Name: 洗浄剤と酵素を含まない方法を用いた組織全体からの核分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学ぶ洗浄剤と酵素を含まないカラムベースの核分離法。ゼブラフィッシュ脳組織から30分以内に単一核を迅速に分離し、FACSで精製できます。複雑組織の細胞異質性解析に有用なロバストな手法です。

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サビーン・コスタグリオラ博士とシン研究所のメンバーに、原稿に関するコメントに感謝します。この作品は、グラント番号34772792 -MISUからS.P.S.に、フォン・デ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィック-FNRSによって支えられた。

以下に示す手順はすべて、機関(Libre de Bruxelles大学(ULB))および国家の倫理的および動物福祉ガイドラインおよび規制に従って行われ、ブリュッセル大学(プロトコル578N-579N)から動物福祉倫理委員会(CEBEA)によって承認されました。
1. 組織解剖前の準備
<ol><li>ゼブラフィッシュを安楽死させるPBSで0.2%トリケーヌ溶液を調製する。氷の上で溶液を冷やします。</li>
	<li>ティッシュを刻む30mmのペトリ皿を準備する。</li>
	<li>氷冷1x PBS(組織サンプルあたり10 mL)を準備します。</li>
	<li>遠心分離機を4°Cに冷却します。</li>
	<li>核分離の場合は、洗剤を含まない核分離キット(資料表)を使用してください。</li>
	<li>プロトコルを開始する前に、キットに提供されるプレチルバッファAおよびBは、核単離前に少なくとも30分間氷の上に置くことによって提供される。</li>
	<li>単離された核を処理するために、チューブやピペットチップなどのプラスチック試薬を5%BSA溶液でコーティングします。このために、40 mLのPBSに2gのBSAを溶解して溶液を調製する。5%BSAでプラスチックアイテムをコーティングすると、プラスチックに付着する核を減少させます。このステップは、単離された核の回復を強化する。</li>
	<li>5%BSA溶液を2〜3回ピペットしてピペットチップをコーティングします。チップを2時間エアドライします。サンプルごとに10個のプラスチックチップを用意します。</li>
	<li>5%BSAでそれらを充填することにより、核の収集のためのチューブをコーティングします。チューブを3回反転して、効率的なコーティングを確保します。溶液を取り除き、きれいなティッシュペーパーの上でチューブを逆さまに2時間空気乾燥させます。サンプルごとに、キットに用意されている1つのコレクションチューブをコーティングします。さらに、FACS後の核採取用にコーティングされた1.5 mLチューブを用意します。 注:ガラスの先端は固着を最小限に抑えるためにプラスチックピペットの先端に代わるものを強く推奨します。</li>
</ol>2. ゼブラフィッシュ脳の解剖
<ol><li>ゼブラフィッシュを安楽死させるには、25 mLの氷冷トリケーヌ溶液で90mmのペトリ皿を準備します。</li>
	<li>慎重に、漁網を使用してタンクからゼブラフィッシュを取り出し、ペトリ皿に入れます。</li>
	<li>魚を5分間トリケーヌに残して安楽死させる。</li>
	<li>鋭いカミソリの刃で動物の首を切る。</li>
	<li>鉗子を使用して、頭蓋骨をそっと壊し、頭蓋骨の腹側と後側から柔らかい組織、皮膚および骨を取り除く。</li>
	<li>やさしく、氷冷PBSを含む新鮮な30ミリメートル皿に脳を移します。</li>
	<li>スピン列のサンプルの読み込みを容易にするためにカミソリの刃を使用して脳を小片にミンチします。</li>
</ol>3. 単核単離
<ol><li>核分離キットに用意されているフィルターカートリッジにひき肉組織を移し、200 μLのコールドバッファーAを加えて組織を感作します。キットが提供するプラスチックロッドを2分間使用して組織を研削します。</li>
	<li>300 μL のコールドバッファー A を加え、キャップを 10 分間開いた状態で氷の上にフィルターカートリッジをインキュベートします。</li>
	<li>カートリッジをキャップし、チューブを5回反転させて組織を再中断します。</li>
	<li>遠心分離機は16,000 x gで30s。この工程では、フィルターを通過すると細胞が破裂し、高速遠心力が加えられます。流れには無傷の核が含まれており、チューブの底にペレットが含まれています。</li>
	<li>フィルターを捨てて、10sの間激しく渦を流してペレットを再中断する。</li>
	<li>溶液を500xgで3分間遠心してペレットをペレットにgする。</li>
	<li>ペレットを0.8 mLのコールドバッファーBと遠心分離機で600 x gで10分間再懸濁します。この工程では、核は膜の破片から分離される。得られた無色ペレットは、単離された核を含む。</li>
	<li>5%BSAで500μLのPBSで単離された核を再懸濁する。核懸濁液を氷上に保管し、定量後にFACSを実行します。</li>
</ol>4. 核形態の可視化
<ol><li>Hoechst染色による核形態を確認する。このために、BSAコーティングされた先端を使用して新しいチューブに100 μLの単核懸濁液を取り除きます。核を染色するには、0.1 μLのHoechst (1 mg/mL)を加えます。チューブを穏やかに渦にかします。</li>
	<li>核懸濁液をガラス底皿に移してイメージングします。</li>
	<li>レーザー励起設定が~405 nm(バイオレット)波長の蛍光顕微鏡を使用して核を画像化します。</li>
</ol>5. 核のFACSベースの濃縮
<ol><li>FACSを実行する前に、40 μmの細胞ストレーナーを使用して核をBSAコーティングチューブにフィルターします。</li>
	<li>5%BSAのPBSを最終体積1,000 μLに加えて、濾過した懸濁液を希釈します。</li>
	<li>2つの丸い底FACSチューブに「コントロール」と「ステイン」のラベルを付けます。「対照」チューブには染色されていない核が含まれ、「染色された」チューブはHoechst染色された核を有する。</li>
	<li>BSAコーティングされたピペットチップを使用して、核懸濁液の250 μLを「コントロール」チューブに移します。</li>
	<li>残りの750 μL溶液を「染色」とラベル付けされたFACSチューブに移し、1 μLのHoechst色素を加えて核を染色します。スロー渦によって混ぜます。</li>
	<li>染色されていないコントロールサンプルをセルソーターにロードします。5000 のイベントを記録します。</li>
	<li>染色されたサンプルをロードし、5000 個のイベントを記録します。</li>
	<li>単一の核の識別を可能にするFACSゲートを描く。核は、コントロールと染色サンプルとの間でHoechst蛍光シグナルを比較することによって選択することができる。</li>
	<li>5%BSAで50 μLのPBSを含む新しい1.5 mLチューブに染色チューブからHoechst陽性核を選別します。 注: 分離された核は、下流アプリケーションの要件に応じて所望の媒体に収集することができます。</li>
</ol>

<ol><li>Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+digestion+strategies+on+characteristics+and+differentiation+potential+of+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells.</a> Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).</li>
<li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispase%2C+a+neutral+protease+from+Bacillus+polymyxa%2C+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).</li>
<li>Khan, M. R., Chandrashekran, A., Smith, R. K. W., Dudhia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotypic+characterization+of+ovine+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Immunophenotypic characterization of ovine mesenchymal stem cells.</a> Cytometry Part A. 89 (5), 443-450 (2016).</li>
<li>Cavanagh, T. J., Lakey, J. R. T., Wright, M. J., Fetterhoff, T., Wile, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crude+collagenase+loses+islet-isolating+efficacy+regardless+of+storage+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Crude collagenase loses islet-isolating efficacy regardless of storage conditions.</a> Transplantation Proceedings. 29 (4), 1942-1944 (1997).</li>
<li>Massoni-Badosa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+artifacts+in+single-cell+genomics+cohort+studies%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Sampling artifacts in single-cell genomics cohort studies.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Van Den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+solid+tumour+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarxiv%22%5BJournal%5D)">Dissociation of solid tumour tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Bioarxiv. 683227, (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> Plos One. 13 (12), 0209648(2018).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li>
<li>Rajbhandari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+reveals+immune+cell-adipocyte+crosstalk+regulating+the+transcription+of+thermogenic+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li>
<li>Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+single-nucleus+over+single-cell+RNA+sequencing+of+adult+kidney%3A+Rare+cell+types+and+novel+cell+states+revealed+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).</li>
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<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Div-Seq%3A+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li>
<li>Thrupp, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleus+sequencing+fails+to+detect+microglial+activation+in+human+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single nucleus sequencing fails to detect microglial activation in human tissue.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Selewa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Comparison+of+High-throughput+Single-Cell+and+Single-Nucleus+Transcriptomes+during+Cardiomyocyte+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic Comparison of High-throughput Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Differentiation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42(2008).</li>
<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
<li>Birnie, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Nuclei+from+Animal+Cells+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Nuclei from Animal Cells in Culture.</a> Methods in Cell Biology. 17, 13-26 (1978).</li>
<li>Dounce, A. L., Witter, R. F., Monty, K. J., Pate, S., Cottone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+isolating+intact+mitochondria+and+nuclei+from+the+same+homogenate%2C+and+the+influence+of+mitochondrial+destruction+on+the+properties+of+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A method for isolating intact mitochondria and nuclei from the same homogenate, and the influence of mitochondrial destruction on the properties of cell nuclei.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 1 (2), 139-153 (1955).</li>
<li>Hymer, W. C., Kuff, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Nuclei+From+Mammalian+Tissues+Through+the+Use+of+Triton+X-100%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of Nuclei From Mammalian Tissues Through the Use of Triton X-100.</a> The journal of Histochemistry and Cytochemistry. 12, 359-363 (1964).</li>
<li>Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergents%3A+Triton+X-100%2C+Tween-20%2C+and+More%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+and+Methods%22%5BJournal%5D)">Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More.</a> Materials and Methods. 3, (2013).</li>
<li>Sikorskaite, S., Rajamäki, M. L., Baniulis, D., Stanys, V., Valkonen, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+Optimised+methodology+for+isolation+of+nuclei+from+leaves+of+species+in+the+Solanaceae+and+Rosaceae+families%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: Optimised methodology for isolation of nuclei from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families.</a> Plant Methods. 9 (1), 31(2013).</li>
<li>Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGraham%2C+J+%22Subcellular+fractionation%3A+a+practical+approach%22">Subcellular fractionation: a practical approach</a>. , IRL Press. (1997).</li>
</ol>

著者には利益相反はない。記事のオープンアクセスを行うための支払いは、米国の発明バイオテクノロジー社によって行われました。

単一細胞分解能でトランスクリプトームとエピゲノムをプロファイリングすると、生物学的システムの研究に革命が起こった。固体組織に対する単一細胞の分解能の研究は、個々の細胞または核への器官の解離に依存する。解離は、技術的なアーティファクトを導入することができる破壊的な手順であり、システム55、66の正確な表現の開発を妨げる可能性があります。例えば、酵素解離は、ニューロンやポドサイトなどの複雑な形態を有する細胞に害を及ぼし、ストレスおよび熱ショック応答遺伝子77,1212の発現を誘発する可能性がある。さらに、解離中の洗剤の使用は、核膜を破裂させ、凝集23、25,25を導くことができる。したがって、最高品質の単一の細胞または核懸濁液を得るために解離を最適化することが、ハイスループットプロファイリング実験の成功にとって最も重要である。
ここでは、ゼブラフィッシュの脳から20分以内に無傷の核を抽出できる洗剤と酵素を含まない核分離法を実証する。プロトコルは、典型的な形態と堅牢な完全性を有する核を生成する(図2)。6mgの重さの単一のゼブラフィッシュ脳から、プロトコルは、ヘモサイトメーター数によって決定される合計60,000核を生成します。単離された核は、snRNA-seq、ATAC-seqおよび免疫染色を含む複数の下流の適用のために利用することができる。単離された核には、細胞質画分からの交差汚染、特に小胞体およびミトコンドリアの成分からの交差汚染が含まれ得る。ハイスループットプロファイリング実験では、細胞デブリ、特にミトコンドリアのクリアランスが強く推奨されます。フローサイトメトリー(図3)は、核の精製のための実行可能な選択肢を提供する。あるいは、スクロース勾配は、破片の除去のために利用することもできる。
このプロトコルは、マウス甲状腺(データは示されていない)でテストされており、ゼブラフィッシュの脳組織に似た結果を提供します。全体的に見て、このプロトコルは、単一核懸濁液の調製のための堅牢で再現性のある普遍的な方法を提供し、ハイスループットプロファイリング実験のための物流を簡素化するのに役立ちます。

単細胞RNA-セク(scRNA-Seq)およびATAC-seqは、単一細胞分解能で複雑な生物学的システムを研究するための汎用性の高いツールです。これらは、細胞のサブタイプおよび状態、遺伝子ネットワークを定義し、細胞の不均一性を評価するために広く利用されています。scRNA-seqを行うための前提条件は、組織解離による単一細胞懸濁液の調製である。細胞外マトリックス組成および機械的特性のばらつきにより、個々の組織は単一細胞懸濁液の調製のための解離プロトコルの最適化を必要とする。
組織を単一細胞に解離することは典型的に、コラゲターゼ、ディスパーゼまたはトリプシンを含む消化酵素を37°C1、2、3、4で処理することを含1,2,3,む。転写機械は37°Cで活性を保つため、酵素解離はmRNA発現アーチファクトとノイズ5,6,6を導入する可能性がある。特に、長時間のインキュベーションは、ストレス応答性遺伝子と熱ショック応答を不均一な方法で誘導し、実験7における技術的な変動をもたらす。
単一の細胞懸濁液を生成するもう一つの欠点は、複雑な形態を有する生存可能かつ無傷の細胞型を得るのが難しい点である。特に、ニューロン、アディポサイト、およびポドサイトは、8、9、10、119,10,11を分離するのに挑戦しています。8例えば、Wuたちは、成人マウス腎臓12からのscRNAプロファイルにおける糸球体ポドサイトの欠如を実証した。,脳組織88,13,14からの相互接続ニューロンの回復に関して同様の非最適な観測がなされている。,1314要するに、解離プロトコルは、細胞タイプの解離が容易に向けて検出バイアスを導入し、器官の細胞アーキテクチャの虚偽表示につながる可能性がある。
scRNA-Seq.でサンプル調製中に導入された技術的なノイズとバイアスを克服するために、核の単離およびプロファイリングは魅力的な代替手段を提供する。核形態は異なる細胞タイプ間で類似しているので、核の単離は、複雑な形態を有する無傷で生存可能な細胞を単離する問題を回避する。例えば、Wuたちは、scRNA-Seq12から欠けていた成体マウス腎臓の単核RNA-Seq.(snRNA-Seq.)を有する糸球体ポドサイトのプロファイリングに成功したことを実証した。興味深いことに、単一細胞と単核RNA-seqの比較研究は、snRNA-Seq12を用いたストレスおよび熱ショック応答遺伝子の誘導の減少を示唆している。この研究は、この2つの方法で検出された遺伝子間の高い相関関係をさらに示唆している。しかし、ヒトミクログリアに関する最近の研究では、アルツハイマー病15における遺伝的活性化を検出できなかった。したがって、特定の文脈において、snRNA-SeqはscRNA-Seq16、17,17に適した代替手段である。さらに、核分離は単一細胞ATAC-Seq.に利用することができ、個々の細胞内のオープンクロマチンの領域に関する情報を提供する。
核単離のためのプロトコルは、3つの主要なステップを伴う:i)核を放出する細胞膜の洗浄剤ベースのリシス;ii) Dounceホモジナイザーを使用した組織均質化;iii)凝縮またはフローサイト,メトリー,18、19、20、21、22を使用して細胞18,19デブリの核および除去の濃縮。21,2220この中で、最初の2つのステップは組織タイプに依存し、経験的に最適化する必要があります。中性洗剤は、細胞膜の部分的な破裂と組織23からの核の非効率的な検索をもたらす。一方、高レベルの洗剤と粗均質化は、核膜の破裂とその損失24、25,を招く。破裂した核はさらに凝集して凝集体を形成する傾向があり、除去しなければ下流プロファイリング実験でアーティファクトを引き起こす可能性があります。
核単離用の洗浄剤最適化に関する問題を回避するために、洗剤を含まないスピンカラムベースの方法を用いて、新鮮なサンプルから無傷の核を分離するプロトコルを導入します。このプロトコルは、20分以内に全器官から核を生成し、実際の転写の誘導を制限する。単核RNA-Seq.およびATAC-seqのためのFACSとの単一核の濃縮が可能であり、堅牢で再現可能なハイスループットプロファイリングを可能にする、シンプルで普遍的な方法を提供する。

<table><tbody><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>カール・ロス</td><td>90604-29-8</td><td>アルブミン画分V</td></tr><tr><td>細胞選別機</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSAria III</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ザルトリウス</td><td>A-14C</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブ (1.5 mL)</td><td>エッペンドルフ</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン (15 mL)</td><td>コーニング</td><td>352096</td><td>ポリプロピレン遠心チューブ</td></tr><tr><td>ファルコン (5 mL )</td> <td>コーニング</td><td>352052</td><td>ポリスチレン丸底試験管</td></tr><tr><td>ファイン 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Flowmi セル ストレーナー (40 &mu;m)</td><td>シグマ</td><td>BAH136800040</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>ガラス瓶 (250mL)</td><td>VWR</td><td>215-1593</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底皿</td><td>ワールド精密機器</td><td>FD3510-100</td><td>フルオロディッシュ 35mm</td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>VWR</td><td>612-1701</td><td></td></tr><tr><td>ガラスピペットソケット</td><td>カール・ロス</td><td>388.1</td>ピ<td>ペッティングエイドパイポンプ2500</td></tr>ヘ<tr><td>キスト染色染料溶液</td><td>Abcam</td><td>ab228551</td>ヘ<td>キスト33342</td></tr><tr><td>ミニッツ洗剤フリー核分離キット</td><td>Invent Biotechnologies</td><td>NI-024</td><td></td></tr><tr><td>PBS(10X)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿(30 mm)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11333704</td><td>パイレックス</td></tr><tr><td>ペトリ皿(90 mm)</td><td>コーニング</td><td>758-10178-CS</td><td>ゴセリン</td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>VWR</td><td>89079</td><td>10 &mu;L、200 &mu;L、1000 &mu;L</td></tr><tr><td>ピペット</td><td>ギルソン</td><td>F167380</td><td>ピペットマン</td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>スワン・モートン</td><td>7981809</td><td></td></tr><tr><td>トリカイン メタン スルホン酸</td><td>シグマ</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス マシン</td><td>サイエンティフィック・インダストリー</td>ズ <td>SI-0236</td><td>ボルテックス ジーニー 2</td></tr></tbody></table>

洗浄剤と酵素を含まない方法を用いた組織全体からの核分離

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

ハイスループットのトランスクリプトームおよびエピゲノムプロファイリングには、単一細胞または単一核懸濁液の調製が必要です。無傷の細胞または核を有する懸濁液の調製は、解離および透過性、望ましくない騒音および望ましくない損傷を引き起こす可能性のあるステップを伴う。特に、ニューロンなどの特定の細胞タイプは、個々の細胞への解き分けに挑戦しています。さらに、核を放出する細胞膜の透過性は試行錯誤による最適化を必要とし、時間がかかり、労働集約的で財政的に不可能である。ハイスループットシーケンシング用のサンプル調製の堅牢性と再現性を高めるために、迅速な酵素および洗浄剤を含まないカラムベースの核単離法について説明します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの脳全体から20分以内に核を効率的に分離することができます。単離核は、無傷の核形態と凝集する傾向が低い。さらに、フローサイトメトリーは、下流の適用のための細胞デブリの核濃縮およびクリアランスを可能にする。このプロトコルは、軟組織および培養細胞で動作する必要があり、高スループットプロファイリングに使用できるサンプル調製のための簡単でアクセス可能な方法を提供し、単核RNA-seqおよびATAC-seq実験を成功させるために必要なステップを簡素化します。

--上述のプロトコルは、ゼブラフィッシュの脳組織から直接単一核懸濁液を生成するために使用された。分離は通常20分を必要とし、洗剤または消化酵素の使用を避ける。図 1では、プロトコルの個々の手順を要約した回路図を示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig01.jpg"> 図1:核単離用の洗剤を含まないスピンカラムベースの方法の概略図 新鮮なゼブラフィッシュ脳組織からの核の抽出中に行われた個々のステップのグラフィカルな表現。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
核形態の可視化
核形態の定性的確認のために、単離された核をHoechstで染色し、蛍光顕微鏡を用いて可視化した。核は、そのまま、丸く、よく分離されて現れた(図2)。重要なことに、核膜破裂の兆候である核凝集は存在しなかった。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig02.jpg"> 図2:ゼブラフィッシュ脳からの単核単一分離。 その無傷の形態を示すHoechst染色された核の蛍光顕微鏡画像。スケールバー:10 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
インタクト核のFACSベースの濃縮
単離された核の濃縮および細胞デブリの除去は、Hoechst蛍光シグナルの存在下での測定によるフローサイトメトリーによって行われた。Hoechst信号は、バイオレット、405 nm、レーザー(ブリリアントバイオレット421 - BV421)で励起時に検出されました。未染色核は、バックグラウンド蛍光を示した(図3A、補足図1A)、染色された核が強い蛍光シグナルを示している間(図3B、補足図1B)。図3Cに示すように、未染色およびホークスト染色された核は、紫色チャネルに十分に分離されていた。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig03.jpg"> 図3:単離された核は、フローサイトメトリーにおいて強く特異的なHoechst蛍光シグナルを表示する。 1つの核懸濁液のためのヒストグラムプロットは、Hoechst染色の分布を表示する。Hoechstはバイオレット、405 nm、レーザー(ブリリアントバイオレット421 - BV421)によって興奮しています。染色されていないサンプル(A)は100-103の範囲の信号を表示し、一方、Hoechst染色された核(B)は103-105の範囲で信号を放出する。染色されていない(灰色)および染色された(青色)サンプル(C)によって放出される蛍光強度のオーバーレイは、2つの集団間の明確な分離を示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471supfig01v2.jpg"> 補足図1:単離核のフローサイトメトリー測定戦略単離核懸濁液の代表的な流れプロット。分離核は、405nmでHoechstを励起する前方散乱およびバイオレットレーザーBV421を用いて分析した。未染色サンプル(A)は、10 0-103の範囲で0BV421信号を表示した。313130件のイベントのうち、141のイベントがFSC-A(全体の1.07%)に基づく単一核として検出され、BV421信号に基づく不染色核に対する0事象(全体の0%)が検出されました。このHoechst染色原子核(B)は、103-105範囲でBV4215信号を表示した。350000件のイベントのうち、FSC-A(全体の4.84%)に基づく単一核として2418件のイベントが検出され、BV421信号に基づくHoechst陽性核の2414件(全体の4.83%)が検出されました。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471supfig01.jpg" target="_blank">こちらをダウンロードしてください。</a>

単核単離は、細胞膜の解離および洗剤ベースの透過性、最適化を必要とし、技術的なアーティファクトを導入する傾向があるステップに依存しています。我々は、単核RNA-seq(snRNA-Seq)またはATAC-seqに適した核を得て、組織全体から直接無傷核を迅速に単離するための洗浄剤および酵素フリープロトコルを実証する。

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

単一細胞または単一核懸濁液を調製することは、高スループットのトランスクリプトームおよびエピゲノムプロファイリングのための重要なステップです。当社のプロトコルは、単一核の単一の分離のための簡単で、再現性、そして普遍的な方法を提供する。核単離に洗剤を必要とする他の方法とは対照的に、私たちのプロトコルは、洗浄剤と酵素フリーであるカラムベースです。それは30分未満で核の単離を可能にする。私たちのプロトコルは核の分離を簡素化します。これは、解離しにくい組織からの単一の核懸濁液を調製するための堅牢な方法を提供します。まず、少なくとも30分間氷の上に置くことによって、洗剤を含まない核分離キットからプレチルバッファAとB。5%BSA溶液を用いたチューブとピペットの先端をコーティングし、核の回収を強化します。ピペットの先端をコーティングするには、ピペット5%BSA溶液を2〜3回、空気乾燥2時間乾燥する。チューブをコーティングするには、BSAでそれらを埋め、それらを3回反転させます。溶液を取り除き、きれいなティッシュペーパーの上でチューブを逆さまに乾かします。1つのサンプルに1つのコレクションチューブと1.5ミリリットルのチューブをコーティングします。鉗子を使用して頭蓋骨を優しく壊し、頭蓋骨の腹側と後側から柔らかい組織、皮膚、骨を取り除きます。その後、氷冷PBSを含む30ミリメートルの皿に脳をそっと移し、カミソリの刃を使用して脳を小片にミンチします。単一の核を分離するには、核分離キットに用意されているフィルターカートリッジに細かく組織を移し、余分な溶液を取り除き、200マイクロリットルのコールドバッファーAを加え、プラスチック棒で組織を2分間粉砕します。300マイクロリットルのコールドバッファーAをフィルターカートリッジに加え、キャップを10分間開けた状態で氷の上でインキュベートします。その後、カートリッジをキャップし、チューブを5回反転させることによって組織を再中断します。サンプルチューブを16,000回gで30秒間遠心分離し、細胞を破裂させる。フロースルーには無傷の核が含まれており、チューブの底に無色ペレットを形成します。フィルターを捨ててから、10秒間激しくボルテックスしてペレットを再中断します。500回gで溶液を3分間遠心して再び核をペレット状にした。その後、上清を慎重に捨てます。ペレットを0.8ミリリットルのコールドバッファーBに再懸濁させ、2~3回ピペットし、600倍gの核を遠心分離して10分間、膜の破片から分離します。上清を慎重に捨てなさい。5%BSAでPBSの500マイクロリットルで単離された核を再懸濁し、FACSまで氷の上に懸濁液を保ちます。HEX染色で核形態を確認するには、BSAコーティングされた先端を使用して、単核懸濁液の100マイクロリットルを新しいチューブに移します。0.1マイクロリットルのHEXを加え、チューブを穏やかに渦液にすることによって核を染色する。405ナノメートルのレーザー励起設定を用いた蛍光顕微鏡を使用して、核懸濁液をガラス底皿に移し、核の画像を画像化します。FACS を実行する前に、40 マイクロメートルの細胞ストレーナーを用いて、BSA コーティングチューブに核をフィルターします。5%BSAのPBSを加えて、1,000マイクロリットルの最終容量にフィルターした懸濁液を希釈します。コントロールとして2つの丸底FACSチューブをラベル付けし、染色し、BSAコーティングされたピペットチップを使用してコントロールチューブに核懸濁液の250マイクロリットルを移します。残りの750マイクロリットルの溶液を染色とラベル付けされたFACSチューブに移し、1マイクロリットルのHEX染料を加えて核を染色する。その後、ゆっくりと渦を混ぜます。未染色のコントロール サンプルをセルソーターに読み込み、5,000 個のイベントを記録します。次に、染色されたサンプルをロードし、5,000のイベントを記録します。単一の核の識別のためのFACSゲートを描く。核は、コントロールと染色されたサンプルの間でHEX蛍光シグナルを比較することによって選択することができる。その後、5%BSAで50マイクロリットルのPBSを含む新しい1.5ミリリットルチューブに染色チューブからHEX陽性核を選別します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの脳組織から直接単一核懸濁液を生成するために使用された。単離された核をHEXで染色し、蛍光顕微鏡で可視化した。彼らは無傷で、丸く、よく離れているように見えました。重要なことに、核凝集は欠かれていた。単離された核の濃縮は、HEX蛍光シグナルの存在下で格子を行うことによってフローサイトメトリーで行った。染色されていない核は、強い蛍光シグナルを示しながら、背景蛍光を示した。染色されていない核は、紫色チャネルで十分に分離した。このプロトコルを試みる間、単一の核はプラスチック材料に固執する傾向があることを覚えておくことが重要です。核の潜在的な損失を防ぎ、効率を高めるために、プラスチック材料の基本的なコーティングが強く推奨されます。単一核懸濁液は、単一核RNAにさらに利用することができ、この技術は、複雑な生物学的システムにおける細胞の不均一性を解明し、細胞サブタイプおよび遺伝子ネットワークを定義するのに役立つ。洗浄剤と酵素を使用する方法を使用して、サンプル調製中に導入された技術的なノイズとバイアスを登録します。この方法は、単純化された、ロジスティックな単一核の分離を開発した。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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洗浄剤と酵素を含まない方法を用いた組織全体からの核分離

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