Name: 特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶ水生カブトムシThermonectus marmoratusにおけるRNA干渉技術。dsRNAマイクロインジェクションによる遺伝子ノックダウンで、構造と行動に関する遺伝子機能を発生段階別に研究する方法です。

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ジョシュ・ブノイ博士のバイオインフォマティクス・ヘイリー・トブラーの支援に感謝します。この研究は、IOS-1456757とIOS-1856341をEKBに、IOS1557936をYTに付与下で国立科学財団によって支援されました。

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著者らは開示するものは何もない。

我々の目標は、この方法のコンパイルは、特にこのツールがCRISPR / Cas9ベースの遺伝子編集に対する強力な相乗技術であり、研究された生物の所望の発達段階に適用できるという利点を持つため、RNAiを広く利用可能にすることです。この強さを例示するために、我々は胚および異なる幼虫段階にdsRNAを注入した。卵への注射は胚の発生に影響を及ぼす(図2)、第2幼虫段階への注射は第3の幼虫段階(図4 および 図6)に明らかな影響を及ぼす(図4および図6)、そして第3幼虫段階への注射は成人に効果を示した(図5)。正確なタイミングは実験的に確立されなければならないが、一般的に、注射は数日以内に有効になる。このプロセスの成功は、dsRNA配列の長さによって影響を受ける可能性があります。ここでは、200 bp以上800bp以上を用いた例を紹介した。原則として、100~600bpの間のシーケンスは、オフターゲット効果を制限することが好ましいが、1000bpまでのシーケンスは良好な結果を22に生じる。RNAiに関する1つの質問は、この技術を通じて達成できるノックダウンの持続時間です。各段階での現象は終点であったため、この問題について、提示された結果に基づいてコメントすることはできません。しかし、RNAi効果は一般的に比較的長生きしており、濃度が高いほど長持ちするノックダウン20につながることが以前に指摘されている。
この技術の1つの制限は、それが他の生物よりも一部の生物のためにより良く働くということです、そして、それがどれだけうまく機能するかを予測する直接的な方法はないようです。それにもかかわらず、さまざまな生物の広い範囲のためにうまく働くことがわかった。節足動物の中には、くも膜26、甲殻類27、およびカブトムシ28の成功率が特に高い様々な昆虫が含まれる。さらに複雑なのは、同量のdsRNAを適用したにもかかわらず、表現型重症度の差が個体間でしばしば起こることである。 図2Bに示すように、変動は個人内でも起こり得る。 T.マルモラトゥス 幼虫眼の発達に関与する異なる遺伝子を標的としたRNAi研究では、一部の眼が他の眼よりも深刻な影響を受けていることが頻繁にわかりました。この現象は、眼クラスターの比較的密度の高い組織に関連している可能性があり、dsRNAはユニットの一部に到達する可能性が高い。
RNAi実験を成功させるためには、標的遺伝子に対して複数のパラメータを最適化することが重要です。例えば、dsRNAの濃度および標的遺伝子の長さは、結果20に強く影響を与えることができる。もう一つの重要なパラメータは、このプロセスが生存率に大きな影響を与える可能性があるとして、注射がどのように実行されるかである。胚の場合、胚の中心を標的にすることで最良の結果を得た。十分にレイアウトされたプレートは、1回のセッションで100個以上の胚を注入することを可能にする。幼虫の場合、セグメント間に注射針を挿入することが重要です。これらの注射はより多くのdsRNAを必要とし、幼虫の可用性に基づいて、ここでの注射セットは通常、一度に数匹の動物で構成されていました。すべての注射のために、空気が生物に入るのを防ぐことが重要です。
場合によっては、遺伝子調節ネットワークのフィードバックループと遺伝的冗長性は、一貫したノックダウンにもかかわらず、RNAiのフェノタイプの浸透に影響を与える可能性があります。これは、著名なレンズタンパク質Lens318の非常に成功したノックダウンを伴う幼虫の行動観察に当てはまるようです。qPCRを通じてこれらのノックダウンの高効率を検証したが、関連する型においてかなりの変動が認められた。この結果は、RNAiノックダウンを適切に定量化する必要性を強調しています(オプションの詳細については22を参照してください)。得られたフェノタイプに関する明らかな先行予測がない場合、RNAiのオフターゲット効果を制御する良い方法は、dsRNAの2つの非重複配列を有する同じ遺伝子を標的とし、一般的な型の結果を評価することです。
遺伝子編集技術とは対照的に、RNAiは致死的な遺伝子を研究するための強力なツールでもあり、そうする方法は2つあります。例えば、開発初期の機能喪失が致死的であることが知られている遺伝子の機能的寄与に興味がある場合、そのような遺伝子の機能的調査は、動物が正常に発達し、その後開発中にRNAiを介して遺伝子をノックダウンすることによって達成することができる(すなわち、成人で)。あるいは、完全な機能喪失が致死的であることが知られている遺伝子は、部分的なノックダウンを通じて調べることができ、これはdsRNA濃度の範囲を注入することによって達成することができる。我々の結果のいくつかは、昆虫のキューティクルが過度に柔らかくなると致死的であることが知られているlac2のノックダウンを示しています24.図5に示すlac2 RNAiカブトムシでさえ、実験室外の状態では生き残ることはまずありません。別の致死性遺伝子は、節足動物における様々な器官系における細胞運命指定の基本であり、ショウジョウバエ視覚系29におけるグリアの発達にリンクされている転写因子のコードをカットする。T.マルモラトゥス胚における切断RNAiの経験に基づいて、胚の目の発達(未発表の観察)を完了することができる胚の有益な眼の現象型を呼び起こすことができます。ここで、高用量は、より高い致死率につながるように見えます, 低用量は、観察可能で有益な型をもたらす一方で.
我々のプロトコルは、研究者が図示されているように 、T.marmoratusに関するRNAi実験を追求するために必要なステップをリストアップするだけでなく、一般的に他の生物、特に水生生物にも適用可能である。水生生物の中には、水ノミ のダフニア30 やエビなどの甲殻類内にすでにいくつかの例があります(最近のレビューについては、参照31参照)。水生昆虫の間には、すべての昆虫の多様性の約6%を占めると推定されており、200,000種以上の32種を含むと推定されているため、十分な機会があります。さらに、RNAiは、水生環境33の表面に生息する傾向があるウォーターストライダーに対して既に行われている。ゲノムが存在しない場合は、トランスクリプトームをノボに組み立てることができます。このプロセスが数百ヌクレオチドのコンティグを明らかにしている限り、特定の遺伝子に対するdsRNAを設計することができます。アガロース中の昆虫を固定化するための私たちのプロトコルは、特に柔らかく、可鍛性、水生生物のために、他の手順にも有用であろう。一緒に考えて、RNAiは、他の分子および遺伝的ツールが利用できない場合でも、多様な生物群の遺伝子発現を操作するための強力な技術であり続けています。

特定の遺伝子が多様な形質の進化にどのように寄与するのかという問題は、生物学におけるエキサイティングなトピックです。過去数十年の間に、線虫カエノールハブディティスエレガンス、フルーツフライショウジョウバエメラノガスター、ハウスマウスムスクルス1など、いくつかのモデル生物の発達過程の遺伝的基盤を解剖することに関して多くの進歩が見られました。最近では、クラスター化された定期的に間隔を空けた短いパリンドローム反復(CRISPR)/Cas92のような強力な遺伝子編集技術の発明は、非モデル生物の遺伝コードを変更する能力を提供してきた(例えば33,44参照)。その結果、これまで分子技術を通じてアプローチされていなかった様々な生物の遺伝学的研究が急増しています。私たちの動物界の巨大な多様性を考えると、特定の種にのみ表現される多くの興味深い形質や形質の差異を持つこの進歩は、進化進化生物学(「evo-devo」)関連する研究のためのエキサイティングな時間となっています。しかし、非モデル生物が利用できるゲノム編集技術は、それらが適用できる発達時のポイントに関して比較的制限されており、特定の遺伝子がどのような形質において果たす役割に関連する時間的特性を見分けることは困難である。さらに、トランスジェニック技術は、生存に不可欠でない遺伝子(すなわちノックアウトが致死性をもたらさない)に限定されることが多い。したがって、遺伝子編集技術が普及し始めている一方で、特定の発達時の様々な生物に適用可能で、部分的なノックダウンを促進する効果的な技術が依然として必要とされている(機能の完全な損失ではなく)。ここでは、遺伝子編集に対する相乗的なアプローチとして特に価値のある、やや時代遅れでありながら強力な遺伝子ノックダウン技術5であるRNA干渉(RNAi)に注目を集める。具体的には、必要な分子配列の獲得から卵や幼虫への二本鎖RNA(dsRNA)の注入に成功することまで、この技術の実施を例に示す例として、水生潜水カブトムシへのRNAiの適用を可能にする手順を開発しました。
RNAiベースの遺伝子ノックダウンは、生物の先天的防御機構を利用し、dsRNA分子がウイルスやトランスポゾンなどの核酸配列のサイレンシングを促進する6。簡単に言うと、dsRNAは細胞に取り込み、そこでDicer酵素によって20〜25ヌクレオチドに切断されます。これらの断片は、次に、ガイド鎖を使用して特定の部位で特異的な部位に結合することによって標的mRNAを阻害するRNA誘導性サイレンシング複合体(RISC)の形成を活性化する。このプロセスは最終的にmRNA分解を招き、したがって、それぞれのタンパク質6へのmRNAの翻訳を妨げる。ここで提示されるRNAiベースの遺伝子ノックダウン技術は、したがって、dsRNAの注入に依存しています。動物モデルの場合、この技術はもともとC.エレガンス7とD.メラノガスター8で開発されたが、それ以来、非モデル生物99、1010の強力な機能遺伝ツールとして浮上している。昆虫の中では非常に効果的な性質のため、RNAiは害虫管理11にも適用できる。
RNAiは研究ツールとして、非伝統的な昆虫モデルにおける主要な分子発達経路の機能を調べるために使用されてきました。例えば、小麦粉カブトムシトリボリウムカスタネウム中のRNAiは、特に形状の翼,,12、13、14および目1415、16の発達のために例示されるように、そのカブトムシにおける特定の形質にどれだけ深く保存された遺伝子が寄与するかを決定するのに役立っている。,1316T.カスタネウムの操作の根本となる技術は17でよく説明されており、粘着性のある表面に比較的乾燥した卵と幼虫を固定化する能力に依存しています。しかし、このような固定化は、サンバーストダイビングビートル熱NECNECtus marmoratusのような水生生物の湿った発達形態には不可能である。多くの非伝統的なモデル生物の場合と同様に、それはアノノーテドゲノムを欠いている。ゲノムを持たない生物の遺伝子発現を操作するために、合理的かつ費用対効果の高い第一歩は、トランスクリプトームを生成し、関連するが確立されたモデル生物(この場合は主にトリボリウム(Coleoptera)およびショウジョウバエ遺伝子との配列類似性に基づいて、目的の発現遺伝子の推定ヌクレオチド配列を同定することです。
ここでは、水生生物に対するRNAiの使用方法を実証するために、まず、特定の標的遺伝子配列の同定を可能にするRNA抽出およびトランスクリプトーム生成および集合体のためのプロトコルおよびソフトウェアについて議論する。次に、遺伝子特異的dsRNAを合成するために必要なステップを要約する。続いて、水生環境で卵を注入する方法を説明し、胚の発達を培養するためのインキュベーションプロトコルを実証する。また、アガロースゲルを使用して、注射工程中に幼虫を完全に固定化する方法を示し、様々な手順で一般的に有用であり、様々な節足動物に適用できる技術を示しています。RNAiを異なる発達段階に適用する方法を実証するために、胚中の眼色素沈着遺伝子を 白く 沈黙させた例を挙げる。また、日焼け遺伝子 ラクケース2(lac2)が 第2の幼虫インスター(第3幼虫インスターの幼虫に影響を与える)と第3の幼虫インスター(成人に影響を与える)の両方で沈黙した例を説明する。最後に、dsRNAの濃度が低い注射が部分的なノックダウンにつながることを実証し、これはこの技術が機能喪失が致死的であることが知られている遺伝子にも適用できることを示している。

<table><tbody><tr><td><ストロング>1.RNAの分離およびde novoのトランスクリプトームのアセンブリ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>大学のストックルーム</td><td></td><td>通常、研究機関でローカルに入手可能</td></tr><tr><td>ピペットのヒント</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>のサイズ依存</td><td>他のベンダーからの製品は同様にうまく機能します</td></tr><tr><td>RNeasy脂質組織ミニキット(RNA分離キット)</td><td>Qiagen</td><td>74804</td><td>詳細な特定のプロトコルは、キット</td></tr>の<tr><td>分光光度計(NnanoDrop)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>9836674で</td>提供され、<td>他のモデルも同様にうまく</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>機能します<tr><td>1.2。De novo transcriptome assembly.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BUSCO.v3</td><td>https://busco.ezlab.org/</td><td></td> <td>trasncriptome の完全性を評価するための無料で入手可能なソフトウェアを使用できます。</td></tr><tr><td>CLC Genomics workbench</td><td>Qiagen</td><td>832021</td><td>その他、同等のソフトウェアパッケージも利用可能</td></tr><tr><td>Galaxy workbench</td><td>https://usegalaxy.org/</td><td></td> <td>オープンソースのオンライントランスクリプトームアセンブリ&アノテーションパイプライン</td></tr><tr><td>NCBI BLASTx</td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx</td><td></td><td>オープンソースのオンラインアライメントとアノテーションパイプライン</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2. cDNA合成、クローニング、クローニングMiniprep isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampicillin ナトリウム塩</td><td>Gibco</td><td>11593-027</td><td>他のベンダーの製品は同様に機能します</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>G33-500</td><td>他のベンダーの製品は同様に機能します</td></tr><tr><td>LBブロス</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>他のベンダーの製品も同様に機能します</td></tr><tr><td>Omniscript RT (reverse trasncription) kit</td><td>Qiagen</td><td>205111</td><td>詳細な特定のプロトコルは、キット</td></tr><tr><td>One Shot&trade;TOP10 ケミカルコンピテント大腸菌</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>詳細な特定のプロトコルは、キットの</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td>に付属しています <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875713</td><td>他のベンダーの製品も同様に機能します</td></tr><tr><td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td><td>ThermoFischer</td><td>771471</td><td>詳細な特定のプロトコルは、キット</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>に付属しています28104</td><td>詳細な特定のプロトコルは、キットシェー</td></tr><tr><td>カーインキュベータ</td><td>ーLabnet</td><td>211DS</td>で提供されます <td>他のモデルは、同様によく働く</td></tr><tr><td>でしょう 分光光度計(NnanoDrop)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>9836674</td><td>他のモデルは</td></tr><tr>、PCR <td>BioRad</td><td>T100</td>のための同様によく働くサーマル<td>サイクラー</td><td>他のモデルは、同様によく働くでしょう</td></tr><tr><td>TOPO TAクローニングキット</td><td>Invitrogen</td><td>1845069</td><td>詳細な特定のプロトコルは、キット</td></tr><tr><td>X-Gal</td>ソリューション<td>Thermo Scientific</td><td>R0941</td>で提供されます <td>他のベンダーからの製品は、同様にうまく</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>機能します<tr><td>2.2 PCR増幅&in vitro dsRNA合成</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sofa Fisher</td><td>Scientific</td><td>accuSpin Micro 17R</td><td>他のモデルは同様によく働く</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー科学</td><td>A4094</td><td>他のベンダーからの製品は同様によく働くだろう</td></tr><tr><td>FastTaq DNAポリメラーゼ、dNTPack</td><td>ロシュ</td><td>13873432</td><td>このキットには、PCR</td></tr><tr><td>MEGAclear Transcriiptionクリーンアップキット</td>に必要なすべての試薬が含まれています <td>ThermoFischer</td><td>AM1908</td><td>詳細な特定のプロトコルはキット</td></tr><tr><td>に付属していますMEGAscript T7 転写キット</td><td>ThermoFischer</td><td>AM1334</td><td>詳細な特定のプロトコルは、キットの</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>で提供されます フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9932</td><td>他のベンダーからの製品は、同様にうまく機能します</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>詳細な特定のプロトコルは、キットの</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP333-500で提供されます</td><td>3Mワーキングソリューション</td></tr><tr><td>分光光度計(NnanoDrop)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>9836674</td><td>他のモデルも同様にうまく</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>機能します<tr><td>3。dsRNA注射のための初期段階のT. marmoratus胚の収集と準備</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>9012-36-6</td><td>他のベンダーからの製品は、</td></tr><tr><td>蒸留水</td>と同様に機能します <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>9180</td><td>他のベンダーからの製品は、同様によく</td></tr><tr><td>動作します 鉗子(デュモン#4生物学)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11242-40</td><td>他のベンダーからの製品は、ガラス</td></tr><tr><td>キャビティ皿(3ウェルディッシュ)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-243-43</td>他の<td>ベンダーからの製品は、同様にうまく機能します</td></tr>電子レンジ<tr><td></td><td>ウェルビルト</td><td>ターンテーブル他の</td><td>モデルは、同様にうまく動作します</td></tr>自然な<tr><td>髪の絵筆</td><td>アマゾン</td><td></td><td>任意の細かいブラシは</td></tr><tr><td>、P1000マイクロピペッター</td><td>ギルソン</td><td>を行いますF123602</td><td>他のモデルは同様にうまく機能します</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875713</td><td>他のベンダーからの製品は同様にうまく機能します</td></tr><tr><td>ステレオ顕微鏡</td><td>ミクロソコープセントラル</td><td>10446293</td><td>優れた実体顕微鏡は転送</td></tr><tr><td>ピペット</td>を作動させます <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>21-200-109</td><td>他のベンダーからの製品は同様にうまく機能します</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>digital camera</td><td>Edmund optics (Qimaging)</td><td>Retiga 2000R</td><td>他のモデルは同様にうまく機能します</td></tr><tr><td>エタ</td><td>ノール Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td>他のベンダーからの製品は同様にうまく機能します</td></tr><tr><td>食品染料</td><td>クローガー</td><td></td><td>利用可能な食品染料はどれでも機能します作業 細かい</td></tr><tr><td>湿度チャンバー</td><td></td><td></td><td>蓋付きのプラスチックの箱を取り、70%エタノールで滅菌し、イン</td></tr><tr><td>キュベーター</td>を乾燥させます <td>Labline</td><td>203</td><td>他のモデルは、同様にうまく機能します</td></tr><tr><td>注入バッファー</td><td></td><td></td><td>参照#22に続く1mL用に準備されました #22: ミックス10 & マイクロ;L of 0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液、100 μ;0.5 M塩化カリウム溶液のL、100 & micro;食用色素のLと790&micro;Lの二重蒸留水。4°Cで保管します。</td></tr><tr><td>細胞内マイクロインジェクションシステム(ピコスプリッツァー)</td><td>パー</td><td>カー052-0500-900</td><td>現在、モデルIIIが利用可能ですが、古いモデルも機能します</td></tr><tr><td>マイクロニードルホルダー</td><td>A-Mシステム</td><td>672441</td><td>他の製品も同様にうまく機能します</td></tr><tr><td>マイクロインジェクションニードル(1.2 mm x 0.68 mm、4インチ)</td><td>AMシステム</td><td>603000</td><td>他のモデルも同様にうまく機能します</td></tr> マイクロ<tr><td>マニピュレーター</td><td>ドラモンドサイエンティフィ</td>ック<td>カンパニー3-000-024-R</td><td>任意の品質のマイクロマニピュレーターは、</td></tr><tr>1Mの作業溶液の10mLを作るために、<td>リン酸ナトリウムの</td>粉末の10 mLに動作しますフィ<td>ッシャー科学</td><td>7558-80-7</td><td>10 mLの作業溶液を作るには:10 mLの二重蒸留水にリン酸ナトリウム粉末の1.2 gを追加し、透明な溶液が得られるまで混合</td></tr>します <tr><td>P-1000マイクロピペットプーラー</td><td>サッター機器</td><td>P-1000</td><td>プーラー設定:ヒート575、プル60、速度75遅延110、圧力700。</td></tr><tr><td>P10マイクロピペッター</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td>他のモデルも同様に機能します</td></tr><tr><td>P1000マイクロピペッター</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>他のモデルも同様に機能します</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td> フィ<td>ッシャー サイエンティフィック</td><td>7447-40-7</td><td>100 mL の 0.5 M 塩化カリウム溶液を作るには: 3.73 g の塩化カリウム結晶を 100 mL の二重蒸留水に加え、透明な溶液が得られるまで混合します。</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム緩衝液(0.1M)</td><td></td><td></td><td>この緩衝液の0.1 Mを10 mL作製するには:8.5 mLの1 Mリン酸ナトリウム二塩基性溶液と1.5 mLの1 Mリン酸ナトリウム溶液を混合します。pHメーターでpHを確認し、室温でpH7.6に調整します。</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>フィッシャー科学</td><td>7558-79-4</td><td>10 mLの1 M作業溶液を作るには:1.42 gのリン酸ナトリウム二塩基性粉末を10 mLの二重蒸留水に加え、透明な溶液が得られるまで混合</td></tr>します <tr><td>実体顕微鏡</td><td>Microsocope Central</td><td>10446293</td><td>優れた実体顕微鏡は機能します</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>5。dsRNA注射のためのT. marmoratus幼虫の準備</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>9012-36-6</td><td>他のベンダーからの製品は同様によく働くでしょう</td></tr><tr><td>鉗子 (デュモン#4生物学)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11242-40</td><td>他のベンダーからの製品は同様にうまく機能するでしょう</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875713</td><td>他のベンダーの製品は、同様にうまく</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>機能します<tr><td>6. T. marmoratus 幼虫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>注入バッファー (10x)</td><td></td><td></td> <td>セクション 4</td></tr><tr><td>マイクロインジェクション針 (1.2 mm x 0.68 mm、4 インチ)</td> <td>A-M Systems</td><td>603000</td><td>他のモデルも同様にうまく機能します</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>A-M システム</td><td>603000</td><td>他のモデルは同様にうまく機能します</td></tr><tr><td>マイクロニードルホルダー</td><td>AMシステム</td><td>672441</td><td>他の製品は同様にうまく機能します</td></tr><tr><td>P-1000 マイクロピペット プーラー</td><td>サッター機器</td><td>P-1000</td><td>プーラー設定:熱 575、プル 60、速度 75、遅延 110、圧力 700。</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Microsocope Central</td><td>10446293</td><td>どんな良い実体顕微鏡でも動作します</td></tr></tbody></table>

特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのrna干渉

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA干渉(RNAi)は、mRNA分解による遺伝子発現の標的化低減を可能にする強力な技術であり続けています。この技術は、多種多様な生物に適用され、種が豊富なコレオプテラ(カブトムシ)で非常に効率的です。ここでは、この技術を新しい生物で開発するために必要なステップを要約し、水生潜水カブトムシ サーネクトゥス・マルモラトゥス の異なる発達段階への応用を説明する。標的遺伝子配列は、既知のゲノミクスまたはデノボとの近親的な親戚に対する転写体の組み立てを通じて、費用対効果の高い方法で得ることができる。遺伝子クローニング候補は、特定のクローニングベクター(pCR4-TOPOプラスミド)を利用し、単一の共通プライマーを使用して任意の遺伝子に対して二本鎖RNA(dsRNA)を合成することを可能にする。合成されたdsRNAは、早期発達過程のために胚に注入するか、後の発達過程のために幼虫に注入することができる。次に、アガロースでの固定化を用いて水生幼虫にRNAiを注入する方法を説明する。この手法を実証するために、RNAi実験のいくつかの例を提供し、予測された型を用いて特定のノックダウンを生成する。具体的には、日焼け遺伝子 ラッカゼ2 用RNAiは、幼虫と成人の両方でキューティクルの明るさを引き起こし、眼色素沈着遺伝子 白 に対するRNAiは眼管における色素沈着の明るさ/欠如を生じる。さらに、主要なレンズタンパク質のノックダウンは、光学的欠陥と獲物を狩る能力の低下を伴う幼虫につながります。これらの結果を組み合わせることで、転写データベースのみを有する生物における形態学的パターニングおよび行動特性の両方を調査するためのツールとしてRNAiの力を例示する。

上述のプロトコルを用いて、サンバーストダイビングビートルT.marmoratusのさまざまな発達段階lac2で、白、ラクケース2、Lens3(表1)という3つの異なる遺伝子を倒しました。 Lens3胚発生の非常に初期の段階でdsRNAを注入することによってT.marmoratusでRNAiを行った(図1A)。一部の胚はプロセスを生き残らず壊死性(図1B)に変わるので、残りの胚を健康に保つために除去する必要があります。ここで例示されるのは、白色遺伝子に対するdsRNAの注射である。この遺伝子は、眼顔料23の前駆体の取り込みおよび保存に関与する3種のATP結合カセット(ABC)トランスポーターの1つとしてショウジョウバエによく知られている。したがって、その機能の喪失は、未色素体の白目表現型をもたらす。我々の結果は、T.マルモラトゥス胚における直交白遺伝子を標的としたdsRNAの注射が、新たに出現した幼虫における眼色素沈着の喪失につながることを示している。この場合、野生型の幼虫は大きく色素化された眼が特徴であり、白色のRNAiノックダウンは様々なレベルの減少、さらには眼色素の完全な排除につながる。全体として、生存した胚の34%において少なくとも眼の着色がいくらか減少することを観察した(n=35)。図2Aは、対照個人と個人をわずかに明るい眼色と比較する。図2Bは、より多くの腹側の目(Eyes 2–5)が完全に色素していないのに対し、後眼はまだ色素沈着を示す個体におけるより深刻なノックダウンを示している。これらの違いは、ノックダウンの効率が地域的にどのように変化するかを強調し、おそらく緻密な組織におけるdsRNA浸透の有効性の違いに関連している。別の個体は、全眼における本質的に完全な顔料損失を示す(図2C)。
T.marmoratusの幼虫期でRNAiがどの程度うまく機能するかを調べるため、3番目の星に溶け込む数日前にタンニック遺伝子lac2を標的としたdsRNAを第2のインスター幼虫に注入し、第3インスター幼虫の切り口着色に及ぼす影響を評価した。Lac2は、タンパク質を酸化的にコンジュゲートして不溶性、硬く、暗くするフェロロキシダーゼの一種です。小麦粉カブトムシT.カスタネウムのノックダウンは、低用量で明るい色の個体につながることを示しているが、高用量24で致死的であると考えられている。図4は、この治療が明るい色のサンバーストダイビングカブトムシの幼虫にもつながることを示しています。具体的には、この実験では、生き残った注射幼虫(n=12)の75%が色素沈着を減少させた(対照群の0%と比較)。図4Aは比較的軽度の脱色症を有する個体を示し、図4Cは、キューティクルの暗い着色がほとんど存在しないT.マルモラトゥス幼虫の頭部を示している。これらの幼虫に典型的な中心暗いパターン形成に対しては特に色素沈着が顕著であったが、このパターンは対照注入された個体ではっきりと見えるままであった(図4B)。また、図4Dに示すように、尾気管の明るさが観察された。第3のインスター幼虫にlac2 dsRNAを注入した場合、より軽い成人個体が得られた(図5)。ノックダウンカブトムシの翼は、その異常な柔らかさのために、やや変形していることに注意してください。
形態形質の変化に加えて、RNAiを使用して行動に影響を与える遺伝子を標的にすることが可能である。これを実証するために、主要レンズタンパク質コード遺伝子 Lens318に対してRNAiを行い、それを第2のインスター幼虫に注入して、第3のインスター幼虫の目の光学特性に影響を与えた。ここで観察されるレンズに対する影響は、この転移で T.marmoratus 幼虫の目が大きな眼の成長を受け、レンズ25の大きな光学的変化も伴うためである可能性が高い。この実験におけるRNAiノックダウンは高効率であった。qPCR による検証は、成功率が 100% でした。試験された13人の個体のうち、12人は制御個人の発現レベルの10%未満に倒され、残りの個体は制御レベルの17%の発現レベルを有する(未発表の観察)。表現型レベルでは、非常に近い距離から獲物に繰り返し接近したが、一貫してオーバーショットした個人の場合、 図6 に示すように、重度の障害を持つ個人または獲物捕獲ができない個体は一部しかいなかった。
表1:白、lac2、およびLens3タンパク質のプライマー配列およびアンプリコン。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61477/Table1.xlsx" target="_blank">こちらの表をダウンロードしてください。</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig01.jpg"> 図1:胚注射の図。(A)デコリオネート胚がアガロースプレートに並び、dsRNAと食品染料含有注射緩衝液を充填したマイクロ注射針を使用して中心付近に注入した。スケールバーは500 μmを表します。(B) より厳しいノックダウンを持つ個人。注入された胚は湿度室に保管され、毎日モニタリングされて表型を採点し、死んだ個体(茶色に変わる)を取り除く。スケールバーは5 mmを表<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig01large.jpg" target="_blank">します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig02.jpg"> 図2:白に対してdsRNAを注射した完全に発達した胚の例。 (A)眼色素沈着の減少を伴う個体(左)とコントロール注入個体(右)の比較。E1–E6は目1~6を参照する。(B) より深刻なノックダウン表現型を持つ個人で、クラスター内の目の一部が他のものよりもノックダウンによって深刻な影響を受ける場合があることを示している。(C) 眼色素沈着のほぼ完全な喪失を有する個人。スケールバーは200 μmを表します。パネル B と C は同じスケールで表されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig03.jpg"> 図3:幼虫注射の図。(A)2%アガロースに埋め込んで、尾の尖塔を透明にして固定化した幼虫が何匹かいた。(B)注射液を含むマイクロ電極は、その先端が2つのセグメント間の微細膜を貫通できるように配置した。(C)注射後の注射部位で見える青色注射染料。スケールバーは1cmを表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig04.jpg"> 図4:ラクケース2用RNAiを第2のインスター幼虫に適用し、第3のインスター幼虫におけるキューティクル着色を減少させる。(A) 対照注入個体(上)と比較した場合のlac2 RNAi個体(下)における着色の比較的軽度の損失。スケールバーは、ヘッドの中心にB特徴的な暗い色のパターンを示すコントロール個人の5mm.(B)ヘッドを表します。(C) lac2の比較的厳しいノックダウンにより、頭部の中心色付けがほぼ完全に失われる。(D) 対照注入個体(上)と比較した場合のLAC2 RNAi個体(下)の主要尾翼の着色の損失。B\u2012D の縮尺バーは 1 mm を表<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig04large.jpg" target="_blank">します</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig05.jpg"> 図5: ラクケース2 用RNAiを第3のインスター幼虫に適用し、成人におけるキューティクル着色を減少させる。ノックダウン個人(左)は、コントロール(右)と比較すると非常に柔らかいエリトラも特徴です。スケールバーは5 mmを表 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig05large.jpg" target="_blank">します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig06.jpg"> 図6:獲物捕獲の欠乏につながる主要なレンズタンパク質のノックダウン。(A -C)RNAiを通じて光学的な欠陥が誘発されたサンバーストダイビングビートル幼虫が獲物(蚊の幼虫)を捕獲できなかった3つの例。代表的な静止画は、特徴的な獲物捕獲のビデオ録画から選択された。(D) コントロール幼虫捕食。すべてのスケールバーは2 cm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig06large.jpg" target="_blank">を表</a>します。

RNA干渉は、特定の発生段階で遺伝子発現を操作するための広く適用可能で強力な技術です。ここでは、この手法を、遺伝子配列の獲得から、構造や行動に影響を与える遺伝子のノックダウンまで、水生潜用カブトムシ の熱NECTTus marmoratusに実装するために必要なステップを説明する。

特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

遺伝子編集が非モデル生物の分子遺伝学を研究するために普及しているとしても、RNAiは依然として強力な相乗ツールです。この手法の主な利点は、異なる発達段階に適用できることです。さらに、部分的なノックダウンを使用して、これらの全遺伝子を研究することができます。手順の成功は、DSRの注入と最小限の害を持つことに依存しています.これは練習を必要とするので、それを正しくするために数回の試みが必要な場合は落胆しないでください。マイクロインジェクションのために初期段階の胚を準備するには、まず沸騰した20%アガロースを小さなペトリ皿に注ぎ、固化する前に液体アガロースの表面に3つの1〜2ミリメートル幅のプラスチックチューブを置きます。アガロースが固まったら、一対の鈍い鉗子を使用してチューブを取り除き、500マイクロリットルのオートクレーブ蒸留水で得られたインデントをカバーします。回収容器が準備ができたら、細かい自然なヘアペイントブラシを使用して、カブトムシの巣の場所から5つの8時間のT.marmoratus胚を、ステレオ顕微鏡の下でオートクレーブ蒸留水で満たされたガラスキャビティ皿に移します。顕微鏡と細かい解剖鉗子を使用して、両側から各胚の絨毛を把握し、胚が組織から穏やかにスライドすることを可能にする絨毛を開いて裂く。収集されたすべての胚から両方の絨毛膜層を除去した後、慎重に準備されたアガロースプレートの溝にガラスキャビティ皿から胚を転送するために、絵筆を使用しています。遺伝子特異的な二本鎖RNAを初期段階の胚に注入するには、まずニードルプラーにマイクロインジェクションニードルを調製し、ステレオ顕微鏡を使用して鉗子を見つけて各先端を鋭い端に折ります。精製されたストックの目的の二本鎖RNAを氷の上に投げた後、得られた溶液に10X注入バッファーの1マイクロリットルを加え、二重蒸留水を使用して溶液のビニール体積を10マイクロリットルに持ち込みます。P10ピペットを使用して、準備されたマイクロインジェクションニードルの1つを作業用の二本鎖RNA溶液で埋め戻し、圧力放出技術を利用するマイクロインジェクションシステムに接続されたマイクロニードルホルダーに針をロードします。マイクロインジェクションシステムと加圧空気供給をオンにし、マイクロインジェクションシステムのマイクロバルブを使用して、注入圧力を1平方インチあたり15ポンドの圧力に設定し、時間調整ノブを使用して注入時間を秒に設定します。注射針を較正するために、T.marmoratus胚用の空気中に注入する際に針の先端に形成される流体気泡の体積を評価するために、100〜200ミクロンの最適な気泡サイズを使用する。注射針は、最適な気泡が約3秒の注入持続時間で平方インチあたり15ポンドの圧力で達成できるならば良質である。針をセットアップする準備ができたら、針が45〜60度の角度で胚に近づくような胚のアガロースプレートに針を整列させます。マイクロマニピュレータを使用して、先端が1つの胚の真ん中の表面に触れるまでマイクロニードルをゆっくりと動かし、針を慎重に前方に動かして、胚の表面を突き刺すだけです。針が胚の中に入ったら、マイクロインジェクター注射ボタンを慎重に押して、二本鎖RNAの1〜2ナノリットルを胚に送り込みます。すべてのRNAが送達されると、胚が破裂することなく、胚から針をゆっくりと引き込みます。正常に注入された胚は、注射部位における着色スポットの存在によって同定することができる。すべての胚が慎重に注入されたとき、14時間の明るい10時間の暗いサイクルに4〜5日間設定された摂氏25度のインキュベーターで、湿度室に皿を置きます。ステレオ顕微鏡で毎日胚の発達の進行を監視し、形態学的に目に見えるノックダウン型を特定します。高解像度のデジタル カメラを使用して開発プロセスを文書化する。死んだ胚を取り除き、毎日アガロースプレートの水を補充して、潜伏期間中に他の生き残った胚への乾燥と微生物汚染の広がりを避けます。幼虫を採取する前に、まず60〜70度摂氏2%液体アガロースを小さなペトリ皿に加えます。アガロースが固まった場合、幼虫ごとに1つの浅いグループをアガロースに注入し、幼虫培養カップから静かに水を排出するために鈍い鉗子を使用します。麻酔の後、柔らかいエンド鉗子を使用して、首と体が、アガロース表面の上に位置する尾と固定板に幼虫を慎重に置くために鉗子。すべての幼虫が配置されたとき、各溶岩を、まだ液体であるが危険なほど熱くないアガロースの厚い層で覆い、必要に応じて誤って覆われた物語を解放する。二本鎖RNAマイクロインジェクションのために、遺伝子特異的な二本鎖RNA作動溶液を有するマイクロニードルを、実証されたとおりにロードする。手動で制御されたマイクロインジェクション注射器のプランジャーを再ドラッグし、マイクロインジェクションシステムに針をロードします。固定化された幼虫をステレオ顕微鏡の下に配置し、注射部位が比較的平坦な角度でマイクロ注射針の軌跡に合わせられる。マイクロマニピュレータを使用して、針先を幼虫に慎重に移動し、注射器にゆっくりと慎重に圧力をかけ、必要に応じて針内の着色注入液の動きに応じて注入圧力を調整します。すべてのRNAが注入されると、柔らかい鉗子を使用してアガロースから幼虫を解放し、幼虫を室温水の新しい容器に25〜28度の摂氏25~28度、14時間の明るい10時間の暗いサイクルに入れます。この代表的な分析では、サンバーストダイビングカブトムシT.marmoratusのさまざまな異なる発達段階で3つの異なる遺伝子が倒されました。RNA干渉は、胚発生の非常に初期の段階で二本鎖RNAを注入することによって実証されるように行われる。胚の一部は、プロセスを生き残り、壊死に変わります。これらの画像では、わずかに明るい目の色を持つ個人および個人を制御することが観察できる。この個体では、クラスターのより多くの腹側の嘘が完全に色素されていないがより深刻なノックダウンであるが、同盟国はまだいくつかの色素沈着を示すことができる。ここでは、全眼において本質的に完全な顔料損失を有する別の個体の例が示されている。Lac2が幼虫で倒された場合、色素性のキューティクルが少なくなり、組織の異常な柔らかさのために翼がやや変形した軽い成人の個体も得られた。注入された動物を日常的に注意深く観察し、死んだ個体を直ちに取り除くことを強く見てください。この技術の力は、多くの異なる生物の遺伝子に適用することができることである。この技術は、進化進化生物学にも広く、またうまく応用されています。

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マイクロインジェクションは受精ゼブラフィッシュの胚への外来物質を導入するための十分に確立し、効果的な方法です。ここで、我々は、ゼブラフィッシュでのmRNAの過剰発現、およびモルフォリノオリゴヌクレオチドの遺伝子のノックダウンの研究を行うための堅牢なマイクロインジェクション法を示しています。...

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

RNA干渉は、遺伝子の機能を解析することは非常に効果的であることが証明されています...

dsRNAをインジェクションによるRNAiの干渉にショウジョウバエ胚

RNA干渉（RNAi）は、遺伝子ノックダウン技術は、 コクヌスト研究の中核にあるベース。ここでは、 コクヌストにおける当社の幼虫のRNAi技術の概要を説明します。幼虫RNAiは、研究者が多様な文脈で遺伝子機能を研究することができ、機能喪失型の表現型への迅速なアクセスを提供する単純な、しかし強力な技術である。...

レッドフラワービートル幼虫RNA干渉、コクヌストモドキ

RNA干渉（RNAi）は、遺伝子の機能を明らかにするための非常に貴重なツールです。しかし、成人前の段階でRNAiを使用して遺伝子を標的とする能力は、主要なヒトマラリアベクターであるAnopheles...

RNAiのトリガ配信へ<em&gt;ハマダラカ</em&gt;蛹

トランスジェニック操作およびゲノムの編集は、機能的遺伝子とシス -regulatory要素の役割をテストするために重要です。ここでは、ゲノム（Tol2の媒介蛍光レポーター導入遺伝子構築物を含む、TALENs、およびCRISPRs）の変更を生成するための詳細なマイクロインジェクションプロトコルが緊急モデルの魚のために提示され、イトヨ。...

Threespineトゲウオにおける遺伝子導入およびゲノム編集のためのマイクロインジェクション

ここでは、研究室で（D. maculatus）Dermestes maculatus、中間胚芽カブトムシを飼育するためのプロトコルを提示します。我々はまた、この種における遺伝子機能を研究するために胚の表現型を解析するための胚および親のRNAiのためのプロトコルとメソッドを共有しています。...

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、 Dermestes maculatus

このビデオの記事では、体系的かつ効率的に多くの無脊椎動物の胚では、複雑なシグナル伝達経路および制御ネットワークの構成要素を特徴付けるために使用することができるin vivoでの方法論に簡単な詳細を示します。...

シンプルの力：ウニ胚として<em&gt; in vivoで</em&gt;複雑な細胞間シグナル伝達ネットワークの相互作用を研究するための発達モデル

ここでは、振動情報の光遺伝学的制御による細胞間伝達を分析および遺伝子発現のモニタリング...

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

ここでは、 ナソニアビトリペンシス での効率的なプパルおよび成人注射を胚微小注射の代替手段として説明し、RNA干渉(RNAi)またはCRISPR/Cas9ゲノム編集によるRNAサイレンシングまたは遺伝子ノックアウトのいずれかを使用して目的の遺伝子の機能解析を可能にする。...

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

私たちは、青い尾のダムを使用して、オーダーオドナタ(トンボとダムリー)の昆虫に対するエレクトロポレーション媒介性RNA干渉(イシュヌラ・セネガルシス:コエナゴロ科:ツィゴプテラ)とパイドスキマートンボ(プセミソナタ:リベルリドエ:アネリスラプテ)を使用して詳細なプロトコルを提供します。...

オドナタにおけるエレクトロポレーション媒介性RNA干渉法

学ぶ水生カブトムシThermonectus marmoratusにおけるRNA干渉技術。dsRNAマイクロインジェクションによる遺伝子ノックダウンで、構造と行動に関する遺伝子機能を発生段階別に研究する方法です。

特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉

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