Name: Na+/K+ リシカルバーストへのポンプの寄与、モデリングとダイナミッククランプ解析で探索 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学ぶダイナミッククランプ法を用いたヒル心臓ニューロンにおけるNa⁺/K⁺ポンプと持続性Na⁺電流の役割。リアルタイムでイオン電流を制御し、バースト活動のメカニズムを解明する神経生理学的手法です。

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我々は、その破裂能力を実証したHN(7)ニューロンの予備的な動的クランプ実験のためのクリスチャン・エルクスレーベンに感謝する。アンジェラ・ウェニングは専門家のアドバイスで実験を支援しました。我々は、グラント1 R21 NS111355を通じてGSCおよびRLCに資金を提供したNIHを認める。

注:無脊椎動物実験対象は、NIHまたはエモリーおよびジョージア州立大学によって規制されていません。それにもかかわらず、この研究で使用されるリーチの苦しみを最小限に抑えるためにすべての措置が講じられました。
1. リーチ神経コードから孤立した神経節7を準備する
<ol><li>12:12の明暗サイクルで16°Cで脱イオン水で希釈した人工池水(海塩の0.05%を含む)でヒル ド・ヴェルバナ を脱液に維持します。</li>
	<li>砕いた氷のベッドで冷たい麻酔をして、動かくなるまで10分間&gt;して解剖のためにリーチを準備します。</li>
	<li>黒の樹脂張りの解剖皿を、115 mM NaCl、4 mM KCl、1.7 mM CaCl 2、10 mM D-グルコース、および10 mM HEPESを含む冷たい生理食類で〜1cmの深さまで、脱イオン水で充填します。pHは1 M NaOHで7.4に調整した。リーチの裏側を黒い樹脂裏打ち室にピン留めします(少なくとも2cmの厚さの樹脂の上に少なくとも2cmの深さで、少なくとも20cm x 10cm)。</li>
	<li>斜めの導光灯照明で20倍の倍率でステロ顕微鏡の下で、身体の1/3番目 の部分の胴壁を通して5mmのスプリングハサミで長さ3cm以上の長手切りを行います。ピンを使用して体壁を脇に引っ張り、内臓を露出させます。 注:保存された血液の食事は、火で磨かれたパスツールピペットで吸引することによって除去することができます。</li>
	<li>個々の中型神経節7(脳に7番目の自由な分節性神経節尾体)を分離する。<ol>
<li>5mmスプリングハサミを使用して、神経コードが存在する大台を開きます。正気で正気を切り裂き、腹腔を2本の部分に残してください。切断を導き、しなじを保持するために鋭い#5鉗子を使用してください。</li>
		<li>神経節から出てくる2つの両側神経根のそれぞれに根本の根根を取り付けて(各根にしっかりと付着する)、これらの根本の部分を使用して神経節を固定する。</li>
		<li>神経節(可能な限り7番目 の神経節から離れた)と鼻のストリップを結ぶ羅門と尾骨結合神経束を切断することによって、体から神経節を取り除き、根を横に切って、根を鼻から出てくる場所に切ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>短いミニットン昆虫ピン、腹側、透明な樹脂が並ぶペトリ皿で、ガングリオン(古い鈍い#5鉗子を使用して)をピン留めします。根と、できるだけ神経節から離れた、根と鼻孔および尾子結合に付着する緩い組織のストリップにピンを挿入します。 注:録音中に下からの良好な照明を達成する場合は、樹脂は3mm以上の厚さにする必要があります。ガングリオンが縦方向にも横方向にも緊張していることを確認してください</li>
	<li>立体顕微鏡の倍率を40倍以上に増やし、神経細胞体が会縁部のすぐ下の神経節の腹側表面に容易に見られるように斜めの照明を調整する。</li>
	<li>マイクロシザーでガングリオン(デシース)のペリネリウムを取り除きます。<ol>
<li>片側の根の間の緩い鞘を切断して脱皮を開始し、反対側に横方向にカットを続け、はさみ刃を表面的に保ち、鞘の真下の神経細胞体に害を与えないようにします。</li>
		<li>正線に沿って横切りから同様の表面的なカットを行います。</li>
		<li>今、細かい#5鉗子で片側の鞘のコードラテラフラップをつかみ、ガングリオンから引き離し、マイクロシザーでそれを遮断します。</li>
		<li>反対側で繰り返します。この手順は、マイクロ電極で記録するための両方のHN(7)ニューロンを公開します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>録音セットアップに準備皿を置き、室温で5mL/分の流量で生理食物でスーパーフューズします。</li>
</ol>2. 鋭利な微小電極を用いたリーチ心拍間を識別し記録する
<ol><li>HN(7)ニューロンの記録(記録は30〜60分の間)の間、デジタルデータ取得(アナログからデジタル、AからD)および刺激(アナログ、DからA)システムを用いて5kHzの速度で、神経生理学的電気計のサンプリングから細胞内電流および電圧トレースを取得し、デジタル化し、 をクリックして、コンピュータの画面に表示します。 注: 商用またはカスタム構築のソフトウェア、および A から D から A へのボードは、データの取得 (A ~ D) に使用できます。D から A へのソフトウェアとカスタム構築ソフトウェアは、動的クランプに必要です。</li>
	<li>下から暗視野照明を備えた50-100xのステロ顕微鏡の下で、中間神経節7の後方位置にある正準位置によって、両側対のHN(7)ニューロンを暫定的に同定する。</li>
	<li>今度は、2 M酢酸カリウムと20 mM KClをマイクロマニピュレータを使用して満たされた鋭い微小電極を持つ推定HN(7)ニューロンを貫通することを目指します。<ol>
<li>マイクロ電極をターゲットセル本体の近くに置きます。</li>
		<li>電計で記録電位を継続的に観察し、ニューロンを貫通する前にこの電位をゼロmVに設定します。</li>
		<li>マイクロ電極でニューロンを貫通し、マニピュレータで長軸に沿って電極をゆっくりと駆動する。電解波機能を使用して、膜電位の負のシフトと活発なスパイク活性が観察されるまで、100 msのバズ持続時間に設定する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3kHz ≥の不連続電流クランプモード(DCC)に電計を設定して膜電位を同時に記録し、単一のマイクロ電極で電流を通過します(容量補償はリングのすぐ下に設定され、10%ダイヤルバックされます)。<ol>
<li>オシロスコープ上のDCC中の電極の沈降を監視します。</li>
		<li>1~2分間、電気計安定電流インジェクターで-0.1 nAの安定電流を注入し、記録を安定させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>特徴的なスパイク形状と弱い破裂活性によってHN(7)ニューロンを明確に特定する(図1Ci)。</li>
	<li>実験が完了した後、データ分析をオフラインで実行し、すべてのデータをディスクに保存します。</li>
</ol>3. リアルタイムのHNまたは他のモデルニューロンを構築する
<ol><li>デジタル信号処理ボード(DSB)を使用してカスタムソフトウェアを構築します。D to AおよびA to D)は、他のニューロンまたは実験のために2、4または異なるモデル電流に記載されているモデル電流をリアルタイムで実装するデスクトップコンピュータで。<ol>
<li>モデル電流を表現する一般的に好ましい方法として、ホジキン-ハクスリースタイル方程式を使用します。</li>
		<li>ポンプ電流を追加する前のリアルタイムHNモデルとダイナミッククランプの実装の詳細については、7 を参照してください。HNモデルにおける生きているHN(7)ニューロンの電流、細胞内Na+ 濃度、および伝導度の説明については、導入セクションを参照してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ダイナミッククランプのコンダクタンス/電流を実装し、変化
<ol><li>DSB 用のカスタムメイドのダイナミック クランプ ソフトウェアを使用して、グラフィカル ユーザ インターフェイス (図 3) (GUI) でアクセス可能なプログラムされたコンダクタンスと HN(7) ニューロンの HN リアルタイム モデルの電流をリアルタイムで動的クランプで実装および変更します。 注:リマインダーとして <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> 、 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> および持続Na+ 電流(IP)と最大ポンプ電流(Iポンプ)の最大の伝導度です。</li>
	<li>ソフトウェアの GUI 入力ボックスを使用して、モデルの実行中に <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> (PumpMaxL ボックス) および <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (GpinHNLive ボックス) (図 3)を変更します。 注: GUI 入力ボックスは型指定された値を受け入れ、0.1 nA のステップを推奨 <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> し、1 nS のステップを推奨 <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> します。<ol>
<li><img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> 図1Ciiに示すように、微小電極誘発リークによって弱まるHN(7)ニューロンの破裂を安定させるために、少量のダイナミッククランプを加える。 注:鋭い微小電極の貫通は、漏れ伝導度の増加または入力抵抗の低下として表現される膜損傷を引き起こします。</li>
		<li><img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">マイクロ電極誘発リークを補う0.1-0.2 nAの値を加算することから始めるが、興奮性を低下させ、その後徐々に増加し <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> 、通常の破裂が続くまで、興奮性が増加し、通常は <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> ~1-4 nSである(図4A)。</li>
	</ol></li>
	<li><img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">動的クランプを使用して記録されたHN(7)ニューロンにこれらの電流(0.1 nAの増分と1 nSの増分)を体系的に共に変化 <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> させ、バースト特性に及ぼす影響を評価する:スパイク周波数(f:バースト中のインタースパイク間隔の平均の逆数)、インターバースト間隔(IBI:次のバーストの最初のスパイクまでの最後のスパイク間の時間) バースト期間(BD:バーストの最初のスパイクとバーストの最後のスパイクの間の時間)、バースト期間(T:バーストの最初のスパイクと後続のバーストの最初のスパイクの間の時間)。<ol>
<li>と の値 <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> <img alt="Equation 19" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> を変更して、ビデオ デモのように、この手法に慣れてから、冒険を始めます。<ol>
<li><img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">特定の固定値で保持し、通常のバースト活動をサポートする範囲にわたって 1 nS 単位でスイープ <img alt="Equation 21" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> します。</li>
			<li><img alt="Equation 22" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">0.1 nA の固定値を増やし、定期的なバースト活動をサポートする範囲を再びスイープ <img alt="Equation 23" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> します。</li>
			<li>実装されたパラメータペアごとに、少なくとも8つのバーストを含むデータを収集して、f、IBI、BD、およびTの信頼性の高い平均測定値を作成できるようにします。</li>
			<li>強いスパイクと振動の安定したベースライン電位によって評価されるように、ニューロンが生存可能である限り、スイープを続けます。</li>
			<li>複数のニューロンからデータを収集 (異なる動物から) 合成グラフを生成する (図 5)。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cymbalyuk, G. S., Gaudry, Q., Masino, M. A., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursting+in+leech+heart+interneurons%3A+cell-autonomous+and+network-based+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bursting in leech heart interneurons: cell-autonomous and network-based mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 22, 10580-10592 (2002).</li>
<li>Hill, A. A., Lu, J., Masino, M. A., Olsen, O. H., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+a+segmental+oscillator+in+the+leech+heartbeat+neuronal+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A model of a segmental oscillator in the leech heartbeat neuronal network.</a> Journal of Computational Neuroscience. 10, 281-302 (2001).</li>
<li>Tobin, A. E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myomodulin+increases+Ih+and+inhibits+the+NA%2FK+pump+to+modulate+bursting+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Myomodulin increases Ih and inhibits the NA/K pump to modulate bursting in leech heart interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 94, 3938-3950 (2005).</li>
<li>Kueh, D., Barnett, W. H., Cymbalyuk, G. S., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28%2B%29%2FK%28%2B%29+pump+interacts+with+the+h-current+to+control+bursting+activity+in+central+pattern+generator+neurons+of+leeches%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Na(+)/K(+) pump interacts with the h-current to control bursting activity in central pattern generator neurons of leeches.</a> eLife. 5, 19322(2016).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Barnett, W., Cymbalyuk, G. Hybrid systems analysis: real-time systems for design and prototyping of neural interfaces and prostheses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarnett%2C+W+%22Biohybrid+systems%3A+nerves%2C+interfaces%2C+and+machines%22">Biohybrid systems: nerves, interfaces, and machines</a>. Jung, R. , Wiley VCH Verlag. Weinheim. 115-138 (2011).</li>
<li>Sorensen, M., DeWeerth, S., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+hybrid+neural+system+to+reveal+regulation+of+neuronal+network+activity+by+an+intrinsic+current%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Using a hybrid neural system to reveal regulation of neuronal network activity by an intrinsic current.</a> Journal of Neuroscience. 24, 5427-5438 (2004).</li>
<li>Olypher, A., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+systems+analysis+of+the+control+of+burst+duration+by+low-voltage-activated+calcium+current+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Hybrid systems analysis of the control of burst duration by low-voltage-activated calcium current in leech heart interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 2857-2867 (2006).</li>
<li>Calabrese, R. L., Prinz, A. A. Realistic modeling of small neuronal networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCalabrese%2C+RL+%22Computational+Modeling+Methods+for+Neuroscientists%22">Computational Modeling Methods for Neuroscientists</a>. DeSchutter, E. , MIT Press. MA, USA. 285-316 (2010).</li>
<li>Rybak, I. A., Molkov, Y. I., Jasinski, P. E., Shevtsova, N. A., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+bursting+in+the+pre-B%C3%B6tzinger+complex%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rhythmic bursting in the pre-Bötzinger complex: mechanisms and models.</a> Progress in Brain Research. 209, 1-23 (2014).</li>
<li>Picton, L. D., Nascimento, F., Broadhead, M. J., Sillar, K. T., Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+pumps+mediate+activity-dependent+changes+in+mammalian+motor+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sodium pumps mediate activity-dependent changes in mammalian motor networks.</a> Journal of Neuroscience. 37, 906-921 (2017).</li>
</ol>

モデリング、動的クランプ、およびそれらが可能になる結果の分析は、個々およびイオン伝導度/電流のグループがニューロンの電気的活動にどのように寄与するかを探索するのに有用な技術である(図1、図2、図4、および図5)。これらの技術の使用は、Na+/K+ポンプ電流(Iポンプ) が電圧ゲート電流、特に持続性Na+電流(IP)と相互作用して、リーチハートビートパターンジェネレータのコアHNにおける堅牢な破裂を促進する方法を示しています。動的クランプ実験とモデリングを組み合わせることで、通常の電圧記録や電流クランプ技術で可能な限り直接的にモデルをテストすることが可能です。ダイナミッククランプ実験から得られた結果(図5)を用い、HNモデルをさらに改良します。ここで示す動的クランプの基本的な方法は、ニューロン電流の数学的モデルを電圧クランプ実験で決定できる場合、研究中のニューロンの特性を反映するようにカスタマイズすることができます。
ここで示すタイプの実験を成功させるには、鋭利な微小電極を用いた場合にHNまたは他のニューロンの入念な不形成が必要であり、電極浸透1によって強い破裂が抑制されるためである。(全細胞パッチ記録技術は、導入されたリークを最小限に抑え、他のニューロンにも適用可能ですが、リーチニューロンではうまく機能しません。HNニューロンの障害がニューロンへの損傷を最小限に(追加リーク)させ、入力抵抗を監視し、実験を成功させるためには60-100MOhmsの範囲になければならないことが重要である。
動的クランプは強力な技術であるが、人工的なコンダクタンスは記録電極の部位で実施されるため、ニューロン幾何学によって課される限界がある。リーチHNニューロンでは、細胞体は、ほとんどの活性電流が局在するニューロンの統合ゾーン(主神経突起)に電気的に近く、スパイクが開始される。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61473">Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses</a>. An author name was updated.
The&#160;name of the first author was updated from:
Ricardo Javier Erazo Toscano
to:
Ricardo Javier Erazo-Toscano

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61473">Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses</a>. An author name was updated.

Erratum: Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

リーチの心拍は、多くの中半体の分節性神経節に分布する9つの両側対の心臓インターニューロン(HN)からなるCPGによって駆動される。CPGの中核は、半中心発振器(HKO)を形成する第3および 第4の セグメント性神経節に位置するニューロン間の相互阻害対である(図1A)。これらのニューロンは、共分的に単離された薬理学的にビキュリン1を使用すると破裂し続ける。第7の セグメント性神経節(このプロトコルの焦点)のペアのような他のものは、バーバーサでもあり、同種分離時にバースト活動を生じさせることができる。それらは相互に接続されておらず、下降入力のみを受け取るため、神経節を神経コードの残りの部分から切断することによって容易に単離される。この独立したバースト活動は、記録用の鋭い微小電極での浸透によって引き起こされる導入されたリーク電流に敏感であるが、緩いパッチ法1で記録されると激しく破裂する。
個々のHNニューロンとHNHCOの両方がモデル化されている(全ての実験的に同定された電圧ゲート電流及びシナプス電流を含むHNニューロンのホジキン・ハクスリーベースの単一イソポテンシャルコンパートメントモデル)、及び生きているシステムのすべてのバースト特性が正常に捕捉された2。ミオモジュリンは、リーチ中の内因性神経ペプチドであり、孤立したHNニューロンおよびHNHKOのバーストリズムの期間(T)を著しく減少させる。この変調器は、h-電流を増加させる(超分極活性化内流、Ih)とIポンプ3を減少させる作用をする。この観察は、私がポンプがIhとどのように相互作用するか、そしてそれらの共変調がHNニューロンのリズミカルな活動にどのように寄与するかを探求することにつながった。[Na+]iを増加させることによるポンプの活性化(イオノフォアモネンシンを使用)は、HNHKOと単離されたHNニューロン4の両方でHNバーストリズムを高速化する。この高速化はIhに依存していましたが、hがブロックされたとき(2mM Cs+)、バースト期間はこのポンプ活性化の方法によって変更されませんでした。しかし、バースト持続時間(BD)は縮小され、HN HKOと単離されたHNニューロン4の両方でインターバースト間隔(IBI)が増加した。
このプロトコルでは、ポンプ電流を含む生きているHN(7)ニューロンのすべての電流は、次のようにHNモデルに組み込まれています。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq01v2.jpg"> (1)
ここでCは膜容量(nF)、Vは膜電位(V)、tは時間(s)である。 詳細なイオン電流の記述と方程式は、他の2,4に記載されています。完全なHNモデルニューロンはリアルタイムで実行されます(図2)。ソフトウェアは公開時にGitHubで利用可能になり、資料一覧に記載されているデジタル信号処理ボードで実行するのに適しています。ここでは、問い合わせの焦点は、Na+/K+ポンプ電流(Iポンプ) と重要な Na+フラックスに寄与する電圧ゲート電流です: 高速 Na+電流 (INa) と持続的な Na+電流 (IP).これらの電流の最大の伝導度 <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq1a.jpg"> <img alt="Equation 1b" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq1b.jpg"> は、それぞれです。Na+/K+ポンプは、2つの細胞外K+イオンに対して3つの細胞内Na+イオンを交換し、したがって正味の外流を生成する。重要なことに、この電流が示すニューロンの3倍のNa+をポンプで送り出し、これは細胞内Na+濃度を計算するために重要である。
Na+/K+ ポンプ電流は細胞内Na+ 濃度に依存し、以下のシグモイド関数によって表されます。
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq02.jpg"> (2)
ここで[Na]i は細胞内Na+濃度 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> 、最大Na+/K+ポンプ電流、及び[Na]ihはNa+/K+ポンプの半活性化のための細胞内Na+濃度であり、[Na]はNa+/K+ポンプの感度である。 [Na]Iは 、IPとINaによって運ばれるNa+流入の結果として構築され、Na+/K+ポンプのNa+流出によって減少する。Na+フラックスの合計に対するIhとIリークの寄与は小さく、リアルタイムモデルでは考慮されません。
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq03.jpg"> (3)
ここで、vは細胞内Na+ 貯留層の体積(約6.7pL)であり、Fはファラデーの一定であり、細胞外Na+ 濃度は一定に保たれている。
電圧ゲート付きおよびリーク伝導度は、膜電位に対する応答が分化されており、計算された細胞内Na+濃度によって調節されるポンプ電流とは異なっている([Na+]i)。[ナ+]iは、アクションポテンシャル(スパイク)と、スパイクをサポートする脱分極を提供する持続Na+電流(IP)を生成する高速Na+電流(INa)を介してNa+エントリを介して構築されます。[ナ+]iは、今度は、Na+の押出を通してポンプの作用によって減少する。ベースラインの生きているHN値 <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (5nS)と <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgna.jpg"> (150 nS)が想定されており、追加された動的クランプを考慮に入れます <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> 。
ここで説明するプロトコルの目的は、私が正確かつ可逆的にリアルタイムでポンプを操作して、電圧ゲート電流(電流プロトコル内の持続的なNa+電流)とどのように相互作用するかを発見し、単一のHNsでリズミカルな破裂を制御することです。この目標を達成するために、動的クランプを使用し、これは、モデルの実行中に計算できる電流の正確な量を、コマンドで人為的に導入しました。この方法は、組織全体に影響を与えるポンプの薬理学的操作よりも利点があり、しばしば逆転しにくいオフターゲット効果を有し、正確に操作することができない。動的クランプ5、6は、記録されたニューロンの電圧をリアルタイムで読み取り(図1B)、モデル方程式に基づいて任意の電流量および任意のまたはのいずれかの設定値に基づいて、リアルタイムで、任意の電流量を計算し、注入 <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> する。同様の方法は、細胞内で記録することができる任意のニューロンに簡単に適用することができます。しかし、パラメーターは選択されたニューロンに再スケールする必要があり、ニューロンはシナプス入力から分離する必要があります, 例えば, 薬理学的.

<table><tbody><tr><td>ANIMALS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hirudo verbana</td><td>Leech.com、https://www.leech.com/collections/live-leeches</td><td></td><td>生きたヒル2-3グラム</td></tr><tr><td>CHEMICALS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人工池の水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C5670-100G</td><td>1.8 mM pH グルコースを調整した後、最後に追加</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>インスタント オーシャン (海塩)</td> <td>Spectrum Brands Inc., Madison, WI</td><td></td><td>0.05% (w/v) 脱イオン水で希釈</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>4 mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>S7653-250G</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>NaOH 0.1 N 溶液</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>2105-50ML</td><td>NaOH</td></tr><<tr><td>ストロング > マイクロ電極 </ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K アセテート</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P1190-100G</td><td>2 M</td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P9333-500G</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#5 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール デュモン</td><td>11251-30 OR 11251-20</td><td>一般的なヒルの解剖用</td></tr><tr><td>AxoClamp 2A/2B DCC 電位計</td><td>Axon Instruments 分子デバイス</td><td>2A/2B</td><td>神経膜電位と不連続電流クランプの記録用</td></tr><tr><td>ブラックレジン</td><td>ダウ シルガード</td><td>170</td><td>ライン 一般解剖皿</td></tr><tr><td>キャピラリーガラス 外径1mm、内径0.75mm</td><td>A-Mシステム</td><td>615000</td><td>鋭利な微小電極の製造用</td></tr><tr><td>透明樹脂</td><td>ダウ・シルガード</td><td>184</td><td>ライン 電気生理学のための神経節の取り付けに使用されるシャーレ</td></tr><tr><td>暗視野コンデンサー</td><td>ニコン</td><td>ドライ 0.95-0.80 MBL 1210</td><td>細胞串刺しの際の神経節調製の照明用</td></tr><tr><td>Digidata1440A</td><td>Axon CNS Molecular Devices</td><td>1440A</td><td>は、電気生理学中のデータ収集と刺激のためにAからDおよびDからAを実行します</td></tr><tr><td>デジタル信号処理ボード</td><td>dSpace</td><td>CLP1104</td><td>当社のソフトウェアは、ControlDesk GUI(dSPACE、 パーダーボルン、ドイツ)9.&nbsp;</td></tr><tr><td>ファルミング/ブラウンマイクロ電極プーラー</td><td>サッターインスツルメンツ</td><td>P-97</td><td>鋭利な微小電極の作製用</td></tr><tr><td>ファイバーライト高強度イルミネーター</td><td>ドラン・ジェンナー・インダストリー</td>ズ <td>170D</td><td>細胞串刺しの際の一般的な解剖と神経節の準備を照らすため</td></tr><tr><td>アクソクランプ用ヘッドステージアンプ 2A</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td>HS-2A ゲイン:0.1LU</td><td>現在、ニューロン膜電位と不連続電流クランプの記録のための分子デバイスの一部</td></tr><tr><td>ライトガイド</td><td>Dolan Jenner Industries</td><td>Rev R 38 08 3729107</td><td>一般的な解剖を照らし、細胞串刺し中の神経節の準備を照らすため</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-385</td><td>マイクロ電極付き細胞串刺し用のマイクロマニピ</td></tr><tr><td>ュレーター マイクロマニピュレーターコントローラー</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td>マイクロ電極による細胞串刺しのためのマイクロマニピュレーターを制御</td></tr><tr><td>Minutenピン</td><td>BioQuip</td><td>0.15 mm直径 1208SA</td><td>~5mmにカーティングして短縮する必要があります</td></tr><tr><td>光学ブレッドボード 3フィート×5フィート×8インチ</td> <td>ニューポート</td><td>廃止</td><td>以下の4つの空気圧アイソレータを使用して、電気生理学</td></tr><tr><td>のための振動のないワークスペースを構築するために使用されますオシロスコープ</td><td>HAMEGインスツルメンツ</td><td>HM303-6</td><td>DCC</td></tr><tr><td>Pascheff-Wolff スプリングハサミ</td><td>モリア</td><td></td><td>Fine Science Tools (フォスターシティ、カリフォルニア州) カタログ # 15371-92</td></tr><tr><td>pClamp 9 ソフトウェア</td><td>Axon Instruments</td><td>9</td><td>現在、Moleculear Devices の一部は、電気生理学中のデータ収集と刺激に Digidata 1440 を使用しています</td></tr><tr><td>空気圧アイソレータ 28"</td><td>Newport</td><td>Obsolete</td><td>電気生理学の振動のないワークスペースを構築するために使用される光学ブレッドボード</td></tr><tr><td>Simulink / MATLABソフトウェア</td><td>MathWorks</td><td>2006 (Obsolete)</td><td>デジタル信号処理ボードに動的クランプを実装します</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Wild</td><td>M5A</td><td>10x Eye Pieces ヒルの解剖と除去および脱皮神経節</td></tr><tr><td>Steromicroscope</td>に使用されます<td>野生の</td><td>M5</td><td>20xアイピースは、微小電極の浸透のためのニューロンを視覚化するために電気生理学ステーションで使用される</td></tr><tr><td>学生ヴァンナス春はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>91500-09</td><td>一般的なヒルの解剖用</td></tr></tbody></table>

na+/k+ リシカルバーストへのポンプの寄与、モデリングとダイナミッククランプ解析で探索

Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

Na+/K+ポンプは、しばしば神経活動の背景機能と考え、Na+の内部濃度に応答する外向きの電流(Iポンプ)に寄与する([Na+]i)。リズミカルな動きを生む中心パターン発生器(CPG)ニューロンネットワークのようなバーストニューロンでは、[Na+]iとIポンプは、バーストサイクルを通して変化することが期待できます。この電気的活動への応答性は、膜電位からの独立性と相まって、チャネルベースの電流(例えば、電圧または送信機ゲートまたはリークチャネル)に共通しない動的特性を有するIポンプを与える。さらに、多くのニューロンにおいて、ポンプの活動は様々な変調器によって変調され、リズミカルな破裂活動におけるIポンプの潜在的役割をさらに拡大する。この論文では、モデリングと動的クランプ法の組み合わせを使用して、ポンプの方法と、その持続的なNa+電流との相互作用がCPGのリズミカルな活動に影響を与える方法を示します。具体的には、薬用リーチの心臓インターニューロンにおける動的クランププロトコルと計算モデリング法に焦点を当てる。

Iポンプ4を追加したモデリングは、導入部で提示された実験所見をより鋭い焦点に持ち込み、破裂のポンプ支援機構を説明し始めた。ここで示したリアルタイムモデルは、 <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> <img alt="Equation 31" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> 実験で観察された正常な活動の範囲内に位置する定期的なリズミカルな活動(f、IBI、BD、T)を生成し、ミオモジュリン変調パラメータ <img alt="Equation 32" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> (最大ポンプ電流)および <img alt="Equation 33" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgh.jpg"> (h電流の最大伝導率)がモデル内で変化または共変されたときにそのような活動を引き続き生成するように調整されています(およびパラメータを選択しました)。決定されたパラメータ値は、モデリング実験のベンチマークまたは正規セットとして使用できます。これらのモデルインスタンスでは、ベースラインレベルの周りに [Na+]iとしてバーストサイクル全体を通して振動をポンプで送ります。私はバーストフェーズ中にバースト終了に寄与するポンプ、およびそれが生成する超分極はIBI中にIhを活性化します。バースト開始に近いIhの最大レベルに注意してください(図2)。
リアルタイムの HN モデルは、動的クランプに使用可能な電流2、4を実装していますが、ここでのフォーカス <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> は、 <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> 動的クランプ GUI でモデルが実行されている間に変更に使用できます (図3)。ダイナミッククランプにより、実験者は <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> 、実際のコンダクタンスまたは電流の電圧とイオン依存を模倣する任意のコンダクタンスまたは電流を人工的にニューロンに加算(または負または負で減算)することができます。したがって、特定のコンダクタンス/電流が細胞内の内因性の伝導度/電流とどのように相互作用するかを完全に調べることができます(図1)。リアルタイムHNモデルは、HNニューロンにおける持続的なNa+電流(IP)がNa+i(図2)に強く影響を及ぼすNa+エントリの多くを寄与していることを示し、したがって、私はポンプする。IPは比較的陰性の膜電位で活性であるので、IBI中でもポンプに反対する。
これらの観察は、 <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> 前に8,9,10で説明したように、動的クランプを用いて孤立したHNニューロンとの相互作用を探索することが有益であることを示しています。これらの実験(進行中)は、単一の同種分離HN(7)ニューロン(神経コードから切断された7番目の神経節)で鋭い微小電極記録で行われる。現在までに、これらの実験は、I PとIポンプを動的クランプで共加することにより、(微小電極浸透導入リークによる)トーン的に活性なHNニューロンで堅牢なバーストが回復することを示している(図4)。これは、IポンプとI Pの相互作用から生じる(リークが損なわれた場合でも)これらのニューロンでバーストメカニズムが利用可能であることを示す重要な観察である。予備的な結果は、モデルと実験で探求することができる強力な複雑な相互作用を示しています(図5)。
結論として、バースト活動中の[Na+]iの周期的な増加に応じてポンプを行い、バースト終了(BDの減少)を通してバーストリズムに寄与する。IPとIポンプの相互作用は、内因性の破裂活性をサポートするのに十分なメカニズムを構成する。このメカニズムは、神経節7で細胞内に記録されたHNインターニューロンにおける堅牢な破裂を復活させることができる。[Na+] を介してIPとIポンプの相互作用は、HN バースト期間に非単調に影響し、自律バーストの堅牢性を保証します。これらの結論は、脊椎動物システム11,12における実験とモデリングと一致している。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig01.jpg"> 図1:リーチ心臓ニューロンの電気活動とIポンプとI Pの動的クランプによる実装(A)は、細胞外(上)および細胞内(下)に、第3の神経節からのリーチ心拍HCOにおいて、記録されたニューロンおよびそれらの相互阻害性シナプス結合の概略である。(B) 孤立した神経節 7 で HN(7) インターニューロンを記録する場合の動的クランプ回路図。2 つの HN(7) インターニューロン間にシナプス相互作用はありません。(Ci)漏れ損HN(7)インターニューロンで破裂。(Cii)より堅牢なバーストは、 <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> マイクロ電極誘導漏れを補う動的クランプIポンプ(=0.1 nA)を加えることによって生成することができますが、興奮性を <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> 低下させ、(1 nS)、興奮性を高める。黒い破線はベースライン値を示します。略語: HN = 心臓インターニューロン;HCO = ハーフセンターオシレータ;私はポンプ=外向き電流;IP =持続的な Na+電流;<img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= 最大 Na+/K+ポンプ電流; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg">= 持続Na+電流の最大コンダクタンス;Vm = 膜電位;[ナ+]i = Na+の内部濃度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig02.jpg"> 図2:膜電位(Vm)の痕跡を示す単一HNインターニューロンモデル、Ih、Iポンプ、[Na+]i、およびI P.外向きの過分極電流は陰性であり、内向きの脱分極電流は正である。黒い破線はベースライン値を示します。略語: HN = 心臓インターニューロン;私はポンプ=外向き電流;IP =持続的な Na+電流;<img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= 最大 Na+/K+ポンプ電流;Ih =超分極活性化内流れ;<img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg">= 持続Na+電流の最大コンダクタンス; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgh.jpg">= 超分極活性化内流の最大伝導;Vm = 膜電位;[ナ+]i = Na+の内部濃度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig03.jpg"> 図3:リアルタイム心臓インターニューロン(HN)モデルのグラフィカルユーザーインターフェースとデジタル信号処理ボードに実装されたダイナミッククランプ 左上:赤の数学ボックスはリアルタイムモデルのユーザー定義のパラメータボックスで、Blue Liveボックスは動的クランプで使用されるユーザー定義のパラメータボックスです。El = リーク電流の反転電位;Gl = リークコンダクタンス;Gh = h-current 最大コンダクタンス;Gp = P電流最大コンダクタンス;GCaS = 遅いカルシウム電流最大伝導;ポンプマックス=ポンプの最大電流;[GSyn2 それぞれのニューロンへの最大シナプス伝導率;シナプスポテンシャルを媒介するためのThreshSyn2スパイク交差閾値 - これらは、ハイブリッド(リビング/モデル)ハーフセンターオシレーターを作るために使用されます。ダイナミッククランプの左下。一番左には、動的クランプ変数の5計算値があります: 私はポンプ=ポンプ 電流注入。Ih = h-current が注入された (ここでは使用されません);IP = P 電流が注入されました。NaI = 計算された内部 Na+ 濃度;ENa = 計算されたナトリウム逆転電位。ダイナミッククランプの左下。計算変数の右側には、6ユーザーが決定したパラメータボックスがあります:GNa =アクション電位に関連するNa+ フラックスを計算するために、想定された内因性高速ナトリウム最大伝導率の使用。PumpMaxL = 動的クランプによって注入される最大ポンプ電流;ナイは方程式(2)を参照してください。H = ダイナミッククランプによって注入されるh電流を決定する最大コンダクタンス;Gp = 想定内因性 P 電流最大コンダクタンス使用で、内因性 P 電流に関連する Na+ フラックスを計算します。GpinHNLive = ダイナミッククランプによって注入されるP電流を決定する最大コンダクタンス。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig04.jpg"> 図4:独立HN(7)バーストの動的クランプ解析<img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg">(A)4.0nSから(B)9.0nSのアップレギュレーションは、独立したHNバーストリズムを遅くする。実験的なトレースは、動的クランプを有する孤立したHN(7)ニューロンにおけるリズミカルな破裂を示す。[Na+]iと Vm の振動の範囲は、アップレギュレートと共に増加 <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> します。トレース上から下へ:記録されたVm、注入されたIポンプ、計算[Na+]i、および注入されたIP.黒い破線はベースライン値を示します。略語: HN = 心臓インターニューロン;私はポンプ=外向き電流;IP =持続的な Na+電流;<img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= 最大 Na+/K+ポンプ電流; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg">= 持続Na+電流の最大コンダクタンス;Vm = 膜電位;[ナ+]i = Na+の内部濃度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig05.jpg"> 図5:独立HN(7)バーストの動的クランプ解析 のアップレギュレーション <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> は減少する傾向が、続いてHNバースト期間が増加する。動的クランプを使用した個々の実験(線で接続されたポイント)では、 <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> 値を一定に保持しながら値 <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> をスイープした。色は、異なる <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> 実験で使用される追加された異なる定数レベルを表します。略語: HN = 心臓インターニューロン; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> = 最大 Na+/K+ ポンプ電流; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> = 持続Na+ 電流の最大コンダクタンス。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここで提示されるNa+/K+ポンプの役割と、動的クランプを用いたリーチ心臓インターニューロンにおける持続Na+電流の調査方法を示す。

Na+/K+ リシカルバーストへのポンプの寄与、モデリングとダイナミッククランプ解析で探索

The Na+/K+ pump, often thought of as a background function in neuronal activity, contributes an outward current (Ipump) that responds to the internal ...

動的クランプは、任意の膜電流を変更またはニューロンに導入することができます。ナトリウムカリウムポンプと持続ナトリウム電流を、リーチの生きた心臓インターニューロンに導入・変更します。ダイナミックランプを使用すると、リアルタイムでニューロンに導入された任意の電流のダイナミクスと振幅のキーストロークで完全な制御が可能になります。ダイナミッククランプなどのリアルタイムインタラクティブシステムの開発は、すべてのBMI研究を支えています。ニューロンとネットワークの電気的活動に関する細胞研究のすべての側面は、潜在的に動的クランプの使用から利益を得ることができます。この技術の主な課題は、ニューロンのリアルタイムモデルを開発し、研究のために選択されたニューロンに動的けいれん調整を較正することです。神経節7をリーチ神経コードから分離するために、黒い樹脂ラインを塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、Dグルコース、HEPESを補った冷たい生理食塩水の約1センチメートルを脱イオン水に充填し、冷たい麻酔付きリーチドーサル側をチャンバーにピンで留めます。斜めのライトガイド照明と5ミリメートルのスプリングハサミで20倍の倍率でステレオ顕微鏡を使用して、身体の下部第3部分の体壁を通して長手方向の切断を少なくとも3センチメートルにします。ピンを使用して体壁組織を引き離して内臓を露出させ、血液を掃除機をかけ、より良い視界を得る。個々の中型神経節7を分離する。鋭い数5鉗子を使用して切断を導き、正気を保持し、はさみを使用して神経コードが存在する正気を開き、側線と腹側を裂くように注意してください。神経節から出てくる2つの両側神経根のそれぞれに根本の根を取り付け、鼻と尾子の結合神経束を切って神経節を体から取り除き、根を横に切って、根を鼻から出てくる場所に切り取る。古い鈍いナンバー5鉗子を使用して、透明な樹脂が並ぶペトリ皿で短くなったミヌティエン昆虫ピン腹側で副根ストリップと緩い組織を固定します。可能な限りギャングリオンから離れてrostralと尾子の結合をピンし、しっかりと根をピン留めします。立体顕微鏡の倍率を40倍以上に増やし、神経細胞体が腹膜のすぐ下の神経節側で容易に観察できるように斜めの照明を調整します。マイクロハサミを使用して、神経節の片側の根の間の緩い骨膜鞘を切断し始め、反対側に横方向に切断を続け、鞘の真下の神経細胞体に害を与えることなく、はさみ刃を表面的に保つようにします。正中線に沿って横切りから同様の表面的なカットを行い、細かい番号5鉗子を使用して、シースの1つの尾側面フラップを一度にガングリオンから引き離して切除できるようにします。両方のフラップが取り除かれたら、両方の心臓インターニューロンが露出するべきである。録音セットアップに皿を置き、室温で毎分5ミリリットルの流量で生理食塩水でサンプルを過大化します。記録設定でニューロン間を識別するには、暗視野照明を下に50〜100X倍率を選択し、中体神経節7の後方位置に正準位置で両側対のHN 7ニューロンを見つける。次に、マイクロマニピュレータを使用して、標的細胞本体の非常に近くに2つの酢酸カリウムカリウムと20ミリモルクロリドマイクロ電極を充填した鋭利なマイクロ電極を配置し、神経生理学的電計を使用して記録された電位を連続的に観察します。この電位をゼロミリボルトに設定し、マニピュレータを使用してマイクロ電極でニューロンを貫通し、長い軸に沿ってゆっくりと電極を駆動します。膜電位の負のシフトと活発なスパイク活性が観察されるまで、100ミリ秒の電光計バズ機能を使用してください。不連続電流クランプモードで少なくとも3キロヘルツに電気計を設定し、同時にニューロンに電流を流しながら膜電位を記録します。オシロスコープを使用して電極の設定を監視し、安定した電流インジェクターを使用して、1〜2分間マイナス0.1ナノアンプの安定した電流を注入して記録を安定させます。HN 7ニューロンは、その特徴的なスパイク形状と弱い破裂活性によって同定することができる。動的クランプのコンダクタンスと現在の実装のために、デジタル信号処理ボード用にカスタム構築されたダイナミッククランプソフトウェアプログラムを開きます。また、モデルの実行中に、最大ポンプ電流を0.1~0.2ナノアンペアに設定し、通常の破裂が続くまで持続性ナトリウム電流の最大コンダクタンスを徐々に増加させます。ポンプ電流の最大出力と、持続性ナトリウム電流の最大導通度に対する1つのナノシーメン増分について、0.1ナノアンペア単位でこれらの電流を体系的に共変し、スパイク周波数、インターバースト間隔、バースト期間、バースト期間に対するこれらの増加の影響を評価します。特定の固定値でナトリウム電流の最大伝導を保持し、1つのナノシーメンによるナトリウム伝導の固定値を増加させ、最大ポンプ電流の第2範囲を掃引する前に、通常の破裂活性をサポートするために、最大ポンプ電流の範囲にわたって1ナノアンペア増分で掃引します。実装されたパラメータペアごとに、スパイク周波数、インターバースト間隔、バースト期間、バースト期間の信頼性の高い平均測定値を作成できるように、少なくとも8つのバーストを含むデータを収集します。次に、複合グラフを生成するために示したように、いくつかの追加のニューロンからデータを収集します。このモデルを使用すると、外側のポンプ電流は、ベースラインレベルの周りのナトリウムの内部濃度としてバーストサイクル全体を通して振動します。このポンプ電流は、バーストフェーズ中のバースト終端に寄与します。ポンプ電流によって生成される超分極は、インターバースト間隔の間に内流に活性化された超分極を活性化する。リアルタイム心臓インターニューロンモデルは、心のインターニューロンにおける持続性ナトリウム電流がナトリウムの内部濃度に強く影響を与えるナトリウムエントリーの多く、したがってポンプ電流に寄与することを示す。持続性ナトリウム電流は比較的陰性の膜電位で活性であるため、バースト間隔とインターバースト間隔の両方でポンプ電流に対して反応します。図示したように、堅牢な破裂は、動的クランプを備えた永続的なナトリウムとナトリウムカリウムポンプ電流の共加によって、トーン的に活性な心臓インターニューロンに回復する。予備的な結果は、モデルを使用してさらに検討することができる2つの電流間の強い複雑な相互作用を示しています。実験が成功した場合、ガングリオンの良好な脱シーシングと慎重に指示されたマイクロ電極の駆動、浸透、およびブンブンに依存します。イオンの細胞内濃度を推定して計算されるナトリウム依存ポンプ電流を実装することで、動的クランプを増強します。このような推定値は、ニューロンに任意のイオン依存電流を注入するために使用することができます。

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QNsim1.0を用いた電気刺激されたドーパミン神経伝達データからの高速スキャンサイクリックボルタンメトリーデータのモデリング

細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ここでは、カルシウム イメージング システムにより筋小胞体 Ca2...

分離の心室心筋の筋小胞体カルシウム拡張予備能と細胞内のカルシウム除去の評価

2つの気泡間の合体技術に基づく単一のトラップ音響気泡の形状振動を制御するための高速で信頼性の高い技術が提案されています。定常状態で対称的に制御された気泡形状振動により、気泡界面近傍で発生する流体の流れを解析できます。...

音響浮上システムにおける非球面気泡振動によるマイクロストリーミングの誘導

急速な心筋および心臓の弛緩は、正常な生理機能に不可欠です。機械的緩和機構は、ひずみ速度に依存することが現在知られている。このプロトコルは、リラクゼーションの機械的制御をさらに研究するための実験の取得と分析の概要を提供します。...

無傷の心臓小柱を用いたリラクゼーションの機械的制御

非栄養吸引(NNS)デバイスは、圧力トランスデューサーに接続され、データ収集システムとラップトップを介して記録されたおしゃぶりを使用して、NNSの特徴を簡単に収集および定量化できます。NNSパラメータの定量化は、子供の現在および将来の神経発達に関する貴重な洞察を提供することができます。...

カスタム圧力トランスデューサシステムを使用した非栄養吸盤パラメータ測定

このプロトコルは、マイクロコントローラーベースのビヘイビアボックスを提供し、ボックスの下のセンサーから加速度データを収集することにより、プリパルス阻害(PPI)を評価します。このデータは、社会的に隔離されたラットの感覚ゲーティング障害を評価し、行動障害に関する神経生理学研究を進めるために、データをニューロン活動と同期させる方法が追加されています。...

精神動物モデルにおけるプレパルス阻害と神経活動を評価するための行動ボックスの開発

動的クランプ電気生理学は、ニューロンの発火障害とイオンチャネル機能障害との間の因果関係を確立できます。マウス小脳プルキンエニューロンにおける動的クランプ法とプロトコルについて説明し、有用なリソースと技術的考慮事項に注目します。代表的な研究では、モデル化されたナトリウムコンダクタンスを Tsc1-/-...

自閉症に関連するニューロンの興奮性障害を調査するための動的クランプ法

グラミキシジンAドープされた液滴界面二重層を組み立て、電気刺激し、解析する実験プロトコルを提示します。脂質-タンパク質の構造-機能関係は、膜面積、イオンフラックス、単一チャネル伝導の変化を測定し、これらの応答を電気シナプスに着想を得た膜モデルにおける可塑性様のイオン伝導変化と関連付けることで定量化されます。...

液滴界面二重層を用いた脂質-タンパク質膜構造-機能の特徴解析

学ぶダイナミッククランプ法を用いたヒル心臓ニューロンにおけるNa⁺/K⁺ポンプと持続性Na⁺電流の役割。リアルタイムでイオン電流を制御し、バースト活動のメカニズムを解明する神経生理学的手法です。

Na⁺/K⁺ リシカルバーストへのポンプの寄与、モデリングとダイナミッククランプ解析で探索

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