Name: ヒトナチュラルキラー細胞代謝の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学ぶヒトナチュラルキラー細胞の糖解解とミトコンドリア呼吸の測定法。細胞外フラックスアナライザーを用いて酸素消費とpH変化をリアルタイムで測定し、最大92サンプルの高スループットスクリーニングが可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、マイケル・N・サック博士(国立心臓・肺・血液研究所)の支援と議論に感謝する。この研究は、国立衛生研究所、国立がん研究所、国立心臓、肺、血液研究所の壁内研究プログラムによって支援されました。JT は MICINN (スペイン) のラモン y カハル プログラム (助成金 RYC2018-026050-I) によってサポートされています。

<ol><li>Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+natural+killer+cell+responses%3A+integration+of+signals+for+activation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition.</a> Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).</li>
<li>Caligiuri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human natural killer cells.</a> Blood. 112 (3), 461-469 (2008).</li>
<li>Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+Cell+Proliferation+Induced+by+IL-15+Transpresentation+Is+Negatively+Regulated+by+Inhibitory+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors.</a> Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).</li>
<li>Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-2+augments+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-2 augments natural killer cell activity.</a> Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).</li>
<li>Anton, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-endocytosis+of+intact+IL-15Ralpha-IL-15+complex+from+presenting+cells+into+NK+cells+favors+signaling+for+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).</li>
<li>Marcais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+checkpoint+kinase+mTOR+is+essential+for+IL-15+signaling+during+the+development+and+activation+of+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells.</a> Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+Maximum+Glycolytic+Capacity+Using+Extracellular+Flux+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements.</a> PloS One. 11 (3), 0152016(2016).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Proton+Leak+Plays+a+Critical+Role+in+Pathogenesis+of+Cardiovascular+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).</li>
<li>Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+Cell+Metabolism+and+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2278(2019).</li>
<li>Felices, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+treatment+with+IL-15+exhausts+human+NK+cells+via+a+metabolic+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219(2018).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+First-in-Human+Phase+I+Study+of+Subcutaneous+Outpatient+Recombinant+Human+IL15+%28rhIL15%29+in+Adults+with+Advanced+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).</li>
<li>Conlon, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL15+by+Continuous+Intravenous+Infusion+to+Adult+Patients+with+Solid+Tumors+in+a+Phase+I+Trial+Induced+Dramatic+NK-Cell+Subset+Expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).</li>
<li>Dubois, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL15+Infusion+of+Cancer+Patients+Expands+the+Subpopulation+of+Cytotoxic+CD56%28bright%29+NK+Cells+and+Increases+NK-Cell+Cytokine+Release+Capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities.</a> Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).</li>
<li>Traba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasting+and+refeeding+differentially+regulate+NLRP3+inflammasome+activation+in+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).</li>
<li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Optimized+Protocol+to+Analyze+Glycolysis+and+Mitochondrial+Respiration+in+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54918(2016).</li>
<li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%2C+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li>
<li>Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry-based+Assay+for+the+Monitoring+of+NK+Cell+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54615(2016).</li>
<li>Theorell, J., Bryceson, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Intracellular+Ca%282%2B%29+Mobilization+in+Human+NK+Cell+Subsets+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li>
<li>O'Brien, K. L., Finlay, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunometabolism+and+natural+killer+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunometabolism and natural killer cell responses.</a> Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).</li>
<li>Ahn, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+mitochondrial+deacetylase+Sirt3+in+regulating+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).</li>
<li>Stram, A. R., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+in+mitochondria%3A+protein+signaling+in+the+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).</li>
<li>Armstrong, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+alters+mitochondrial+bioenergetics+and+modifies+pancreatic+cell+death+independently+of+cyclophilin+D%2C+resulting+in+an+apoptosis-to-necrosis+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+Analysis+of+Extracellular+Acid+Production+to+Determine+Glycolytic+Rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53464(2015).</li>
<li>Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+lipophilic+cation+for+determination+of+membrane+potential+in+neuroblastoma-glioma+hybrid+cell+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).</li>
<li>Michelet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+natural+killer+cells+in+obesity+limits+antitumor+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses.</a> Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

本論文では、末梢血から純粋で生存可能な初代ヒトNK細胞を効率的に単離し、培養するためのプロトコルを確立した。また、細胞外フラックス分析装置を用いることで、酸素消費率や細胞外酸性化率で評価したNK細胞の代謝活性測定条件を最適化しました。他の呼吸法と比較して、細胞外フラックス分析装置は高速であり、少数の細胞を必要とし、高スループットスクリーニングを可能にする。しかし、その試薬は高価であり、化合物の注射はわずか4に制限されています。NK細胞におけるサイトカインによる糖分解および酸化リン酸化の代謝リモデリングおよび活性化は、堅牢なNK細胞応答21に不可欠であり、ここで説明する技術は、NK細胞の代謝プロファイルをリアルタイムで研究することを可能にする。このプロトコルは、IL-2、IL-12およびIL-18、または活性化受容体に結合する抗体などの他のサイトカインによって活性化された細胞に拡張することができる。最適な合流点で細胞をめっきしたり、最適な結合を使用して最大酸素消費量を刺激するなど、見落とされがちないくつかの重要なステップに取り組んでいます。しかし、実際のO2レベル曲線(...

ナチュラルキラー(NK)細胞は、抗腫瘍および抗ウイルス応答を媒介する生来のリンパ球である。NK細胞は、ヒト末梢血中の全リンパ球の5~15%を含み、脾臓、肝臓、骨髄およびリンパ節にも含まれる。NK細胞は、T細胞受容体(TCR)やB細胞受容体(BCR)などの多形性クロオチピッレセプターを発現しない。対照的に、それらの細胞分解機能の活性化は、標的細胞11,22の表面上の不変リガンドを認識する受容体の関与によって促される。
末梢血から分離されたヒトNK細胞は、ヒト血清を添加した培地で数日間生存することができる。IL-15やIL-2などのサイトカインによるNK細胞の活性化は、細胞を増殖させ、その殺滅能力の増加に駆り立て、他の効果の中でも,3、4、5。,5いくつかの研究は、NK細胞活性化と代謝活性の変化との間に直接的な相関関係を示している6.これらの代謝変化は、エネルギーと生合成の観点から細胞の特定の要件を満たす運命にある。
好気性細胞や生物は、炭水化物、脂肪、タンパク質の異化と酸化を伴う一連の化学反応を通じてエネルギーを得る。解糖、三カルボン酸(TCA)サイクルと酸化リン酸化を組み合わせて、真核生物細胞はATPの需要の大半を満たし、細胞増殖および増殖に不可欠な高分子のビルディングブロックとして必要な中間体を得る。解糖のプロセス(図1A)は、細胞内のグルコースの侵入から始まります。細胞質では、グルコースはリン酸化され、ピルビン酸(グルコース分子あたり2分子のATPの正味生産)に変換され、乳酸に還元したり、ミトコンドリアに輸送してアセチルCoAに変換してTCAサイクルに入ることができます。TCAサイクルは、アセチルCoAのより多くの分子を燃料としてサイクリングを続け、CO2 を生成します(最終的には細胞の外に拡散し、培地中でH2Oと反応することによって、培地の酸性化につながる炭酸を生成します)とNADHは、電子輸送鎖に電子を寄付する分子(ETC)。。電子は異なるタンパク質複合体を通過し、最終的に酸素によって受け入れられます。これらの複合体(I、IIIおよびIV)も、ミトコンドリアマトリックスから膜間空間にH+ をポンプする。生成された電気化学的勾配の結果として、H+ は、ATPの生成に蓄積された潜在的なエネルギーを投資する、複雑なV(ATP-シンターゼ)を介してマトリックスに再び入ります。
解糖とミトコンドリア呼吸の両方は、阻害剤を使用することによって異なる点で遮断することができます。これらの阻害剤の知識と使用法は、細胞外フラックスアッセイの開発の基礎となった。pHや酸素などの2つの単純なパラメータをリアルタイムで測定することにより、細胞外フラックス分析装置は、96ウェルプレートにおける解糖およびミトコンドリア呼吸の速度を推測します。解糖解析ストレス試験は、グルコースを含まない基底培地(図1B)7で行7われる。細胞外酸性化率(ECAR)の最初の測定は、解糖非依存性酸性化を示す。非解糖酸化と呼ばれ、TCAによって産生されるCO2と相関し、前述のように、培地中のH2Oと結合してH+(TCA結合ECAR)を生成する。最初の注射は、グルコースの利用を誘導し、解糖を高めるためにグルコースです。2回目の注射は、両方のロテノーネを組み合わせた、 複合体I阻害剤と、複合体III阻害剤であるアンチマイシンAは、細胞の細胞ATPレベルを維持するために解糖分解を活性化することによって、このミトコンドリアATP産生の劇的な減少に応答するETC.細胞をブロックし、これは基底状態の細胞によって使用されないが、ATP需要の増加に応じて潜在的に採用することができる解糖の量を表す(コンペンサ第3の注射は、グルコースアナログ2-デオキシグルコース(DG)であり、これは、酵素ヘキソキナーゼの基質としてグルコースと競合する。このリン酸化の産物である2-デオキシグルコース-6-リン酸はピルビン酸に変換できないため、解糖が遮断され、ECARが最小限に下がります。この時点で測定されたECARには、解糖または呼吸活性に起因しない他の細胞外酸性化源と、2-DG(ポスト2-DG酸化)によって完全に阻害されない残留解糖が含まれる。
ミトコンドリアストレス試験は、グルコースを有する培地(図1C)8で8行われる。酸素消費率(OCR)の最初の測定は、ミトコンドリア呼吸の基本線(基底呼吸)に対応しています。最初の注射は、ATP合成酵素(複合V)を介して陽子の戻りを阻害するオリゴマイシンであり、ATP合成を遮断し、したがってミトコンドリア膜を急速に過分極し、呼吸複合体を通して更にプロトンのポンピングを防ぎ、OCRの減少をもたらす。ベースライン呼吸とオリゴマイシンの添加によって与えられた値との比較は、ATP結合呼吸を表す。酸素消費量の残りのオリゴマイシン無感率はプロトンリークと呼ばれ、これはアデニンヌクレオチドトランスロケース9のようなミトコンドリア膜内の脂質二重層またはタンパク質を通るプロトンの流れを表す。第二の注射は、アンカプラー2,4-ジニトロフェノール(DNP)、ミトコンドリアマトリックスへのH+の大量の侵入を誘発するイオノフォアであり、ミトコンドリア膜の脱分極化およびミトコンドリアATP合成の破壊につながる。細胞は、膜電位(最大呼吸能力)を回復しようとする無駄な試みにおいて、電子輸送速度と酸素消費量を最大レベルに増加させることによって、プロトン動機力の消滅に反応する。最大呼吸能力と基底呼吸の違いは、細胞の予備呼吸能力であり、これは細胞が基礎状態でATPを生成するために使用しない呼吸量を表すが、ATP需要の増加に応じて、またはストレス8の条件下で潜在的に募集することができる。3回目の注射はロテノーネとアンチマイシンAの組み合わせです。この注射は、ETCとOCRが最も低いレベルに完全に減少し、残りの酸素消費量は非ミトコンドリア(NADPH-オキシダーゼなどによって引き起こされる)になります。
代謝経路の変化は、インビトロでサイトカインを用いたNK細胞の連続的な活性化が、異なる代謝経路10,11の研究によってNK細胞枯渇を引き起こす可能性が示唆されているので、11何らかの形でNK細胞の機能を予測することができた。NK細胞の代謝状態と機能の相関は、がん免疫療法の観点から非常に重要です。この分野では、IL-15の注入を伴うNK細胞の活性化は、単独で、またはモノクローナル治療抗体と組み合わせて、腫瘍細胞死死を改善するために試験されている12、13、14。,1412,これらの治療戦略に応じてNK細胞の代謝状態に関する知識は、NK細胞活性化状態および殺死機能の貴重な予測を提供するであろう。
単球などの他の骨髄系およびリンパ球細胞における代謝経路の研究は、TおよびB細胞が15と記載されており、最適化された方法が16に公表されている。このプロトコルでは、大量の純粋かつ生存可能なNK細胞を生成するNK絶縁プロトコルと、細胞外フラックス分析装置を用いて代謝活性を測定するための最適化されたプロトコルの両方を組み合わせた方法を提供する。ここでは、安静細胞およびIL-15活性化ヒトNK細胞の代謝変化の研究に有効な方法であることを示す。細胞外フラックスアッセイでは、細胞数や薬剤濃度などのパラメータがテストされ、最適化されています。他の呼吸法と比較して、細胞外フラックス分析装置は完全に自動化されており、非常に少量の細胞を同時に、最大92サンプルでリアルタイムでテストすることができ、比較的迅速な方法で(複数のサンプルと反復で)高スループットスクリーニングを可能にする17。
NK細胞代謝を研究することでNK細胞機能を評価する研究者が利用できる。これは、他のサイトカイン、抗体または可溶性刺激によって活性化された細胞にも適用することができる。

<table><tbody><tr><td>2-デオキシ-D-グルコース(2-DG)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>D8375-5G</td><td>解糖ストレステストインジェクターコンパウンド</td></tr><tr><td>2,4-ジノトロフェノール(2,4-DNP)</td><td>ミリポアシ</td><td>グマ D198501</td><td>ETCアンカプラー/ミトコンドリアストレステストインジェクターコンパウンド</td></tr><tr><td>96ウェル細胞培養プレート/蓋付き丸底</td><td>Costar</td><td>3799</td><td>NK細胞培養</td></tr><tr><td>アンチマイシンA</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A8674</td><td>コンプレックスIII阻害剤/解糖系およびミトコンドリアストレス試験用インジェクター化合物</td></tr><tr><td>BD FACSDIVA ソフトウェア</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>フローデータ収集</td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>フローデータ収集</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>細胞接着</td></tr>性 <tr><td>CyQUANT細胞増殖アッセイ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C7026</td><td>DNA定量のための細胞増殖アッセイ。細胞溶解バッファーとCyQUANT GR色素を配合</td></tr><tr><td>EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II</td><td>Stemcellテクノロジー</td><td>17851</td><td>PBMCからのNK細胞単離</td></tr><tr><td>EasySep Human NK cell Enrichment Kit</td><td>Stemcellテクノロジー</td><td>19055</td><td>PBMCからのNK細胞単離</td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>Stemcellテクノロジー</td><td>18001</td><td>PBMCからのNK細胞単離</td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M、pH 8</td><td>品質Biological</td><td>10128-446</td><td>NK sell separation</td></tr><tr><td>buffer FACS tubes</td><td>Falcon-Fisher Scientific</td><td>352235</td><td>Flow cytometry experiment</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Conical tubes</td><td>Falcon-Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>NK cell separation</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td>NK cell separation buffer</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>フローデータ分析</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>ミリポアシグマ</td><td>G8270</td><td>ミトコンドリア負荷試験媒体の成分。解糖ストレス試験 インジェクター化合物</td></tr><tr><td>Halt プロテアーゼ阻害剤 カクテル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>78429</td><td>プロテアーゼ阻害剤 100X. RIPA溶解バッファーでの使用</td></tr><tr><td>ヒトIL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15-50ug</td><td>NK細胞刺激</td></tr><tr><td>ヒト血清 (HS)</td> <td>Valley Biomedical</td><td>9C0539</td><td>NK細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td>NK細胞培地</td></tr><tr><td>L-グルタミン (200 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td>ストレステスト培地の成分</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34965</td><td>フローサイトメトリー染色用生存率色素</td></tr><tr><td>LSM</td><td>mpbio</td><td>50494X</td><td>PBMCs ヒト血液からの分離</td></tr><tr><td>マウス抗ヒト CD3 BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563725</td><td>T細胞フローサイトメトリー染色</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD56 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>555516</td><td>NKフローサイトメトリー染色</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトNKp46 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>557991</td><td>NKフローサイトメトリー</td></tr>染色 <tr><td>オリゴマイシン</td><td>ミリポアSigma</td><td>75351</td><td>コンプレックスV阻害剤/ミトコンドリアストレステストインジェクター化合物</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>NK細胞分離バッファー</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>For determination of protein</td></tr><tr><td>concentration RIPA Buffer Boston</td><td>BioProducts</td><td>BP-115</td><td>Cell lysis</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>MilliporeSigma</td><td>R8875</td><td>Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Controller Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>タツノオトシゴXFe96アナライザー用コントローラー</td></tr><tr><td>タツノオトシゴウェーブデスクトップソフトウェア</td><td>Agilent</td><td></td><td>データ分析用</td></tr><tr><td>タツノオトシゴXFベース ミディアム</td><td>Agilent</td><td>102353-100</td><td>細胞外フラックスアッセイベース ミディアム</td></tr><tr><td>タツノオトシゴXFe96</td>アナライザー <td>アジレント</td><td></td> 細胞<td>外フラックスアナライザー</td></tr><tr><td>タツノオトシゴXFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>XF96細胞培養プレート20枚、XFe96センサーカートリッジ18個、化合物をアッセイカートリッジに移すためのローディングガイド、キャリブラント溶液1本(500ml)が含まれています。</td></tr><tr><td>重曹</td><td>ミリポアSigma</td><td>S5761</td><td>Cell-Tak溶液の調製</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-070</td><td>ミトコンドリア負荷試験媒体の成分</td></tr></tbody></table>

ヒトナチュラルキラー細胞代謝の解析

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

ナチュラルキラー(NK)細胞は、主に自然な抗腫瘍および抗ウイルス免疫応答を媒介し、生存、細胞増殖、インターフェロンガンマ(IFNγ)および/または細胞毒性プログラムなどのサイトカインの産生を促進するために、様々なサイトカインおよび他の刺激に応答する。サイトカイン刺激によるNK細胞活性化は、その生体エネルギーおよび生合成の要件をサポートするために代謝経路の実質的なリモデリングを必要とする。NK細胞代謝障害は、肥満やがんを含む多くの慢性疾患に関連していることを示唆する大きな証拠があり、NK細胞代謝を決定する方法の利用可能性の臨床的重要性を強調している。ここでは、ヒトNK細胞のエネルギー代謝の変化を監視するツールとして、糖分解とミトコンドリア酸素消費量のリアルタイム測定を可能にする細胞外フラックス分析装置の使用について説明します。ここで説明する方法は、現在、広範囲の臨床試験で調査されているシステムであるIL-15などのサイトカインを用いたNK細胞の刺激後の代謝変化のモニタリングも可能にする。

末梢血からのNK細胞の分離は純粋で実行可能な集団を提供する
細胞外フラックスアッセイは、ウェル内のH+ およびO2 濃度の測定に基づいており、細胞の異なる集団またはその生存率を区別しません。このため、目的の細胞の非常に純粋で実行可能な集団を得ることが、これらの実験で成功するための重要なステップでした。
末梢血からのNK細胞の単離は、セクション2に記載されるように行った。得られたNK細胞の純度と生存率を評価するために、PMBCおよび単離されたNK細胞集団からの小さなアリコートを、フローサイトメトリーによって染色および分析した(図2A)。単核細胞は、前方(FSC-A)対側散乱領域(SSC-A)を示すプロットにゲート付けされた。この母集団内では、単一セルが、FSC-Aと前方散乱高さ(FSC-H)を示すプロットの対角線に沿ってゲートされた。シングル集団内では、生存率を評価し、PMBCおよびNK細胞集...

本論文では、末梢血から分離されたヒトナチュラルキラー(NK)細胞の解糖とミトコンドリア呼吸を、静止状態またはIL15誘発活性化後に測定する方法について述べた。記載されたプロトコルは、他のサイトカインまたは可溶性刺激によって活性化された初代ヒトNK細胞に容易に拡張することができる。

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

この方法は、ナチュラルキラー細胞代謝の決定を可能にする。細胞外媒体における酸素消費量およびpH変化を測定することにより活性化における重要なパラメータである。細胞外フラックス分析装置の利点は、完全に自動化されており、細胞量が少ないリアルタイムで最大92サンプルをテストできることです。したがって、高スループット画面を可能にします。インキー細胞の解糖と呼吸を決定する有効な方法は、クリニックで非常に重要です。乳がんやがんなど、細胞の代謝が損なわれる疾患が多いからだ。50ミリリットルの円錐管に20ミリリットルのリンパ球分離培地をピペット化することから始めます。チューブを30度の角度に保ちながら、培地上に20ミリリットルの血液を穏やかにピペットします。2 つの流体間に、表示可能で明確に定義されたインタフェースを作成する。チューブを1000回G.で25分間遠心し、遠心分離機から慎重にチューブを取り出し、ラックに入れます。LSMと血漿の間の界面で細胞の顕著な層の存在を確認してください。10ミリリットルのプラスチックピペットで単核細胞層を軽く吸引し、新しい50ミリリットルの円錐形チューブに入れます。単核細胞を45ミリリットルのPBSで2回洗う。そして、5分間Gの800倍でそれらを遠心分離します。ナチュラルキラー細胞またはエンギブを単離するには、PVM海を数え、1ミリリットル当たり8番目の細胞の1倍10〜8番目の細胞でNK分離バッファーに再中断します。その後、10ミリリットルの細胞懸濁液を新しい50ミリリットルチューブに移します。NK細胞分離抗体ミックスの500マイクロリットルを加えます。そして10マイクロリットルの抗CD3陽性単離抗体は、PBMCに混合する。室温で10分間インキュベートします。ボルテックス磁気ビーズを PBMCs および抗体に 1 ミリリットル添加します。その後、時折攪拌しながら室温で10分間MIGSをインキュベートします。35ミリリットルのNK分離バッファーを加え、チューブをマグネットの上に15分間置きます。慎重に側面またはチューブの底部に触れることなく、50ミリリットルのプラスチックピペットで上清を収集します。細胞を数え、5分間Gの800倍に遠心分離します。可溶性通路15でNK細胞を刺激するために、96ウェルプレートのウェルに10%HSを含むIMDMの100マイクロリットル中の750,000細胞を再懸濁させる。IMDMでは1ミリリットル当たり1マイクログラム、10%HSのヒト通路を希釈する。そして、希釈されたヒト通路15の100マイクロリットルを細胞に加える。刺激されていない細胞でコントロールサンプルを修復し、両方のサンプルを摂氏37度のインキュベーターに入れます。細胞を48時間刺激し、細胞外フラックスアッセイを行います。実験の前日に、アナライザーをオンにして摂氏37度まで温めます。検閲カートリッジパッケージを開き、カートリッジをユーティリティプレートから分離します。次に、200マイクロリットルのキャリブラント溶液をユーティリティプレートの各ウェルに加えます。そして、センサーが完全に水没していることを確認するために中央のカートリッジを戻します。最適な結果を得るために、カートリッジを一晩摂氏37度で炭酸ガスフリーインキュベーターにインキュベートします。これは適切に加湿しました。接着被覆されたブレードを調製するために、各プレートのウェルに25マイクロリットルの細胞接着溶液をピペット状に塗布する。室温で20分間インキュベートした。その後、溶液を取り除き、ウェルあたり200マイクロリットルの無菌水でプレートを2回洗います。ウェルを乾燥させるために、細胞培養フード内でプレートを15分間開いたままにします。遠心分離機は、以前に単離されたNK細胞をGを5分間200回加える。その後、上清を除去し、温めたミトコンドリアストレス試験培地または解糖ストレス試験培地で細胞を洗浄します。ペレット細胞を再度、同じ培地中の好ましい細胞濃度に再懸濁した。アッセイプレートに十分に当たって180マイクロリットルの細胞懸濁液を置きます。背景補正用のウェルA、A12H 1、H 12をコントロールウェルとして使用してください。これらのウェルズにアッセイ媒体の180マイクロリットルを加えて、炭酸ガスフリーインキュベーターで37°Cで30分間プレートをインキュベートします。プレートをGの200倍に5分間遠心する。次に顕微鏡下の細胞を観察し、ウェルの底にマノ層を形成することを確認します。さらに25分間細胞をインキュベートする。摂氏37度に暖かい作業ソリューション。そして、必要に応じてpHを7.4に変更します。ミトコンドリアストレステストまたは解糖ストレステストのために以前に調製した化合物を、水和検閲カートリッジのボードA、B、Cにロードされた検閲カートリッジをプログラムのセットアップ中にインキュベーターに戻します。細胞外フラックスアッセイプロトコルを設定するには、ソフトウェアを開き、グループ定義を使用して前処理条件を定義します。[プレート マップ] タブを使用して、類似した条件を持つウェルのグループを示す背景の補正と空の井戸も示します。次に、プロトコルタブでプログラムを設定します。プログラムを起動し、センサーカートリッジとユーティリティプレートをトレイに置きます。キャリブレーションステップの後、アッセイプレートのキャリブラントプレートを、取り付けられたセルに交換します。実行が完了したら、データを取得して分析します。NK細胞の純度および生存率を評価するために。PVM海および単離されたNK細胞集団からの小さなアレック・ワットを、フローサイトメトリーによって染色し、分析した。NK細胞集団の純度はCD3とCD56またはNKP46に対して二重に滞在することによって確立された。ヒトNK細胞のミトコンドリア酸素消費量の多くをここに示す。予想通り、私のセル番号は、より高いOCR値を表示しました。細胞数はまた、ウェル内のDNAまたはタンパク質の量と線形に相関した。一方、セル数が多いほど最適ではなかった。DNPを添加すると、各サイクルでウェル中の酸素濃度が完全に枯渇したためです。これはOCRの正確な計算を妨げました。ヒトNK細胞において、100マイクロモルDNPが最適用量であることが判明した。ウェル当たり750,000個のNK細胞を用いた典型的なミトコンドリアストレス試験実験を示す。このテストでオリゴマイシンは酸素消費量の劇的な減少につながります.そして、ECARの増加。これは、解糖への切り替えと細胞のATPレベルを維持するための努力を表しています。通路15によるNK細胞の活性化は、ミトコンドリア酸素消費量および細胞外酸性化の両方の増加を引き起こした。基底の最大およびATPの結合呼吸は増加したが、陽子漏れまたは非ミトコンドリア呼吸ではない。さらに、OCR/ECA率はIL15刺激後の解糖代謝へのシフトを示す減少した。このプロトコルを実行する際には、純粋で健康な細胞集団を得て、最適な細胞数を決定し、非ケーブルの濃度を計定することが非常に重要です。

analysis-of-human-natural-killer-cell-metabolism

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

この動画では、細胞外フラックスアナライザーを使用して、活性化したヒトNK細胞のエネルギー代謝を解析する方法を実演しています。電子伝達鎖複合体のさまざまな阻害剤は、酸素消費率またはOCRを通じて測定されるATP合成に影響を与え、細胞代謝と生体エネルギー学に関する洞察を提供します。...

細胞外フラックスアナライザーを用いたヒトNK細胞のエネルギー代謝のリアルタイムモニタリング

このビデオは、蛍光染色された標的細胞に対するナチュラルキラー細胞の溶解活性を示しています。この手法では、死細胞を染色し、フローサイトメーターを使用して生細胞と死細胞の標的細胞を定量することにより、NK細胞による細胞毒性の測定が可能になります。...

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Flow Cytometric Analysis 用サンプル調製

簡単かつ信頼性のある方法は、異なるNK細胞サブセット内の脱顆粒、サイトカインおよびケモカインの産生などNK細胞機能のセットを分析するために、ここで説明されています。...

NK細胞の機能を監視するためのサイトメトリーに基づくアッセイを流します

この研究は、ヒトの血液サンプル中のNK(Natural...

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

流れ cytometry ベースの人間のナチュラル...

ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金

がん細胞によるナチュラルキラー(NK)細胞介在の根絶の回避は、がんの開始と進行に重要です。ここでは、肝腫瘍細胞に対するNK細胞媒介性細胞毒性を評価するための非放射活性ベースの2つのプロトコルを紹介する。さらに、NK細胞の移動を分析するための第3のプロトコルが提示されます。...

肝腫瘍細胞の文脈における自然キラー細胞媒介性細胞毒性と遊性の測定

ヒトナチュラルキラー細胞における治療抗体によるFcγRIIIA駆動事象を研究するためのプロトコルをここに説明する。この人工刺激プラットフォームは、脱顆粒、ケモカイン/サイトカイン産生、および結合に関与する抗体のFcγRIIIaおよびFc部分によって媒介されるシグナル伝達経路などの下流エフェクター機能の尋問を可能にする。...

治療抗体の存在下におけるFcγRIIIa関与によるヒトナチュラルキラー細胞事象の評価

本プロトコルは、3Dおよび2D培養条件の両方で、軽度の細胞毒性を有するCD3−/CD45+CD56+細胞をヒト拡大電位幹細胞(hEPSC)から分化させる方法を示しています。これにより、複雑な微小環境を破壊することなく、日常的な表現型検証が可能になります。...

ヒト増殖電位幹細胞からのナチュラルキラー細胞の作製

このプロトコルは、レンズフリーシャドウイメージング技術を使用して、ナチュラルキラー(NK)細胞数および活性の迅速な単一細胞分析のためのラベルフリー法を記述しています。この方法は、回折パターンをコンピュータで分析することにより、個々のNK細胞の形態学的変化を定量化します。...

ナチュラルキラー細胞活性化の迅速なラベルフリー分析のためのフィールド展開可能なレンズフリーイメージングプラットフォーム

このプロトコルは、生細胞イメージングとフローサイトメトリーを用いて、ヒトの自然なキメラ抗原受容体介在および抗体依存性細胞毒性を一貫して測定するための標準化された in vitro.

キメラ抗原受容体および治療用抗体によって増強されるNK細胞毒性の定量化:生細胞イメージングおよびフローサイトメトリー

学ぶヒトナチュラルキラー細胞の糖解解とミトコンドリア呼吸の測定法。細胞外フラックスアナライザーを用いて酸素消費とpH変化をリアルタイムで測定し、最大92サンプルの高スループットスクリーニングが可能です。

ヒトナチュラルキラー細胞代謝の解析

さらに動画を探す