MCF7細胞単層における細胞基質接着面積と細胞形状分布の定量化
2020年6月24日
本稿では、1)焦点接着のサイズと数および2)細胞形状指標およびMCF7細胞のコンラエント単層の共焦点画像からの分布の定量化について説明する。
このプロトコルは、その2次元画像から細胞内構造の面積、周長、形状の定量化を可能にする。この技術は、迅速かつ簡単で、唯一の標準的な実験室の設定と共焦点顕微鏡を必要とし、オープンソースソフトウェアを使用しています。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生、アンナ・バルセラクです。
摂氏37度と5度の二酸化炭素インキュベーターで24時間培養するために、4ウェルコラーゲン1コーティングチャンバースライドで、ウェルあたり0.5ミリリットルの培養培地に10〜5番目の細胞を4回播種することから始めます。翌朝、光学反転顕微鏡を使用して、少なくとも90%コンフルエント単層の存在を確認し、共焦点顕微鏡を使用して単一のZスライス画像を得る。焦点接着解析では、ImageJ で画像を開き、解析、尺度の設定、尺度の削除、およびグローバルを選択して、イメージのスケールをピクセル単位で設定します。
計測オプションに対象領域のファイル名と領域を含めるには、[解析]をクリックして測定値を設定し、面積と表示ラベルオプションを確認します。背景を減算するには、プロセスを選択し、背景を減算します。ローリングボールの半径を50ピクセルに設定し、スライド式放物線をチェックします。
関心の最小領域の面積を決定するには、最小の単一焦点接着を概説し、分析をクリックして面積を測定します。対象となる領域が少なくとも 20 個選択され、測定された場合は、得られた結果の平均値を計算して保存します。上部境界を一般的なセル領域の 25% に設定します。
画像をバイナリに付与するには、画像、調整、およびしきい値をクリックし、デフォルト、白黒、および暗い背景を確認します。対象領域の数と領域を測定するには、粒子の解析と分析を選択してピクセル単位を確認し、結果を表示し、結果をクリアし、集計します。スライス、カウント、および合計エリア平均サイズデータを要約ウィンドウから選択したデータ管理プログラムに転送します。
焦点接着定量のために、焦点接着ImageJマクロを開き、関心の最小領域パラメータの面積として関心の最小領域の領域を入力します。しきい値の種類の値を手動または自動に設定し、変更を保存します。次に、ImageJ からマクロを呼び出し、処理するイメージを選択します。
手動のセル形状解析では、適切な画像処理ソフトウェアプログラムで画像を開き、測定するパラメータを選択します。フリーハンド選択ツールを使用して、選択した結合タンパク質によってマークされたセル境界を手動で線分します。選択したパラメータは、セルごとに自動的に計算されます。
すべてのセルのアウトラインが作成されたら、[編集]、[選択]、および [マネージャに追加] を選択します。罫線が途切れない完全な可視セルのみを選択する必要があります。測定を行う場合は、関心領域マネージャーの左側のボックスに表示されるすべての数値をマークし、[メジャー] をクリックします。
結果は結果ボックスに表示され、選択したスプレッドシートにインポートできます。自動化された細胞分析は多数の細胞の定量化を促進する。新しいセルの種類ごとに、まずマクロを実行してパラメータを設定します。
マクロが終了したら、[セル サイズの境界を設定する] を選択します。最小セルと最大セルのラベルをクリックし、[メジャー] をクリックします。最小セルと最大セル変数の値を設定し、変更を保存します。
すべてのマクロ ウィンドウを閉じ、グレースケールで処理するイメージを選択します。その後、マクロを再実行します。このマクロは、セル図形のインデックス、縦横比、および対象となる選択リスト データの領域を含む結果のテーブルを提供します。
ここで、最終的な番号のアウトラインと、コントロールとノックダウンの両方の細胞線の元の画像を持つ焦点接着の輪郭のオーバーレイを含むImageJでカウントされた焦点接着の代表的な画像が観察できる。この分析で示されるように、ノックダウン細胞は、コントロールセルライン細胞と比較して、より大きなサイズの接着と同様に、細胞あたりの接着の数が多いことを実証しました。これらの画像では、未治療および化学療法的に処置された細胞単層の代表的領域が示されている。
この分析では、この分析では、最後のビンの増加と、薬物処理された細胞の主ピークの平坦化を未治療の対照と比較して、それらの細胞形状の指標値に従って特徴付けた。その後、各細胞培養に対して周波数分布と累積分布を生成できます。実演したように単層のグレースケールイメージングは、12の視野から512個の細胞の分析と定量を可能にし、細胞形状指数の相対的な周波数分布を明らかにした。
このプロトコルを動作させるためには、可能な限り最高の品質のイメージを使用することが重要です。適切な細胞の播種、染色、およびイメージングは、十分な実験品質の画像を確保する必要があります。
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概要
この記事では、共焦点イメージングを使用して、MCF7細胞の密集単層における局所接着と細胞形状指数の定量化のプロトコルについて詳しく説明しています。この研究は、接着と細胞形状の両方の変動をアクセス可能なイメージング技術を通じて分析する方法を強調しています。
主要な研究要素
研究分野
- 細胞生物学
- 局所接着分析
- 細胞形状定量
背景
- 局所接着は、細胞接着とシグナリングに重要です。
- 細胞形状と接着の理解は、がん生物学の研究に影響を与える可能性があります。
- MCF7細胞は、乳がん研究のモデルシステムとして役立ちます。
使用された方法
- 細胞構造のイメージングのための共焦点顕微鏡。
- 局所接着面積と細胞形状指数の分析のためのImageJソフトウェア。
- 効率的なデータ収集のための手動および自動化された分析プロトコル。
主な結果
- ノックダウン細胞では、対照群と比較して、より多くの数の、より大きなサイズの局所接着が観察されました。
- 未処理細胞と薬物処理された細胞の間で、細胞形状指数の差異が認められました。
- 堅牢な方法論により、大規模なサンプルサイズの分析が可能となり、統計的関連性が向上しました。
結論
- この研究は、細胞形態と接着特性の分析のための信頼できるプロトコルを提供します。
- この結果は、がん研究および開発に関連する細胞の機械的特性の理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying focal adhesion dynamics and cell shape distributions provides mechanistic insights into cancer cell behavior, supporting target validation in oncology drug discovery. This protocol enables reproducible, image-based assessment of adhesion and morphology, facilitating phenotypic screening and preclinical model characterization. The approach supports data-driven go/no-go decisions by linking molecular perturbations to functional cellular outputs relevant to therapeutic response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying changes in focal adhesion number and size as functional readouts of target modulation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized, image-based metrics that correlate molecular interventions with cellular phenotypes.
- Predictive Value: Generates quantitative adhesion and shape data that enhance confidence in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated, quantitative outputs (adhesion area, count, shape index) suitable for high-content screening workflows.
- Reproducibility: Uses standardized staining, imaging, and open-source analysis to ensure consistent results across experiments and laboratories.
- Scalability: Automated macro-based analysis allows processing of large cell populations, supporting assay miniaturization and throughput.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to breast cancer models using MCF7 cells, enabling mechanistic de-risking of oncology targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by providing quantifiable, morphology-based biomarkers of drug response.
- Risk-Adjusted Advancement: Shape and adhesion distributions inform predictive models for cellular behavior in therapeutic contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly in cancer mechanobiology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable changes in adhesion and morphology.
- Screening: Delivers standardized, quantitative image outputs that enable reliable compound effect assessment in adherent monolayers.
- Analytics: Provides numerical readouts (focal adhesion count, size, cell shape index) that facilitate condition comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through morphology-based biomarkers that reflect drug-induced cellular changes.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other cellular structures (e.g., mitochondria, nuclei) and cell types, supporting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in mechanistic links between targets and cellular phenotypes.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through defined staining, imaging, and analysis parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing objective, quantifiable phenotypic data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional adhesion and shape outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, immunofluorescence staining, and confocal microscopy operation.
- Dependent on access to confocal microscopes and computers capable of running ImageJ and associated macros.
- Necessitates standardization of image acquisition settings (z-slice, lighting, focus) across users and experiments.
- Adaptation to new cell types or structures requires initial parameter optimization (e.g., size thresholds, staining validation).
- Limited to 2D image analysis; does not capture 3D adhesion dynamics or subcellular localization without modification.
