洗浄剤と酵素を含まない方法を用いた組織全体からの核分離
2020年6月24日
単核単離は、細胞膜の解離および洗剤ベースの透過性、最適化を必要とし、技術的なアーティファクトを導入する傾向があるステップに依存しています。我々は、単核RNA-seq(snRNA-Seq)またはATAC-seqに適した核を得て、組織全体から直接無傷核を迅速に単離するための洗浄剤および酵素フリープロトコルを実証する。
単一細胞または単一核懸濁液を調製することは、高スループットのトランスクリプトームおよびエピゲノムプロファイリングのための重要なステップです。当社のプロトコルは、単一核の単一の分離のための簡単で、再現性、そして普遍的な方法を提供する。核単離に洗剤を必要とする他の方法とは対照的に、私たちのプロトコルは、洗浄剤と酵素フリーであるカラムベースです。
それは30分未満で核の単離を可能にする。私たちのプロトコルは核の分離を簡素化します。これは、解離しにくい組織からの単一の核懸濁液を調製するための堅牢な方法を提供します。
まず、少なくとも30分間氷の上に置くことによって、洗剤を含まない核分離キットからプレチルバッファAとB。5%BSA溶液を用いたチューブとピペットの先端をコーティングし、核の回収を強化します。ピペットの先端をコーティングするには、ピペット5%BSA溶液を2〜3回、空気乾燥2時間乾燥する。
チューブをコーティングするには、BSAでそれらを埋め、それらを3回反転させます。溶液を取り除き、きれいなティッシュペーパーの上でチューブを逆さまに乾かします。1つのサンプルに1つのコレクションチューブと1.5ミリリットルのチューブをコーティングします。
鉗子を使用して頭蓋骨を優しく壊し、頭蓋骨の腹側と後側から柔らかい組織、皮膚、骨を取り除きます。その後、氷冷PBSを含む30ミリメートルの皿に脳をそっと移し、カミソリの刃を使用して脳を小片にミンチします。単一の核を分離するには、核分離キットに用意されているフィルターカートリッジに細かく組織を移し、余分な溶液を取り除き、200マイクロリットルのコールドバッファーAを加え、プラスチック棒で組織を2分間粉砕します。
300マイクロリットルのコールドバッファーAをフィルターカートリッジに加え、キャップを10分間開けた状態で氷の上でインキュベートします。その後、カートリッジをキャップし、チューブを5回反転させることによって組織を再中断します。サンプルチューブを16,000回gで30秒間遠心分離し、細胞を破裂させる。
フロースルーには無傷の核が含まれており、チューブの底に無色ペレットを形成します。フィルターを捨ててから、10秒間激しくボルテックスしてペレットを再中断します。500回gで溶液を3分間遠心して再び核をペレット状にした。
その後、上清を慎重に捨てます。ペレットを0.8ミリリットルのコールドバッファーBに再懸濁させ、2~3回ピペットし、600倍gの核を遠心分離して10分間、膜の破片から分離します。上清を慎重に捨てなさい。
5%BSAでPBSの500マイクロリットルで単離された核を再懸濁し、FACSまで氷の上に懸濁液を保ちます。HEX染色で核形態を確認するには、BSAコーティングされた先端を使用して、単核懸濁液の100マイクロリットルを新しいチューブに移します。0.1マイクロリットルのHEXを加え、チューブを穏やかに渦液にすることによって核を染色する。
405ナノメートルのレーザー励起設定を用いた蛍光顕微鏡を使用して、核懸濁液をガラス底皿に移し、核の画像を画像化します。FACS を実行する前に、40 マイクロメートルの細胞ストレーナーを用いて、BSA コーティングチューブに核をフィルターします。5%BSAのPBSを加えて、1,000マイクロリットルの最終容量にフィルターした懸濁液を希釈します。
コントロールとして2つの丸底FACSチューブをラベル付けし、染色し、BSAコーティングされたピペットチップを使用してコントロールチューブに核懸濁液の250マイクロリットルを移します。残りの750マイクロリットルの溶液を染色とラベル付けされたFACSチューブに移し、1マイクロリットルのHEX染料を加えて核を染色する。その後、ゆっくりと渦を混ぜます。
未染色のコントロール サンプルをセルソーターに読み込み、5,000 個のイベントを記録します。次に、染色されたサンプルをロードし、5,000のイベントを記録します。単一の核の識別のためのFACSゲートを描く。
核は、コントロールと染色されたサンプルの間でHEX蛍光シグナルを比較することによって選択することができる。その後、5%BSAで50マイクロリットルのPBSを含む新しい1.5ミリリットルチューブに染色チューブからHEX陽性核を選別します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの脳組織から直接単一核懸濁液を生成するために使用された。
単離された核をHEXで染色し、蛍光顕微鏡で可視化した。彼らは無傷で、丸く、よく離れているように見えました。重要なことに、核凝集は欠かれていた。
単離された核の濃縮は、HEX蛍光シグナルの存在下で格子を行うことによってフローサイトメトリーで行った。染色されていない核は、強い蛍光シグナルを示しながら、背景蛍光を示した。染色されていない核は、紫色チャネルで十分に分離した。
このプロトコルを試みる間、単一の核はプラスチック材料に固執する傾向があることを覚えておくことが重要です。核の潜在的な損失を防ぎ、効率を高めるために、プラスチック材料の基本的なコーティングが強く推奨されます。単一核懸濁液は、単一核RNAにさらに利用することができ、この技術は、複雑な生物学的システムにおける細胞の不均一性を解明し、細胞サブタイプおよび遺伝子ネットワークを定義するのに役立つ。
洗浄剤と酵素を使用する方法を使用して、サンプル調製中に導入された技術的なノイズとバイアスを登録します。この方法は、単純化された、ロジスティックな単一核の分離を開発した。
概要
本研究では、ハイスループットなエピゲノムおよびトランスクリプトーム解析において不可欠なステップである単一核の単離について解説します。界面活性剤や酵素を使用しない簡便なプロトコルを用いることで、取り扱いが困難な組織（ここではゼブラフィッシュの脳組織を用いて実証）から、無傷の核を迅速に単離することが可能です。
研究の主要構成要素
研究分野
- 細胞生物学
- エピゲノミクス
- シングルセル解析
背景
- 単一核の単離は、さまざまな生物学的研究における正確なプロファイリングに不可欠です。
- 従来の方法では、界面活性剤によってアーティファクトが導入されることがよくあります。
- ダウンストリームアプリケーションを改善するために、より効率的で再現性の高い単離技術が必要です。
使用された手法
- 界面活性剤および酵素を使用しない、カラムベースの単離プロトコルを開発した。
- 手法の検証のための生物学的システムとして、ゼブラフィッシュの脳組織を用いた。
- フローサイトメトリーにより、HEX染色に基づいた単離核の濃縮を行った。
主な結果
- 本プロトコルにより、完全で十分に分離した核を単離することに成功した。
- 染色により核の完全性が確認され、凝集は見られなかった。
- この手法により、FACSを用いた効率的な核のソーティングが可能となった。
結論
- 本研究では、テクニカルノイズを最小限に抑えた、簡略化された単一核分離アプローチを提示します。
- この手法により、複雑な組織における細胞の不均一性の理解が深まります。
よくある質問
産業界における重要性
ハイスループットプロファイリングでは、解離および透過処理ステップによるテクニカルノイズを避けるため、完全な状態の核が必要です。この界面活性剤および酵素を使用しないカラムベースの手法を用いることで、ゼブラフィッシュの脳のような解離が困難な組織から、30分以内に迅速かつ再現性高く核を単離することが可能です。このアプローチは、核の形態を維持し凝集を抑制することで、信頼性の高いシングルニュークリアRNA-seqおよびATAC-seqを可能にし、創薬パイプラインにおけるターゲットバリデーションやメカニズムのリスク低減に向けたデータ品質を直接的に向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： エピゲノムおよびトランスクリプトーム解析用の完全な核を提供することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値： 界面活性剤を用いた溶解によって生じるばらつきを抑え、実験間の再現性を向上させる。
- 予測的価値： 複雑な組織から高忠実度に核を単離することで、生物学的なリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 下流のFACS濃縮およびシングルセルマルチオミクス解析に適した核懸濁液を調製できる。
- 運用的価値： 酵素的な解離の必要性をなくし、ワークフローを簡素化して手作業の時間を短縮できる。
- 拡張性： コラム形式により、アッセイに向けて複数のサンプルを並行して処理することが可能である。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 翻訳の連続性： 分離核は分子の完全性を維持するため、発見された表現型からメカニズム経路までの関連付けを可能にします。
- バイオマーカーの整合性： 疾患関連システムにおける翻訳バイオマーカーの同定に寄与するエピゲノムプロファイリングをサポートします。
- リスク調整済みの進展： 調整過程でのアーティファクトによる偽陽性を減らし、前臨床ターゲット選択の信頼性を向上させます。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、オミクスプロファイリング用の高品質な核抽出物を提供することにより、標的仮説の検証からリード化合物の同定、そして前臨床検証に至るまでのディスカバリー・コンティニュアムに適合します。
- 発見生物学： 無偏向的な核プロファイリングを無傷の組織から行うことで、パスウェイの解明およびターゲットの検証を促進します。
- スクリーニング： FACSベースの濃縮やプレート対応のオミクスワークフローに適合する、標準化された核懸濁液を調製します。
- 分析： フローサイトメトリーとHEXベースのゲーティングにより、核の回収量と純度の定量的な評価を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 細胞状態を示すエピゲノムシグネチャーを保持することで、前臨床モデルへの連続性をサポートします。
- 企業での再利用： カラムベースでキット互換性のあるプロトコルにより、一貫したサンプル調製に向けたラボ間およびプロジェクト間での標準化が可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値：エピゲノムおよびトランスクリプトームデータにおける前処理由来のノイズを最小限に抑えることで、予測の信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：標準化された酵素を用いない単離法により、再現性とスループットを向上させます。
- 戦略的価値：サンプルアーティファクトによる偽信号を低減し、Go/No-go判断の信頼性を高めます。
- ポートフォリオへの影響：よりクリーンで解釈可能なオミクスプロファイルを通じて、リスク調整済みのターゲット優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 組織の取り扱いおよび核染色のプロトコルに関する専門知識が必要です。
- 遠心分離機、ボルテックスミキサー、蛍光顕微鏡、およびFACSソーターへのアクセスが必要です。
- プラスチック表面への核の付着を防ぐため、チューブとチップにBSAコーティングを行う必要があります。
- ゼブラフィッシュの脳以外の組織タイプ、特に線維性組織や脂肪組織では、最適化が必要になる場合があります。
- 核を用いたアプリケーションに限定されており、細胞質の内容物を必要とする完全な単一細胞の単離には適していません。
