法は、より少ない時間で済む。タンパク質の標識は数時間以内に行われ、グラフェンコーティングは訓練を受けた研究者にとって約15分しか必要としません。サンプル調製は、蛍光顕微鏡に必要な手順と同等である。
プロトコルは、いくつかの手順で変更できます。マイクロチップ上のグラフェンは、フィルターペーパーでブロットしたときにグラフェンが動かないように空気乾燥することもできます。グラフェンが塩で汚染されている場合、塩を溶解し、汚染を最小限に抑えるために約1時間水面に浮かべさせることが可能です。グラフェン上で発生する銅またはPMMA汚染は、プロトコル内の対応するエッチングステップを延長することによって低減することができる。その他のグラフェンコーティング方法は、例えばグラフェン−PMMAを細胞に直接沈着させ、その後33のアセトンで洗浄してPMMAを除去したところに記載されている。我々の方法では、PMMAは、追加のアセトン洗浄ステップによって引き起こされる細胞への損傷を避けるためにコーティング前に除去した。NaClは、平坦であるためここで基材として選ばれたので、グラフェンにシワを付けないようにし、グラフェン9を放出して水に溶解する。また、所望のサイズに切断することができ、基質残基はグラフェン上に残っていません。しかし、これらの基準を考慮すると、塩化カリウムのような他の基質も同様に使用できる可能性があります。
潜在的な標識誘導クラスタリングの可能性を減らすために、GA固定ステップはFA固定後に直接実施することができ、その後、すべての膜タンパク質が固定化される。FAを用いた最初の固定ステップは、すでに生物学的構造を固定しているが、膜タンパク質拡散の減少レベルは依然として34に起こり得るが、QD当たり複数のストレプトアビジンの存在により標識誘発クラスタリングにつながる可能性がある。GAとの固定は、LM中に自己蛍光シグナルを導き、したがって、記載されたプロトコルにおいてLMの後に行われるが、他の34に記載されるように低減することができる。カコジレート緩衝液は非常に毒性があり、他の固定剤も同様に使用することができるが、カコジル酸塩は、EMプロトコルに一般的に使用されるバッファであり、沈殿を回避し、細菌および真菌の増殖を防ぎ、脂質膜35の超構造的完全性を維持するために必要なカルシウムイオンと互換性がある。必要に応じて、四酸化オスミウムは、脂質を安定化するための追加の固定として使用することができる。これは、細胞構造のコントラストを高めるのに役立ちますが、システムに別の金属を追加し、QDで得られるコントラストを減らします。
ここで説明するプロトコルには、よい指示を必要とする多くのステップが含まれています。マイクロチップのSiN表面を傷つけず、破損を防ぐために、マイクロチップを取り扱う前にいくつかのトレーニングが必要です。前述のように、SiN ウィンドウが時々中断する可能性がありますので、重複するマイクロチップを準備することをお勧めします。マイクロチップ上の必要な数の細胞を得るにも、ある程度の経験が必要です。グラフェンで細胞をコーティングすることは、水にグラフェンを浮かべる右の傾き角度を見つけるのが難しい可能性がありますので、いくつかのトレーニングが必要です。水からグラフェンを捕捉すると、薄いグラフェンを見ることも難しい場合がある。グラフェンがマイクロチップ上に入るとすぐに、余分な水をろ紙で消す必要があります。これは、マイクロチップからグラフェンを除去することを避けるために、そのようなフィルターペーパーの先端でのみ行われるべきです。
グラフェンコーティングは、サンプルにアーティファクトが現れるのを防いだ。しかし 、D < 4 x 102 e-/Å2 では、非コーティングされたサンプルにアーティファクトが出現し、2 つの非コーティングサンプルに対してのみアーティファクトが出現しました。したがって、非コーティング細胞の検査も可能と思われるが、グラフェンを使用し、人工物形成のリスクを回避する方が良いだろう。これらのアーティファクトの組成は、将来的に分析して、その形成を防ぐ方法についてのヒントを与えることができます。細胞の構造安定性については、グラフェンコーティングのわずかな改善が認められた。固定細胞は、検査された薄い領域で明らかに安定し、その構造はSiN膜の近くにあった。しかし、ここで調べなかったのは、真空4にさらされたときに細胞サンプルに発生することが知られている乾燥アーティファクトであった。細胞の乾燥は細胞の収縮を引き起こし、結果としてQD距離も変化する。ここで用いられる電子線量については、グラフェンコーティングと非コーティングされた試料のQDの距離は安定したままでした。EMに対するグラフェンコーティングの効果を調べるには、さらなる研究が必要です。
この方法の1つの制限は、細胞の化学的固定が必要であるということです。したがって、生細胞実験は行われません。しかし、標識が必要とされず、より高い構造安定性を有する細胞(例えば細菌)が使用される場合、固定されていない細胞は、異なる電子線量許容範囲を有するにもかかわらず、EM36 のグラフェンに封入することができる。また、タンパク質は直接検出できないので、タンパク質を可視化するためにQDが必要です。このメソッドは、ラベルのサイズを小さくすると便利です。議論のポイントは、超構造がはっきりと見えないことが良いか悪いかです。我々の方法は、選択したタンパク質のみが目に見える蛍光顕微鏡の方法と類似している。超構造の可視性を高めると、画像に多くの情報が追加され、ある時点で個々のラベル位置の検出が妨げられます。さらに、ここで説明する方法は、1種のタンパク質に対して、複数のタンパク質を標識することができるプロトコルの付加が必要である。最後に、抗体模倣体21 やnanobody38 などの結合分子に特異的に小さな高親和性が利用可能な場合にこの方法が機能する。一般的に使用される抗体ははるかに大きく、オリゴマーへのタンパク質サブユニットの機能的状態の検出を妨げるであろう。
この方法は、細胞を水和状態に保ちながらEMを用いて全細胞のタンパク質機能を研究するのに役立ちます。一連の細胞を容易に調べ可能である。他のタイプの細胞およびタンパク質も同様に研究することができる。タンパク質標識が必要ない場合、プロトコルのサブセットを多種多様な生物学的標本のグラフェンコーティングに使用することができます。細胞全体を研究する能力は、分子レベルでの膜タンパク質機能の相関を理解するための細胞研究に関連しています。

膜タンパク質機能の解析は、細胞生物学の研究や医薬品開発に不可欠です。重要な実験のクラスは、細胞内の膜タンパク質位置の検査を含みます.この情報は、タンパク質複合体中のタンパク質の組立と、動的アセンブリおよび分解によって、多種多様な細胞機能を駆動する形質膜内の特定の位置に関する結論を推測するために使用することができる。他の技術の中でも、細胞内のタンパク質機能を研究するために、光顕微鏡(LM)と電子顕微鏡(EM)が使用されています。LMは液体の細胞全体の分析を可能にする;しかしながら、この解像度は、従来の場合は200〜300nm、実際の条件下では超分解能蛍光顕微鏡では最大20nmに制限1,されている。EMは1Å解像度3前後を提供するが、従来のサンプル調製には脱水、画像コントラストを高める金属染色、樹脂などの実装物質への埋め込み、透過型電子顕微鏡(TEM)4が必要である。4よりネイティブな環境での生物学的サンプルを保存するために、クライオEM技術は55、66を使用することができる。サンプルは急速に非晶質の氷に凍結され、必要に応じて切り離される。もう一つの選択肢は、EM 7のフリーズフラクチャリングです。
EMは、その天然の、液体状態で無傷の細胞内の膜タンパク質を研究するための技術は、過去10年間で出現している8,9, 10,,11.10SiN膜上で増殖し、グラフェン9の層で封じ込められた全細胞の量子ドット(QD)標識膜タンパク質に対して2nmの空間分解能を達成した。
ここで、タンパク質標識及びグラフェンコーティング99,1212のプロトコルの詳細について説明する。このプロトコルの目的は、細胞を水和状態に保ちながら、固定細胞全体の膜におけるHER2の空間分布を分析することです。グラフェンによるコーティングは、真空中の細胞の乾燥を防止し、また放射線損傷13を低減する。この方法は、無傷の形質膜内の標識膜タンパク質に関する情報を提供するが、この方法は、EMで通常行われているように、細胞の超構造を研究するのに有用ではない。
グラフェンは、知られている最も薄いナノ材料であり、ハニカム格子14に配置された単一炭素原子厚結晶シートからなる。高い柔軟性と機械的強度を含むユニークな特性を有します。近年の研究では、欠陥のないグラフェンは気体や液体に対して不浸透性であるが、欠陥は水素透過を可能にする15。この漏れは、ここで使用される多層グラフェンを用いることで低減することができる。二重層グラフェンは、最近、クライオEMサンプルの支持として有用であることが示されており、不均一層のみが形成され得る酸化グラフェンに比べて薄氷層の均質性を向上させる。グラフェンはまた、液相透過電子顕微鏡13、17,17中の生体試料のビーム損傷を低減することが示された。例示的な実験として、哺乳がん細胞株SKBR3で発現したHER2は、STEMを用いて記録されたQDs18とその空間分布で標識した。細胞を、電子透過性SiN膜19を有するSiマイクロチップ上に播種した。マイクロチップは、堅牢で、LMおよびEMと互換性があり、ラベル付け手順全体をマイクロチップ19上で直接実行できるため、サポートとして選択されました。セルの添付後、HER2は2段階のラベル付けプロトコル20でラベル付けされた。まず、生物チン化抗HER2抗体模倣体化合物21をHER2に結合した。次に、細胞を化学的に固定して、標識誘発型受容体のクラスタリングを防止し、細胞の超構造の安定性を高める。ストレプトアビジンコーティングQDは、その後HER2抗体模倣複合体にリンクされた。QDの明るい蛍光信号と電子密度の高いコアは、相関蛍光と電子顕微鏡(CLEM)20を可能にした。CLEMは、STEM分析に関心のある細胞領域を、細胞上のHER2の局在を強調する蛍光顕微鏡画像の概要から選択できるため、特に有用である。細胞を蛍光顕微鏡で分析し、高いHER2レベルの細胞領域を同定した。その後、3〜5層厚いグラフェンシートを、コーティング99、2222のために細胞に移した。続いて、試料をEM試料ホルダーに取り付けた。このステムデータは、環状暗視野(ADF)検出器を用いて取得し、細胞表面の位置に対する細胞表面上のHER2の空間分布に関する情報を提供するが、細胞の超構造に関する情報は提供しなかった。電子線照射下での試料の安定性を決定するために、サンプルを画像系列において増加用量(D)で調べた。グラフェンコーティングサンプルと非コーティングサンプルの違いを調査した。数種類の放射線損傷を評価した。
ここで説明するプロトコルは、HER2 23を標的とするモデルシステムとして、哺乳類乳癌細胞株SKBR3を過剰発現するHER2を使用する。プロトコルは、1つのグラフェンコーティングされたサンプルの調製、および比較のためのグラフェンコーティングなしの1つの類似したサンプルを含む。SiNウィンドウは一度に一度壊れる可能性があるため、実験は重複して準備され、ほとんどの場合、実験重複を取得します。この方法の全体的な収率は、SiNウィンドウ全体がすべての場合においてグラフェンで覆われているわけではないにもかかわらず、グラフェン被覆細胞を有するマイクロチップが通常例外的な誤差で得られるという意味が高い。プロトコルでは重複は記述されません。
標識プロトコル(ステップ1〜5)は、24以前に発表されたCOS7線維芽細胞における表皮成長因子受容体の標識のプロトコルに匹敵する。その紙の詳細は、マイクロチップの取り扱い、およびウェルプレートの使用法に関して言及されています。HER2、グラフェンコーティング9の標識とサンプルの放射能を調べるプロトコルは以下のプロトコルに最適化されています。

<table><tbody><tr><td>HPLC用アセトン(最小99.8 %)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>2626-1L</td><td></td></tr><tr><td>AL54 analytical balance</td><td>Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany</td><td>30029077</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraction V, ビオチンフリー, &ge; 98 %, for molecular biology</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td><td>0163.2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 &micro;M</td><td>Affibody, Solna, Sweden</td><td>10.0817.02.0001</td><td></td></tr><tr><td>原子分解能分析顕微鏡 JEM-ARM200F</td><td>JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム塩三水和物 &ge; 98 %</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td><td>5169.1</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>7696781</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>7696782</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>7696792</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Multiwell Plates, treated, 96-well</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>7696794</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, ガラス底部, 1</td>コンパートメント <td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td>627861</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5418</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td>5401000010</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes 50 ml sterile</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>7696705</td><td></td></tr><tr><td>Corning CellStripper 非酵素的細胞解離溶液</td><td>Corning, NY, USA</td><td>25-056-CI</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>9286.1</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td><td>PK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Easypet</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td></td><td></td>4430000018</tr><tr><td>Eppendorf Research plusピペット可変、0.1 - 2.5 &micro;l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 &micro;l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette variable, 10 - 100 &micro;l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 &micro;l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>HPLC用エタノールアブソリュート (min. 99.9 %)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>2222-1L</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン様遺伝子組換えタンパク質*poly mer-plus</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>F8141</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡 Leica DMI6000</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td><td>10099141</td><td>ロット番号: 1751893</td></tr><tr><td>Gibco Goat Serum, New Zealand origin</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td><td>16210064</td><td>ロットナンバー: 1788320</td></tr><tr><td>Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>Galaxy 48R CO2 Incubator</td><td>New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td>CO48310001</td><td></td></tr><tr><td>Gatan Model 950 Solarus&mdash;プラズマ</td><td>クリーナーGatan GmbH、M&uuml;nchen, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド溶液 グレードI, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt,</td><td>Germany G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glycine &ge; 98.5 % Ph.Eur., USP, BP</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td><td>T873.1</td><td></td></tr><tr><td>倒立型実験顕微鏡 Leica DM IL LED</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td><td>DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Germany</td><td>MR 3002</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸 (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine</td><td>Biowest, Nuaill&eacute;, France</td><td>X0557-100</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド 76 mm x 26 mm</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752</td><td></td></tr><tr><td>MSc-Advantage&mdash;クラスII生物学的安全キャビネット</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ocean Microchips SiNウィンドウ 400x150 &micro;m, 200 nm スペーサー</td><td>DENSsolutions, デルフト, オランダ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omnifix 使い捨てシリンジ ルアーロック Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml)</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>10 mL: C542.1 20 ml: T550.1</td><td>Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany</td><td>VO 200</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>#291-0057</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 16 % 溶液、EM グレード</td><td>電子顕微鏡科学、ハットフィールド、ペンシルベニア州、米国</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Perfekt-Kescher ハンドル付き</td><td>Plano GmbH、ウェッツラー、ドイツ</td><td>T5112</td><td></td></tr><tr><td>ラック内のエアロゾルバリア付きピペットチップ、非滅菌</td><td>Labsolute、Th. Geyer GmbH + Co. KG、Renningen、ドイツ</td><td>2-200&micro;l:</td>ラックにエアロゾルバリア付き7695892<td></td></tr><tr><td>ピペットチップ、滅菌</td><td>Labsolute、Th. Geyer GmbH + Co. KG、レニンゲン、ドイツ</td><td>0.1-10 &micro;L:7695880 2-100 & マイクロ;L:7695883 100-1000 & マイクロ;L:7695886 1250 & マイクロ;l XL:7695887</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン0.01%溶液mol。WT.70.000 - 150.000</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 & micro;M</td><td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Q10121MP</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased</td><td>Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA</td><td>94-0451</td><td></td></tr><tr><td>丸型濾紙, 無灰, グレード 589/3 ブルーリボン, 直径 150mm</td><td>Schleicher &Schuell, Dassel, Germany</td><td>300212</td><td></td></tr><tr><td>Routine stereo Microscope Leica M60</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td><td>M60</td><td></td></tr><tr><td>Serological ROTILABOピペット, 滅菌済み (1 ml, 2 ml, 10 ml)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml)</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, ドイツ</td><td>1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット、滅菌済み、(5 ml、25 ml、50 ml)</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555</td><td></td></tr><tr><td>Shaking water bath SW22</td><td>Julabo GmbH, Seelbach, Germany</td><td>9550322</td><td></td></tr><tr><td>Nadium</td><td>chloride Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td><td>HN00.1</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム結晶、劈開 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm</td><td>International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA</td><td>9750</td><td></td></tr><tr><td>四ホウ酸ナトリウム十水和物、ACS 試薬、&ge; 99.5 %</td><td>Sigma-Aldrich、Merck、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>S9640-500G</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸ナトリウム</td><td>carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td><td>4365.2</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター ROTILABO PES, sterile 0.22 &micro;m</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG、カールスルーエ、ドイツ</td><td>P668.1</td><td></td></tr><tr><td>Trivial Transfer Graphene 3-5layers、1 cm x 1 cm</td><td>ACS 材料、カリフォルニア州パサデナ、米国</td><td>TTG30011</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット デュモクセル 03</td><td>製造 D'Outils Dumont SA、Montignez、スイス</td><td>0103-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>ピンセットInox 02</td><td>はD 'を製造していますOutils Dumont SA、Montignez、スイス</td><td>0102-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット、プラスチック交換可能な先端</td><td>Ideal-tek SA、Balerna、スイス</td><td>5SVR.SA</td><td></td></tr><tr><td>水ROTISOLV HPLC勾配グレード</td>Carl <td>Roth GmbH + Co KG、カールスルーエ、ドイツ</td><td>A511.2</td><td></td></tr></tbody></table>

液相電子顕微鏡用化学固定哺乳類細胞のグラフェンエンクロージャ

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

走査型電子顕微鏡(STEM)を用いて乳がん細胞の無傷の原形質膜におけるヒト上皮成長因子受容体2(HER2)を調べるプロトコルについて説明する。哺乳がん細胞株SKBR3の細胞は、窒化ケイ素(SiN)のシリコンマイクロチップ上で増殖した。細胞を化学的に固定し、HER2タンパク質を量子ドットナノ粒子(QD)で標識し、2段階のビオチン・ストレプトアビジン結合プロトコルを用いた。細胞は、水和状態を維持し、STEM中の電子ビーム損傷からそれらを保護するために、多層グラフェンでコーティングされました。電子線照射下での試料の安定性を調べるために、線量シリーズ実験を行った。グラフェンコーティングと非コーティングサンプルを比較した。ビーム誘発損傷は、明るいアーティファクトの形で、電子線量 Dの増加で非コーティングされたサンプルに対して現れたが、コーティングされたサンプルにはアーチファクトは現なかった。

図1Aは、窓が覆われているように播種された細胞を示しているが、平らにして付着するのに十分なスペースを有し、約2/3rd(図1B)の合流性をもたらす。rdマイクロチップ(図1C)に播種された細胞が多すぎる場合、すべての細胞がマイクロチップに付着するためのスペースが不足しています。図1Dは24時間後の同じマイクロチップを示す。細胞の半分以上が平らではなかった。一方、シードされるセルが少なすぎると (図 1E)、SiN ウィンドウは図 1Fに示すように 24 時間後に大きな空きスペースになります。Figure 1E図1Gは、図1Aおよび図1Bの細胞のFigure 1BDIC像を示す。図1Hは、HER2の標識が成功したことを示す黄色色の蛍光画像偽を示す。
代表的な STEM データを図 4に示します。グラフェンコーティング(左カラム)および非コーティング(右列)SKBR3細胞を調査した。図4A、Bは、ウィンドウ上のセルのM=800倍の概観画像を示す。 Mインセットとして示された領域は、用量シリーズ中にM= 80,000xで画像化された、図4C、Dを参照してください。DQDは明るいスポットとしてここに見えます。図4Eおよび図4Fは、図4Cの長方形の位置で取得したM=50,000x拡大画像Mを示し、D.D.D=(7.8±0.4)x D 103e-/Å2で用量系列3を取得した後に2両方の画像を記録した。この用量系列は、M=80,000xで記録した。露出した領域は長方形として認識することができ、それによって長方形は非コーティングされたサンプルのためにはっきりと見える(図4F)。
グラフェンの存在を検証するために、細胞のない領域の回折パターンが、SiNウィンドウ上のグラフェンの有無にかかわらず取得された。グラフェンの六角構造は、グラフェン被覆試料の回折パターン(図4G)で観察されたが、非被覆試料については存在しなかった(図4H)。単結晶グラフェンの回折パターンは、グラフェンの高度に秩序ある六角形構造のために6倍の対称性を有する。したがって、六角形の構造は、サンプル上のグラフェンの存在を示す。
試料に対する電子線照明の効果を調べるには、電子線量を蓄積した画像シリーズでSTEM画像を取得した。非コーティングおよびグラフェンコーティングサンプルの代表的な結果を、それぞれ図5A-Dおよび図5E-Gに示す。すべてのデータは細胞の端で取得され、細胞は最も平坦であり、観察された構造はSiN膜に最も近い。非コーティングされたサンプルの露出は、D = (1.9 ± 0.1) x 103 e-/Å2 (図5B)で細胞表面に明るい構造が現れる原因となった。これらの構造は、より高用量で大きくなった3ので、D=(7.8±0.4)x D 10 3e-/Å2(図5C,D)のシリーズの最後の画像ではっきりと見えるようになりました。2これらのスポットは、グラフェンコーティングされたサンプルのいずれにも現れなかった(図5E-G)。
追加のマイクロチップを、上記に記載されたプロトコルを用いて調製および検討した。6つのコーティングされたサンプルと7つの非コーティングサンプルを合計で調査した。7つの非コーティングされたサンプルのうち2つは、これらのアーティファクトを示した。コーティングされたサンプルのどれも追加の明るい点を示さなかった。
放射線損傷の別の尺度として、QD間の距離を調べた。構造的な損傷が発生した場合、QD間の距離が変化すると予想されます。距離の変化は、ペアの距離の範囲のために D を蓄積してQDの異なるペアのために測定されました。 図5H は、非コーティングサンプルの粒子の相対的な変化が平均1.3%を下回ったのに対し、コーティングされたサンプルの平均相対距離は0.8%を下回ったままであることを示しています。したがって、グラフェンコーティングはサンプルを安定化させたが、グラフェンコーティングのない乾燥中のサンプルも著しく安定していたと結論付けることができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig01.jpg"> 図1:シリコンマイクロチップとHER2のSiNウィンドウ上のセルシード(A)マイクロチップに播種した後5分のSKBR3細胞を有するSiNウィンドウ領域の例示的な画像。(B)同じ細胞が播種後5分後にSiマイクロチップ上の24時間後に同じSiNウィンドウ上に広がる(C)SKBR3細胞。(D) (C) 24時間後と同じセル。播種時にチップ上の細胞が多すぎたため、細胞は適切に平坦化しませんでした。(E)マイクロチップ上の細胞を播種後5分(F) マイクロチップにシードされた細胞が少なすぎるため、ウィンドウに表示されるセルは少なすぎる。(G) HER2のQD標識後の同じSKBR3細胞のDIC画像。(H)DICのオーバーレイ画像とHER2-QD655(黄色で偽色)と標識SKBR3細胞の対応する蛍光画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig02.jpg"> 図2:NaCl結晶へのグラフェンの洗浄と転写。(A)PMMA-グラフェンオンポリマーを純水に浸漬してPMMAグラフェンを放出する。PMMAグラフェンは、ガラススライドでキャッチすることができます。(B)過硫酸ナトリウム溶液を用いて銅系汚染をエッチングした。グラフェンを洗浄するために、脱イオン水を含むビーカーに移した。これらのステップを3回繰り返した。PMMAグラフェンを、その後、純水中のNaClの飽和溶液に移した。NaCl結晶を使用して、塩溶液からグラフェンを拾った。(C)NaCl結晶上のPMMAグラフェンを室温で30分間乾燥させた。PMMAは30分間アセトンでブロックをインキュベートして除去されました<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig02large.jpg" target="_blank">。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2.jpg"> 図3:Siマイクロチップに播種した細胞のグラフェンコーティング。(A)グラフェンコーティングの手順NaCl結晶上のグラフェンは水面に放出される。グラフェン片は、金属ループでキャッチされ、Siマイクロチップに転送されます。(B)グラフェンなしのサイズ 400 x 160 μm の SiN ウィンドウを持つマイクロチップ (2.0 x 2.6 mm)。SKBR3細胞は暗い斑点として見えた。(C)水で満たされたビーカーの表面に浮かぶグラフェン(赤い円)。(D) グラフェンは金属ループで捕まえた。(E) グラフェンがSiNウィンドウの上に置かれていたように、水滴に取り付けられたマイクロチップ。(F)グラフェンコーティング後のマイクロチップ。グラフェンは紫色のきらめきとして見えました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig04v2.jpg"> 図4:SiNウィンドウ上のグラフェン被覆および非被覆SKBR3細胞のSTEM。(A)M=800xで取得したグラフェン被M覆試料のSTEM画像A(B)M=800xで取得した非被覆試料MのSTEM画像B(C)M=80,000x画像は、青色の長方形の位置で記録されたA線で記録された。黄色い線で測定された距離の例を示す。C M(D) M = 80,000x 画像は青色の四角形の位置で記録され、黄色の線は粒子内で測定された距離の例です。(E) M = D = (7.8±0.4) x 103 e-/Å2に曝露された C と同じ領域の 50,000x 画像。(F) M = D と同じ領域の 50,000xD画像をD = (7.8±0.4) x 103 e-/Å2に露出します。露出したエリアははっきりと見えました。(G)細胞のない領域からのグラフェンコーティングされたサンプルの回折パターン。グラフェンの6倍の対称性は明るいスポットとして見える。(H)グラフェンを含まないサンプルの回折パターンは、6倍の明るいスポットを示さない。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig05.jpg"> 図5:グラフェンコーティングのないサンプルに生じるアーティファクト。(A)グラフェンコーティングを使用しないサンプル上の領域の最初の画像は2、M=80,000xで取得し、D=(0.39±0.02)x 10 2e-/Å2に曝露した。 M(B) D = (1.94 ± 0.1) x 103 e-/Å2 (黄色の矢印) で発生する最初のアーティファクトを持つ画像。(C, D)D = (7.8 ± 0.4) x 103 e - /Å2で取得したシリーズの最後の画像。アーティファクトは明るいスポットとして見えました。(E-G)グラフェンは、アーティファクトを生じさせることなくサンプルをコーティングしました。(E) D = (0.39 ± 0.02) x 102 e-/Å2 (F) D = (1.94 ± 0.1) x 103 e-/Å2 (G) D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/Å2.(H)グラフェンコーティングおよび非コーティングサンプルの粒子距離の相対的変化。2つの非コーティングサンプルは、アーチファクトを示し、そのうちの1つは(A-C)で示され、Dの2番目のサンプルの最後の画像と、3つのコーティングされたサンプルが分析された(1つはE-Gで示される)。合計で、1サンプルあたり10個のQDペアを調べ、250nm~3μmの距離を持つ。相対的な変化は、1つのグループ内のすべての測定値の平均を反映します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足表 1: ソリューションとバッファーのレシピ。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61458/Preparation_of_Solutions.xlsx" target="_blank">こちらの表をダウンロードしてください。</a>

ここで提示されるのが、哺乳動物細胞内の膜タンパク質を標識し、液体相走査型透過電子顕微鏡用グラフェンで試料をコーティングするためのプロトコルです。放射線による損傷に対するサンプルの安定性もこのプロトコルで研究することができます。

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

この方法は、生物試料をネイティブ環境に保ち、電子ビーム誘導アーティファクトを低減します。主な利点は、この技術が細胞全体に適用可能であるということです。したがって、細胞は電子顕微鏡の前に脱水、染色、または切除する必要はありません。無傷の形質膜全体の文脈で癌細胞の受容体を画像化する能力は、新しい治療法のアプローチと新しい抗癌剤の開発につながる主要な側面です。細胞、グラフェンコーティング、顕微鏡検査の研究を実演し、セルカン・ケスキンがグラフェンの作製方法を紹介します。まず、PLLとFLPコーティングされたマイクロチップを含む96ウェルプレートの2つのウェルに100マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、窒化ケイ素膜を上に向け、50マイクロリットルの無血清培地を加えます。プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%5%で5分間インキュベートし、細胞をマイクロチップに取り付けることができます。マイクロチップ上の細胞の密度を反転した顕微鏡で確認し、細胞が平らにして付着するのに十分なスペースで窓を覆っていることを確認します。細胞内にHER2のラベルを付けるには、マイクロチップをラベリングプレートの最初の行の井戸に入れる。次に、PBS BSAでマイクロチップを洗浄します。抗体模倣体の非特異的結合を防ぐために、マイクロチップをPBS BSA GSと5分間インキュベートする。その後、200ナノモル抗体模倣体を摂氏37度で10分間、炭酸ガス5%で模倣した。ポリマーからPMMAグラフェンを除去するために、PMMAグラフェンの周囲のポリマー上の水滴を数滴ピペットする。次いで、30〜45度の角度で水中に浸し、PMMAグラフェンを放出する。銅系汚染物質をエッチングするには、50ミリリットルの溶液を0.42モル硫酸ナトリウムを水中に入れます。標準的なガラススライドを使用して、グラフェン側を下にしてPMMAグラフェンを過硫酸ナトリウム溶液に移します。PMMAグラフェンは、溶液の上部に浮かびます。一晩そこに置いておきなさい。翌日、過硫酸ナトリウム溶液からPMMAグラフェンをきれいな水に移します。30分間水に浮かべましょう。PMMAグラフェンから過硫酸ナトリウム残渣をすべて除去するために、合計3回洗浄を繰り返します。次いで、PMMAグラフェンを塩化ナトリウム結晶上に移します。ペトリ皿の水中に塩化ナトリウムの飽和溶液を調製し、グラフェン側を下にして溶液の上にPMMAグラフェンを移します。ピンセットで塩化ナトリウム結晶を保持し、浮遊PMMAグラフェンを拾います。その後、2分間垂直に保持し、余分な水が流出させます。室温まで30分乾燥させ、オーブンで100度で20分間焼きます。水を完全に取り除きます。ガラスペトリ皿にアセトンを煙のフードのホットプレートで約50°Cに予熱します。火を避けるために温度を注意深く見てください。PMMAグラフェンを塩分に浸してアセトンを入れたペトリ皿に浸し、PMMAを30分間溶解させます。サンプル調製に使用する前に、塩空気乾燥にグラフェンを十分に乾燥させてください。調製したマイクロチップを純水で洗浄し、塩の残渣を緩衝液から取り除き、濾紙に貼ります。細胞は暗い斑点として表示されるはずです。カミソリの刃を使用して、塩化ナトリウム結晶の多層グラフェンをマイクロチップの窒化ケイ素の窓に合う部分にカットします。塩化ナトリウム結晶からグラフェンを水のビーカーに浸して取り出し、表面に対して45度の角度で結晶を傾けます。水面から金属ループでグラフェンをキャッチし、下のループ表面でマイクロチップの上面に触れ、マイクロチップが金属ループにくっつきます。グラフェンはマイクロチップの上に見ることができます。実体顕微鏡では、フィルターペーパーを使用してマイクロチップから残りの水を取り除き、グラフェンが窒化ケイ素シリコンウィンドウ上のすべてのセルを覆います。マイクロチップをピンセット付きのフィルターペーパーに置きます。グラフェンはマイクロチップ上の紫色のきらめきとして見える。マイクロチップを紙からコンパートメントペトリ皿に移します。水の液滴をフリーコンパートメントの1つにピペットし、蓋を閉じて水飽和雰囲気を提供します。その後、パラフィンフィルムでコンパートメント皿を密封し、冷蔵庫に4度で保存します。凝縮レンズを調整して、プローブサイズが0.2ナノメートル以上のアライメントサンプルを使用して、STEMを200キロボルトビームエネルギーに設定します。開口を挿入して、180ピコアアンペアのプローブ電流とビーム収束半角13.2ミリラジアンを設定します。プロジェクター・レンズの設定を調整して、ADF STEM検出器の半角度の範囲を68~280ミリラジアンに設定します。次に、STEM 画像サイズを 2048 x 2048 ピクセルに、ピクセルのドウェル時間を 6 マイクロ秒に設定します。グラフェンコーティングされた細胞を持つマイクロチップを、細胞が上向きになるようにテム用の標準的な標本ホルダーにロードし、ホルダーを電子顕微鏡にロードします。800 X 倍率で概要画像を取得します。次に、1.3ナノメートルのピクセルサイズで80,000 Xの量子ドットナノ粒子の対象領域および画像を同定する。最適に播種された細胞がここに示されている。窓は覆われていますが、平らにして付着するのに十分なスペースがあります。マイクロチップに播種した細胞が多すぎると、全ての細胞が接着するスペースが不十分であった。24時間後、細胞の半分以上が平らではなかった。播種された細胞が少なすぎると、窒化ケイ素のシリコンウィンドウは24時間後に大きな空きスペースになります。DICおよび最適に播種された細胞の蛍光画像をここに示し、HER2の標識に成功したことを示している。STEMはグラフェンコーティングおよび非コーティングSKBR3細胞に対して行った。800 X倍率画像のインセットは80,000 Xで画像化され、量子ドットナノ粒子は50,000 X倍率で明るいスポットとして見える。試料に対する電子線照明の効果を調べるには、電子線量を蓄積した画像シリーズでSTEM画像を取得した。非コーティングおよびグラフェンコーティングされたサンプルの代表的な結果を以下に示す。非コーティングされたサンプルの露出は、グラフェンコーティングされたサンプルのいずれにも発生しなかった明るい構造が細胞表面に現れる原因となった。粒子対の平均相対距離変化は、非コーティングサンプルでは1.3%以下、コーティングされたサンプルでは0.8%未満にとどまった。この手順に従って、他の顕微鏡法を用いて、異なる種類の膜タンパク質を全細胞上で画像化することができる。この技術により、無傷の血漿膜中のタンパク質を画像化して、その血漿膜の組織およびタンパク質間の相互作用に関するより多くの情報を得ることを可能にする。

graphene-enclosure-chemically-fixed-mammalian-cells-for-liquid-phase

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

グラフェン液体セル電子顕微鏡を使用して、他液体セル電子顕微鏡技術よりも空間分解能の大きい液体の環境でナノ結晶のダイナミクスを観察できます。エッチングは、ナノ結晶とグラフェンの液晶セルの透過型電子顕微鏡を使用してその形状を得ることができます次ナノ粒子変換についての重要な機構をあらかじめ作られました。...

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単層グラフェンのクライオ電子顕微鏡グリッドへの高分解能構造決定への応用

広視野顕微鏡を用いて長期的なイメージング哺乳類細胞

生きた細胞内の個々のDNA分子を観察する方法が記載されている。技術は目的のDNAに組み換え結合部位に蛍光標識lacリプレッサータンパク質の結合に基づいています。この方法は、時間をかけて生きている細胞内の多くの組換えDNAをたどるように適応させることができる。...

蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

細胞内ヘムレベルの変化は、癌などの一般的な病気と関連しています。そのため、多様な細胞におけるヘムの生合成レベルを測定する必要があります。このプロトコールの目標は、異なる細胞におけるヘム合成のレベルを測定および比較するための迅速で高感度な方法を提供することです。...

哺乳動物細胞におけるヘム合成レベルの測定

高品質の透過型電子顕微鏡画像を取得することは、特に植物細胞の場合、水で満たされた大きな液胞と曝気された空間が豊富にあるため、困難です。タンデム高圧凍結と急速凍結置換により、TEM用の植物試料の調製時間が大幅に短縮され、超微細構造保存性に優れた試料が得られます。...

タンデム高圧凍結および透過型電子顕微鏡のための植物組織の急速凍結置換

このプロトコルでは、否定的な汚損、詳細な構造と免疫金エクソソームの特定の蛋白質の位置を判断するための極薄断面透過型電子顕微鏡に必要な様々...

サンプル準備および透過電子顕微鏡によるエクソソームのイメージ投射

楽器と透過型電子顕微鏡のためのナノリットル サイズ サンプル ボリュームの準備のためのメソッドが表示されます。これは蛋白質の大幅にサンプルの損失を削減し、単一細胞ライセート visual...

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

学ぶ液相電子顕微鏡用のグラフェンエンクロージャ技術で、哺乳類細胞の膜タンパク質を標識し、がん細胞の受容体を生体環境で可視化する方法です。電子線による損傷を軽減し、新たな治療戦略の開発に貢献します。

液相電子顕微鏡用化学固定哺乳類細胞のグラフェンエンクロージャ

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