マウスにおける乾燥粉末製剤の気管内投与
2020年7月25日
吸入用の乾燥粉末製剤は、呼吸器疾患の治療に大きな可能性を秘めています。ヒト研究に入る前に、前臨床試験における乾燥粉末製剤の有効性を評価する必要がある。気管内経路を介したマウスにおける乾燥粉末の投与の簡便かつ非侵襲的な方法が提示される。
乾燥粉末の気管内投与は、前臨床動物モデルにおける肺吸収、バイオアベイラビリティ、治療効果など、吸入粉末製剤の性能と生物学的活性を評価するために不可欠です。挿管プロセスは非侵襲的であり、粉末製剤をマウスに安全かつ正確に送達できます。カスタムメイドの乾燥粉末吸入器は、使い捨てで安価で、粉末製剤の散布に効率的です。
この吸入器は、同じ実験で複数のマウスで異なる製剤を評価する際に使用でき、残留粉末による相互汚染のリスクはありません。挿管プロセスは、経験の浅い研究者にとっては困難です。カニューレの最も細い先端を気管の開口部に視覚化して狙いを定める能力は、ガイドカニューレを正しく挿入するために重要です。
この手法には、不適切な挿入を最小限に抑えるための練習が必要です。ポスドクのキャロルと博士課程の学生レイチェルが、準備と挿管の手順を実演します。まず、乾燥粉末と200マイクロリットルのノンフィルターラウンドゲルローディングピペットチップの静電荷を、帯電防止ガンまたは脱イオン機能付き天びんを使用して中和します。
約4 x 4センチメートルのサイズの計量用紙を準備します。紙を斜めに半分に折り、広げます。次に、それを使用して1〜2ミリグラムの乾燥粉末を量ります。
ゲルローディングピペットチップの幅の広い開口部から粉末を充填し、チップの狭い端近くに緩い凝集が形成されるまで、軽くたたいて粉末を詰めます。粉体をきつく詰めすぎると、分散が妨げられる可能性があるため、避けてください。粉末を充填した先端を1ミリリットルのシリンジに、接続時に先端とシリンジを垂直に保持する三方活栓を介して接続し、粉末のこぼれを防ぎます。
シリンジのサイズは、粉末を分散させるために使用される空気の量に応じて変更できます。投与がすぐに行わない場合は、パラフィルムを使用して先端の開口部を密閉し、投与まで適切な条件下で一時的に保管してください。7〜9週齢のBALB / cマウスにケタミンとキシラジンで麻酔をかけた後、スタンドに取り付けられたプレキシガラスプラットフォームに置きます。
マウスの切歯をナイロン製のフロスに引っ掛けてマウスを吊り下げ、テープまたは輪ゴムでその位置を固定します。プラットフォームの高さと角度を調整します。光ファイバーをガイディングカニューレに挿入し、ファイバーの先端をカニューレの開口部と同じ高さにします。
次に、LEDトーチをオンにして点灯させます。マウスの舌を一対の鉗子でそっと突き出して、気管を露出させます。もう一方の手でガイドカニューレを光ファイバーで保持し、口腔に挿入します。
光ファイバーからの照明により、気管の開口部を声帯の間の開口部として視覚化できます。ガイドカニューレの斜角を開口部の正中線に合わせ、カニューレの最も細い先端を気管開口部に向けることにより、光ファイバーで気管にそっと挿管します。挿管後、速やかに光ファイバーを取り外し、ガイドカニューレを気管内に残します。
正常な修復が観察されるべきです。細い先端ピペットをガイドカニューレの開口部に保持し、マウスの肺に小さな空気を吹き込みます。胸部のわずかな膨張は、適切な挿管を示しています。
粉末投与の前に細いチップピペットを取り外してください。シリンジに接続されている電源投入されたチップを持ち、シリンジとチップの間の空気の流れが切断されていることを確認します。シリンジプランジャーを後方に引いて、0.6ミリリットルの空気を引き出します。
三方活栓のバルブを回して、シリンジとパワーロードチップの間の空気の流れを接続します。次に、パワーロードされたチップを、マウスの気管にすでに配置されているガイドカニューレに挿入します。ガイドカニューレを保持し、シリンジプランジャーを1回の連続動作で力強く押すと、粉末がエアロゾルとして肺に分散し、動物への損傷を避けるために前進運動が最小限に抑えられます。
こて先を取り外し、粉が空になっているか確認してください。投与が完了したら、ガイドカニューレを気管から取り外します。気道の閉塞を避けるために、マウスを仰臥位に水平に配置し、舌の半分を突き出してマウスを回復させます。
この分析法を最適化するために、噴霧乾燥マンニトール 1 ミリグラムを分散させるために異なる量の空気を使用し、マウスの体重をモニターしました。0.3ミリリットルおよび0.6ミリリットルの空気の使用は、投与後48時間までマウスの体重減少を引き起こさなかった。粉末を1ミリリットルの空気に分散させると、24時間以内に5%以上の重量減少が見られましたが、48時間後には完全には回復しませんでした。
マウスに5マイクログラムのmRNAを含む1ミリグラムのSFD粉末を気管内投与し、投与後24時間で肺でのルシフェラーゼ発現をin vivoイメージングシステムを使用して評価しました。SFD粉末は肺深部に分散し、ルシフェラーゼの発現が観察されました。比較として、粉末を水に再構成し、同じ挿管手順を使用してマイクロ噴霧器で投与しました。
再構成された製剤のルシフェラーゼ発現は、粉末幻滅の問題または粉末と液体形態との間の異なる薬物動態プロファイルによるものであった可能性がある乾燥粉末製剤よりも有意に高かった。mRNA乾燥粉末エアロゾルで処理された肺の組織学的特性を、未処理の対照群およびLPS処理群と比較した。治療を受けていない肺は健康な症状を示しましたが、LPSで治療された肺は、空域の不規則な分布と間質性および肺胞腔への炎症性細胞の浸潤を示しました。
SFD粉末で処理された肺は炎症の徴候を示さなかった。粉末の分散を成功させるには、ローディングチップ内の粉末を軽くたたいて、チップに密着しすぎないようにする必要があります。この挿管設定は、ピペットまたはマイクロ噴霧器のいずれかで液体製剤を投与するように適応させることもできます。
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概要
この記事では、マウスの気管内への乾燥粉末製剤の非侵襲的投与方法を提示しています。これは呼吸器疾患の治療効果を評価する上で重要です。この技術により、前臨床研究のための粉末の安全かつ正確な投与が可能になります。
主要な研究要素
科学の分野
- 呼吸器疾患の治療
- 医薬品製剤
- 前臨床研究方法論
背景
- 乾燥粉末製剤は呼吸器疾患治療の可能性を秘めています。
- ヒト試験の前に前臨床研究が必要です。
- 気管内投与はこれらの製剤をテストするための主要な方法です。
- 経験の浅い研究者が挿管を行う際には課題があります。
研究の目的
- マウスへの乾燥粉末製剤の投与方法を示す。
- 吸入粉末の生物学的活性と治療効果を評価する。
- より良い結果を得るために投与技術を最適化する。
使用した方法
- 乾燥粉末の調製とピペットチップへのロード。
- 誘導カニューレと視覚化用の光ファイバーを用いたマウスの挿管。
- 誘導カニューレに接続された注射器による粉末の投与。
- 投与後のマウスの体重変化のモニタリング。
主な結果
- 粉末分散に使用した空気量がマウスの体重に影響を与えました。
- mRNA乾燥粉末の投与後のルシフェラーゼ発現を評価しました。
- 再構成された製剤との比較により、発現レベルに違いが見られました。
- 組織学的分析により、処置を受けたマウスの肺は健康的な特徴を示しました。
結論
- 気管内投与法は乾燥粉末製剤を評価するのに効果的です。
- 副作用を最小限に抑えるには空気量の最適化が重要です。
- 乾燥粉末の薬物動態を理解するためにはさらなる研究が必要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Intratracheal delivery of dry powder formulations enables preclinical evaluation of pulmonary absorption, bioavailability, and therapeutic effects in mice. This method supports target validation and mechanistic de-risking for inhaled therapeutics by providing reproducible lung deposition. It addresses a critical gap in early discovery for respiratory disease programs requiring dose accuracy and formulation screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by delivering dry powder to deep lung regions for target engagement studies.
- Operational Value: Uses disposable pipette tips to prevent cross-contamination when screening multiple formulations in the same experiment.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking powder dispersion quality to biological readouts like luciferase expression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative outputs such as luciferase expression and weight change metrics to assess formulation performance.
- Operational Value: Standardizes powder dispersion via controlled air volume (0.3–0.6 mL) to ensure reproducible dosing across studies.
- Scalability: Allows rapid formulation switching using pre-loaded tips, increasing throughput in lead identification workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase formulation screening to preclinical validation through consistent intubation and delivery mechanics.
- Mechanistic De-risking: Enables histological and functional lung assessments to differentiate inflammatory from healthy tissue responses post-exposure.
- Predictive Confidence: Facilitates go/no-go decisions by correlating powder dispersion efficiency with mRNA expression and lung integrity.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from early target validation to lead identification, particularly for inhaled biologics and small molecules requiring lung-specific delivery.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling precise delivery of dry powder to alveolar regions for pathway clarification.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized powder loading and dispersion, reducing variability in compound evaluation.
- Analytics: Generates measurable endpoints including bioluminescence, weight change, and histology to compare formulation performance.
- Translational Research: Maintains continuity from discovery to preclinical work by preserving anatomical and physiological delivery consistency.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular capability across projects due to low-cost, disposable components and minimal setup requirements.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing variability in lung deposition.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through disposable tips and controlled air pulse delivery.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling high-throughput formulation screening without device revalidation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking formulation physicochemical properties to in vivo outcomes.
Implementation Considerations
- Requires training in mouse intubation and tracheal visualization using optical fiber guidance.
- Depends on access to anti-static equipment, three-way stopcocks, and gel loading pipette tips for powder handling.
- Necessitates standardization of air volume (0.3–0.6 mL) to avoid adverse effects like weight loss during dispersion.
- Must be adapted across model systems with attention to cannula size and intubation depth for consistent deep lung delivery.
- Limited by operator skill in achieving proper intubation, which directly affects powder deposition accuracy and data reliability.
