特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉
2020年5月29日
RNA干渉は、特定の発生段階で遺伝子発現を操作するための広く適用可能で強力な技術です。ここでは、この手法を、遺伝子配列の獲得から、構造や行動に影響を与える遺伝子のノックダウンまで、水生潜用カブトムシ の熱NECTTus marmoratusに実装するために必要なステップを説明する。
遺伝子編集が非モデル生物の分子遺伝学を研究するために普及しているとしても、RNAiは依然として強力な相乗ツールです。この手法の主な利点は、異なる発達段階に適用できることです。さらに、部分的なノックダウンを使用して、これらの全遺伝子を研究することができます。
手順の成功は、DSRの注入と最小限の害を持つことに依存しています.これは練習を必要とするので、それを正しくするために数回の試みが必要な場合は落胆しないでください。マイクロインジェクションのために初期段階の胚を準備するには、まず沸騰した20%アガロースを小さなペトリ皿に注ぎ、固化する前に液体アガロースの表面に3つの1〜2ミリメートル幅のプラスチックチューブを置きます。
アガロースが固まったら、一対の鈍い鉗子を使用してチューブを取り除き、500マイクロリットルのオートクレーブ蒸留水で得られたインデントをカバーします。回収容器が準備ができたら、細かい自然なヘアペイントブラシを使用して、カブトムシの巣の場所から5つの8時間のT.marmoratus胚を、ステレオ顕微鏡の下でオートクレーブ蒸留水で満たされたガラスキャビティ皿に移します。顕微鏡と細かい解剖鉗子を使用して、両側から各胚の絨毛を把握し、胚が組織から穏やかにスライドすることを可能にする絨毛を開いて裂く。
収集されたすべての胚から両方の絨毛膜層を除去した後、慎重に準備されたアガロースプレートの溝にガラスキャビティ皿から胚を転送するために、絵筆を使用しています。遺伝子特異的な二本鎖RNAを初期段階の胚に注入するには、まずニードルプラーにマイクロインジェクションニードルを調製し、ステレオ顕微鏡を使用して鉗子を見つけて各先端を鋭い端に折ります。精製されたストックの目的の二本鎖RNAを氷の上に投げた後、得られた溶液に10X注入バッファーの1マイクロリットルを加え、二重蒸留水を使用して溶液のビニール体積を10マイクロリットルに持ち込みます。
P10ピペットを使用して、準備されたマイクロインジェクションニードルの1つを作業用の二本鎖RNA溶液で埋め戻し、圧力放出技術を利用するマイクロインジェクションシステムに接続されたマイクロニードルホルダーに針をロードします。マイクロインジェクションシステムと加圧空気供給をオンにし、マイクロインジェクションシステムのマイクロバルブを使用して、注入圧力を1平方インチあたり15ポンドの圧力に設定し、時間調整ノブを使用して注入時間を秒に設定します。注射針を較正するために、T.marmoratus胚用の空気中に注入する際に針の先端に形成される流体気泡の体積を評価するために、100〜200ミクロンの最適な気泡サイズを使用する。
注射針は、最適な気泡が約3秒の注入持続時間で平方インチあたり15ポンドの圧力で達成できるならば良質である。針をセットアップする準備ができたら、針が45〜60度の角度で胚に近づくような胚のアガロースプレートに針を整列させます。マイクロマニピュレータを使用して、先端が1つの胚の真ん中の表面に触れるまでマイクロニードルをゆっくりと動かし、針を慎重に前方に動かして、胚の表面を突き刺すだけです。
針が胚の中に入ったら、マイクロインジェクター注射ボタンを慎重に押して、二本鎖RNAの1〜2ナノリットルを胚に送り込みます。すべてのRNAが送達されると、胚が破裂することなく、胚から針をゆっくりと引き込みます。正常に注入された胚は、注射部位における着色スポットの存在によって同定することができる。
すべての胚が慎重に注入されたとき、14時間の明るい10時間の暗いサイクルに4〜5日間設定された摂氏25度のインキュベーターで、湿度室に皿を置きます。ステレオ顕微鏡で毎日胚の発達の進行を監視し、形態学的に目に見えるノックダウン型を特定します。高解像度のデジタル カメラを使用して開発プロセスを文書化する。
死んだ胚を取り除き、毎日アガロースプレートの水を補充して、潜伏期間中に他の生き残った胚への乾燥と微生物汚染の広がりを避けます。幼虫を採取する前に、まず60〜70度摂氏2%液体アガロースを小さなペトリ皿に加えます。アガロースが固まった場合、幼虫ごとに1つの浅いグループをアガロースに注入し、幼虫培養カップから静かに水を排出するために鈍い鉗子を使用します。
麻酔の後、柔らかいエンド鉗子を使用して、首と体が、アガロース表面の上に位置する尾と固定板に幼虫を慎重に置くために鉗子。すべての幼虫が配置されたとき、各溶岩を、まだ液体であるが危険なほど熱くないアガロースの厚い層で覆い、必要に応じて誤って覆われた物語を解放する。二本鎖RNAマイクロインジェクションのために、遺伝子特異的な二本鎖RNA作動溶液を有するマイクロニードルを、実証されたとおりにロードする。
手動で制御されたマイクロインジェクション注射器のプランジャーを再ドラッグし、マイクロインジェクションシステムに針をロードします。固定化された幼虫をステレオ顕微鏡の下に配置し、注射部位が比較的平坦な角度でマイクロ注射針の軌跡に合わせられる。マイクロマニピュレータを使用して、針先を幼虫に慎重に移動し、注射器にゆっくりと慎重に圧力をかけ、必要に応じて針内の着色注入液の動きに応じて注入圧力を調整します。
すべてのRNAが注入されると、柔らかい鉗子を使用してアガロースから幼虫を解放し、幼虫を室温水の新しい容器に25〜28度の摂氏25~28度、14時間の明るい10時間の暗いサイクルに入れます。この代表的な分析では、サンバーストダイビングカブトムシT.marmoratusのさまざまな異なる発達段階で3つの異なる遺伝子が倒されました。RNA干渉は、胚発生の非常に初期の段階で二本鎖RNAを注入することによって実証されるように行われる。
胚の一部は、プロセスを生き残り、壊死に変わります。これらの画像では、わずかに明るい目の色を持つ個人および個人を制御することが観察できる。この個体では、クラスターのより多くの腹側の嘘が完全に色素されていないがより深刻なノックダウンであるが、同盟国はまだいくつかの色素沈着を示すことができる。
ここでは、全眼において本質的に完全な顔料損失を有する別の個体の例が示されている。Lac2が幼虫で倒された場合、色素性のキューティクルが少なくなり、組織の異常な柔らかさのために翼がやや変形した軽い成人の個体も得られた。注入された動物を日常的に注意深く観察し、死んだ個体を直ちに取り除くことを強く見てください。
この技術の力は、多くの異なる生物の遺伝子に適用することができることである。この技術は、進化進化生物学にも広く、またうまく応用されています。
概要
この記事では、水生潜水甲虫であるThermonectus marmoratusにおけるRNA干渉（RNAi）の使用について詳しく説明し、様々な発育段階におけるその応用を強調します。この手順は、二本鎖RNAの調製と注入を含み、遺伝子ノックダウンを達成し、構造と行動に関連する遺伝子機能の研究を可能にします。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 遺伝学
- 発生生物学
背景
- RNA干渉は遺伝子発現操作の強力な技術です。
- 生物の異なる発育段階に適用できます。
- 遺伝子の部分的ノックダウンにより機能研究が可能になります。
- 成功は精密なマイクロインジェクション技術に依存します。
研究の目的
- T. marmoratusにおけるRNAi技術を実証すること。
- 遺伝子ノックダウンの手順を段階的に説明すること。
- 甲虫の構造と行動における遺伝子操作の影響を探ること。
使用された方法
- マイクロインジェクション用に胚を準備すること。
- 遺伝子特異的な二本鎖RNAの注入。
- 胚の発育と表現型の変化のモニタリング。
- 高解像度イメージングを用いた結果の記録。
主な結果
- 注入部位の色付きの斑点で確認された成功した注入。
- ノックダウン表現型のモニタリングによる胚の発育。
- 様々な発育段階で3つの異なる遺伝子を標的としました。
- 非モデル生物におけるRNAiの有効性を示しました。
結論
- RNAiはT. marmoratusにおける遺伝子機能の研究に有効な方法です。
- 成功した遺伝子ノックダウンには慎重な技術が不可欠です。
- この方法は遺伝学的研究のために他の非モデル生物にも適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
RNA interference (RNAi) enables targeted gene knockdown across developmental stages in non-model organisms, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The technique provides quantitative phenotypic readouts that help prioritize therapeutic hypotheses and reduce biological uncertainty before lead identification. Its applicability to organisms with limited genomic resources expands the scope of preclinical models for pathway clarification and functional genomics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function through stage-specific knockdown to clarify target roles in morphological and behavioral pathways.
- Operational Value: Uses cost-effective transcriptome assembly and common primer systems to generate dsRNA for any gene, reducing target validation timelines.
- Predictive Value: Generates observable phenotypes (e.g., cuticle lightening, eye depigmentation, hunting deficiency) that link genotype to function, supporting go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable phenotypic outputs (e.g., pigment loss, optical defects) suitable for high-content screening workflows.
- Reproducibility: Relies on standardized microinjection protocols and immobilization techniques to ensure consistent dsRNA delivery across developmental stages.
- Scalability: Compatible with embryo and larval injection, enabling parallel testing of multiple genes across time points.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Phenotypic readouts in larval hunting behavior and cuticle formation provide mechanistic insights applicable to neurodevelopmental and structural disorder models.
- Translational Continuity: Supports progression from gene knockdown in invertebrate models to validation in vertebrate systems through conserved pathways (e.g., pigmentation, lens development).
- Risk Mitigation: Partial knockdown capability allows titration of gene suppression to model hypomorphic alleles and assess therapeutic windows.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, particularly for genes involved in development, pigmentation, and sensory function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven gene interrogation via temporal knockdown to de-risk targets before assay development.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible dsRNA injection and immobilization, yielding quantifiable phenotypic endpoints.
- Analytics: Generates measurable outputs (e.g., pigment intensity, larval motility, cuticle hardness) that facilitate comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects gene function in T. marmoratus to conserved biological processes, supporting cross-species extrapolation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for functional genomics in non-model organisms, reducing reliance on established genetic systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers mechanistic clarity through stage-specific knockdown, reducing ambiguity in target biology and pathway involvement.
- Operational Value: Standardizes gene suppression workflows via agarose immobilization and microinjection, enhancing reproducibility across labs.
- Strategic Value: Improves target prioritization by linking gene suppression to observable phenotypes, increasing confidence in preclinical advancement.
- Portfolio Impact: Enables early de-risking of targets in understudied organisms, supporting expansion of target space and novel mechanism exploration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, embryo/larva handling, and dsRNA synthesis.
- Dependent on microinjection systems, agarose preparation tools, and stereo microscopy for precise delivery.
- Necessitates standardization of injection pressure, duration, and needle calibration across operators.
- Involves adaptation of immobilization protocols for different developmental stages and species.
- Limited by embryo survival rates and technical skill, requiring optimization for consistent knockdown efficiency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:37
Early stage T. marmoratus Embryo Preparation
1:58
Early Stage T. marmoratus Embryo Double Stranded RNA (dsRNA) Microinjection
5:04
T. marmoratus Larva Preparation
5:58
T. marmoratus Larva dsRNA Microinjection
7:05
Results: Representative Effects of RNA Interference in Aquatic Beetles at Different Developmental Time Points
8:18
Conclusion
