Name: ループ媒介等熱増幅を用いた灌漑水中フィ トフトーラカプシ の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学ぶ LAMP法と濾紙DNA抽出法を用いた灌漑水中のPhytophthora capsici遊走子の迅速検出法。現場での病原体分析が可能となり、植物病害管理の効率向上に貢献する。

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この作品は、ジョージア州野菜商品委員会プロジェクトID# FP00016659の財政支援を受けました。著者らは、ピシェン・ジ博士(ジョージア大学)とオハイオ州立大学アン・ドランス博士に感謝し、 フィトフトーラ・スップの純粋な文化を提供してくれた。また、研究を通じて彼らの技術的支援のために李王とデロリス・ヴェニーに感謝します。

1. ポータブルループ媒介等温増幅を用いた灌漑水からの フィトフトーラカプシチ のオンサイト検出
<ol><li>ポンプとフィルターの設定<ol>
<li>ハンドポンプに接続されたチューブにフィルターフラスコを取り付け、ポンプが作動したときに、濾過フラスコの口から空気が吸い込まれるようにします。</li>
		<li>Buchner漏斗をゴム栓にろ過フラスコの口に合わせ、適切なサイズのろ紙をBuchner漏斗に収め、空気が濾紙を通して引き抜くようにします。フィルター用紙の保持サイズは15 μmである必要があります。 注: フィルタペーパーは、フィルタペーパーの周りを最小限の水が流れるよう、Buchner漏斗の端に収まる必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>水のサンプリングとフィルタリング<ol>
<li>ターゲットソースから水サンプルを採取します。水は少量の破片を含むが、重要な堆積物や土壌を有しないかもしれない。</li>
		<li>Buchner漏斗の中に置かれたろ過紙の上に最大1,000 mL(1リットル)の試験水を注ぎ、ハンドポンプ(または真空)を使用して水を引き抜く吸引を作成します。 注:この方法でテストできる水の最小量はなく、少なくとも50 mLが推奨されていますが、この方法の最大値は1000 mLです。</li>
		<li>鉗子を使用して、Buchner漏斗からろ過用紙を取り出し、滅菌はさみで小さく切ります。プロトコルで必要な抽出バッファ(磁気ビーズベースの抽出用400 μL)の量に、1.5 mLチューブにできるだけ多くの部分(8-12)を追加します。最初のセットが抽出された後の処理のために、残りのフィルター用紙を保存します。</li>
		<li>渦またはそれ以外の場合は、5分間毎分10 sの濾紙および抽出バッファーの断片を攪拌する。次に、鉗子を使用して、抽出バッファーをできるだけ少なく失った濾紙を取り除く。すべての部分が渦/攪拌され、抽出バッファーに浸されるまで、フィルターペーパーの残りの部分でこのステップを繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>フィルターペーパーからのDNAの磁気ビーズベース抽出<ol>
<li>1.5 mLチューブ(現在は約200~300 μLの抽出バッファーを含む)に、20 μLのプロテイナーゼKと10 ng/μL RNaseの10 μLを加えます。</li>
		<li>室温で15分間インキュベートし、渦を振ったり、3分ごとにチューブを振ったりします。</li>
		<li>結合バッファーを含む 500 μL の磁気ビーズをサンプルに加え、振ることでよく混ぜます。その後、室温で5分間インキュベートします。</li>
		<li>すべてのビーズが磁石に引き込まれるまで、チューブを磁気分離器ラックに2分間置きます。上清を取り除き、捨てます。</li>
		<li>磁気セパレータからチューブを取り外します。500 μLのウォッシュバッファ1を加え、チューブを激しく振ってビーズを再中断します。30 s を待ってから、チューブを磁気セパレータに戻します。すべてのビーズが磁石に向かって引っ張られるまで2分待ってから、上清を取り出して捨てます。 注:磁気ビーズがセパレータに磁化するのを待つ場合は、チューブを反転させ、キャップとチューブの側面に貼り付けられた磁気ビーズを取り外し、より多くのビーズが取り付けられる可能性があります。</li>
		<li>500 μL のウォッシュバッファー 2 でステップ 1.3.5 を繰り返します。</li>
		<li>80%エタノールの500 μLでステップ1.3.5を繰り返します。</li>
		<li>蓋を開けた状態で、磁気ビーズペレットを室温(18~27°C)で15分間エアドライします。温度が許さない場合は、15分間キャップを開けた手袋をした手でインキュベートします。</li>
		<li>磁気セパレータからチューブを取り外します。溶出バッファーを 50 μL 追加し、1 分間上下にピペット処理してビーズを再中断します。</li>
		<li>チューブを磁気セパレータに戻します。DNA保存のためにビーズを邪魔することなく上清を移す前に2分待ちます。 注: ここでは、実験を一時停止してから次に進むことができます。抽出したDNAは氷の上または-20°Cの冷凍庫に保存する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>新開発ランプアッセイの適用<ol>
<li>各F3およびB3プライマーの0.2 μM、各ループFおよびループBプライマーの0.8 μM、および各FIPおよびBIPプライマーの1.6 μMを使用してLAMPプライマーミックスを準備する(表2)。</li>
		<li>次のLAMP溶液を1つのPCRチューブに加えるか、または8チューブストリップ内の各チューブに追加します:プライマーミックス2.5 μL(ステップ1.4.1)、LAVA LAMPマスターミックスの12.5 μL、抽出DNA1 μL、および9 μLのddH2O。総容積は25μLである。 注:ポータブル増幅器(例えば、Genie III)を色分け染め(例えば、ウォームスタート)と併用する場合は、セクション2.4.2- 2.4.3を参照してください。</li>
		<li>2 つのチューブを正と負のコントロールとして指定します。陽性コントロールには、LAVA LAMP キットによって提供されるコントロール、または既知の陽性 DNA サンプルのいずれかを使用します。負のコントロールには、ddH2O を使用します。両方とも、抽出したDNAの1μLを、陽性対照またはddH2Oの1μLに置き換える。</li>
		<li>サンプルをヒートブロック(またはポータブル増幅器)にセットし、64°Cに設定して45分間設定します。 注: 磁気ビードベースの抽出の代わりに、他の抽出方法を使用できます。CTABと市販のDNA抽出キットは、いずれも標準プロトコルを用いて試験に成功し、植物試料24,25,25の濾紙片を置換した。結果は、表2で比較した。DNAの濃度を定量化できる場合は、1〜10ngゲノムDNAを使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>結果の可視化<ol>
<li>実験室で行う場合、各サンプルの5μLを1%アガロースゲルにロードし、ゲル電気泳動機で動かし、UVイメージングマシンでイメージングすることで、増幅産物を見ます。</li>
		<li>色分け染め(ウォームスタートなど)を使用した場合は、色の変化を表示して結果を正または負の値にします。</li>
		<li>ポータブル増幅器(例えば、Genie III)を使用した場合、画面上の増幅グラフを見て結果を決定する。</li>
	</ol></li>
	<li>先に開発したPCRアッセイの適用 注: 従来の PCR アッセイを使用する場合、手順 1 ~ 3 は同じままであり、ステップ 1.4 および 1.5 の代わりに次の手順を適用する必要があります。<ol>
<li>各DNA抽出の1μLを、次の成分を含む個々のチューブに加える:12.5μLのグリーンPCRマスターミックス、9.5 μLのddH2O、および1μLの順方向および逆プライマー(表2))。</li>
		<li>マイクロ遠心分離機を使用して各サンプルをスピンダウンし、チューブをサーマルサイクラーに入れます。</li>
		<li>以前の出版物に従って以下のサーマルサイクラーの設定を使用してください:5分のための94°C、30のsのための94°Cで変性の30サイクル、30のsのための54°Cでの延長、1分のための72°Cで延長、そして10分のための72°Cで最終延長。</li>
		<li>1%アガロースゲルで製品を実行します。陽性反応が約508bpのバンドサイズを有するUV光下のバンドの存在を観察する。</li>
	</ol></li>
	<li>従来の検出方法 注:病原体の検出のための選択的なめっきの複数の方法があり、以下は P.カプシチのための一般的なプロトコルです。<ol>
<li>まず、健康なナス果実 (P.カプシチの感受性の宿主)を得て、70%イソプロピルアルコールで果実表面を洗浄して表面滅菌する。</li>
		<li>ナスの果実を浮遊装置(ポリエチレンフォームなど)を備えたミルククレートに入れ、灌漑池に展開します。各餌トラップを1点に固定し、少なくとも7日間、または果実腐敗症状が観察されるまで、水溜所(リサイクル灌漑水)にトラップを残します。果物を収集し、実験室に輸送します。</li>
		<li>滅菌フードで果物をすすいで乾燥させてから、感染した組織の小片を取り除き、25mg/Lペンタクロロベンゼン、0.0005%ピマリシン、250mg/Lアンピシリン、10mg/Lリファンピシン、50mg/Lハイメクサゾールで修正したPARPH培地のプレートに置きます。プレートを25°Cで5日間インキュベートします。</li>
		<li>分離後4日で従来の形態学的同定のための複合顕微鏡の下でプレートを見る。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 動物園の濃度の検出限界の決定
<ol><li>動物園のサスペンションを作る<ol>
<li>V8寒天(V8ジュース100mL、ddH2Oの900 mL、CaCO3の1g)プレートを26°Cで1週間インキュベートP.カプシチ。 複数のプレートを使用して、より多くの動物用懸濁液を得ることができます。</li>
		<li>胞子を刺激するために室温で連続光の下でプレートを3日間インキュベートします。</li>
		<li>各プレートに15mLのddH2Oを加えてプレートを浸水させ、4°Cの冷蔵庫に25分間入れます。その後、室温に戻して30分間おきます。</li>
		<li>すべてのプレートから1つの50 mLチューブに溶液を取り除くためにプレートを攪拌し、溶液をピペット。</li>
		<li>動物園の濃度の正確な推定値を得るために、胞子懸濁液の10 μLをヘモサイトメーターに加え、顕微鏡下で観察して動物園を数え、平均濃度を推定します。</li>
	</ol></li>
	<li>連続希釈<ol>
<li>胞毛懸濁液1mLとddH2O9mLを2別のチューブに加えます。必要に応じて 10 倍の希釈液に対してこの手順を繰り返します。</li>
		<li>その後、濾過法を用いて、以前のプロトコルに基づいてDNA抽出のために胞毛溶液を提出する。 注:サスペンションのボリュームが大きい場合は、2 mLの胞子懸濁液と18 mLのddH2Oのボリュームを2倍にします。</li>
	</ol></li>
	<li>動物園の集中限界の検出<ol>
<li>明らかに肯定的な結果が観察されなくなるまでアッセイを通して各シリアル希釈を個別に実行して、胞子検出限界を評価する。最終的な希釈が得られたら、2倍(この例では4.8〜2.4)で希釈し、より正確な検出限界を得るためにアッセイを再実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>LAMP法の開発と最適化 注:LAMPプライマーは、補助図2に示すように、P.カプシチ(Liらら19)の1121ベースペア(bp)断片に基づいて設計された。<ol>
<li>着色色素(例えば、ウォームスタート)を使用する場合は、プライマーミックス2.5μL、12.5μLの着色色素、0.5μLの緑色蛍光色素、1μLの抽出DNA、および8.5μLのddH2Oを使用してください。総容積は25μLである。</li>
		<li>LAVALAMPマスターミックスでポータブル増幅器を使用する場合、メーカーが推奨する3分間95°Cの初期工程を有するが、これは必須ではない。最終的なアニーリングステップは、色の変化や増幅グラフを観察するために必要とされません。市販の着色色素を使用する場合は、ウォームスタートステップを実行しないでください。</li>
		<li>LAMPアッセイの結果として、1%のアガロースゲルでサンプルを実行するか、Genie IIIリアルタイム増幅画面で裸眼または視視を行ったUVイメージングマシンを使用してサンプルを実行します。</li>
		<li>ポータブル増幅器を使用してLAMPアッセイの温度を最適化し、感度の速度とレベルをリアルタイムの増幅グラフを使用して分析します。サンプルを一意の温度で実行し、最高レベルの感度で最速の増幅を決定します。</li>
		<li>抽出したDNAの連続希釈(ステップ2.2.1の胞子懸濁液と同様)を行い、各希釈に対するLAMP反応に関して前述した反応条件を維持することにより、LAMPの開発アッセイの検出限界を決定します。</li>
	</ol></li>
	<li>検出限界判定と従来PCR法との比較<ol>
<li>セクション1.3のステップで抽出したDNAを使用して、従来のPCRの検出レベルとLAMPアッセイの検出レベルを比較します。</li>
		<li>1 μL の DNA を、順方向 PCR と逆 PCR プライマーの両方を含む PCR チューブに 1 μL を加えます (表 2)、グリーン PCR マスターミックスの 12.5 μL、ddH2O の 9.5 μL を合計 25 μL に追加します。</li>
		<li>サーマルサイクラーでサンプルを増幅するには、5分間94°C、30°Cで30サイクル、30sで54°Cでアニール、72°Cで1分間延長、最終延長は72°Cで10分間延長します。</li>
		<li>1%アガロースゲルで電気泳動機でサンプルを実行し、UVイメージングマシンで見ます。この除かれたバンドサイズは508bpであった。</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Aglietti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+loop-mediated+isothermal+amplification%3A+an+early-warning+tool+for+quarantine+plant+pathogen+detection%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection.</a> AMB Express. 9 (1), 50(2019).</li>
<li>Almasi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+the+visual+detection+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+melonis%5BTitle%5D)+AND+%22Horticultural+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis.</a> Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).</li>
<li>Gill, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+Pythium+from+irrigation+ponds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease+Reporter%22%5BJournal%5D)">Pathogenic Pythium from irrigation ponds.</a> Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).</li>
</ol>

著者は、開示するものや利益相反を何も持っていません。

植物病原体の灌漑水の試験は、灌漑池とリサイクル水27を使用して生産者にとって重要なステップです。灌漑池は、過剰な灌漑水が16、27存在している可能性のある病原体を運ぶ池にフィールドから向けられているように、植物病原体の数のための貯水池と27繁殖地を提供します。大きな水源における植物病原体の検出のための伝統的な方法は、池に懸濁した感受性の宿主組織(例えば、果実、葉)を用いて病原体の餌をセットし、感染が起こるのを待ち、その後、果実/葉を取り除き、顕微鏡法または分子法13,14,14で診断を確認することである。これらの方法は、検出テストの実行に必要な時間(2週間以上)、および必要な労働および機器のために制限されています。また、正確な結果を得るには、視覚診断、病原体形態、分類に関する豊富な経験と知識が必要です。PCR、qPCR、DNAハイブリダイゼーションなどの分子...

水の使用量の増加や水の使用に伴う環境問題により、農場や保育園の水のリサイクルがますます普及しています。植物病の広がりや発生を減らすために、生産者のために多くの灌漑方法が開発されています。水源(灌漑や降水量)に関係なく、流出が発生し、多くの野菜や保育園の生産者は、流出を収集し、リサイクルする池を持っています1.これは、再生水が作物2、3、43を灌漑するために使用される場合、病原体の広がりを支持2する可能性のある病原体蓄積のための貯水池を4作成します。動物園の胞子は水に蓄積し、一次分散胞子は自己運動性であるが、表面水55、6、76を必要とするので、Oomycete7植物病原体は、この練習の恩恵を特に受ける。フィトフトラカプシチは、異なる方法で、ナス類とキュビリット作物のかなりの数に影響を与えるオマイセテ病原体8.多くの場合、症状は苗、根とクラウンの腐敗の減衰です。しかし、キュウリ、スカッシュ、メロン、カボチャ、スイカ、ナス、コショウなどの作物では、果実腐敗9のために収穫全体が失われる可能性があります。この植物病原体を検出する方法は知られているが、ほとんどの感染は、任意の予防殺菌剤が有意な効果を有するには遅すぎる既に起こるために行われている10を必要とします。
標的微生物の検出と診断のための灌漑水をテストする従来の方法は、速度と感度が成功し、収益性の高い作物生産11、12,12に不可欠である時代遅れのアプローチです。標的病原体(例えば、P.カプシチのナス)に感染のために除去され、検査される前に長期間、灌漑池に吊り下げられる変性トラップに付着している植物組織(例えば、P.カプシチのナス)に付着している。次いで植物組織からのサンプルを半選択的培地(PARPH)上でめっきし、培養増殖のためにインキュベートし、次いで、複合顕微鏡13を用いて形態学的同定が行われる。他の植物病原体に対しても、選択的培地を用いて、少量の汚染水をめっきしてから、14,15,15をサブ培養する前に同様の検出方法がある。これらの方法は、2〜6週間の任意の場所、生物を分離するためのサブ培養のいくつかのラウンド、および各種の主要な形態学的文字を認識することができるようにフィトフトーラ診断上の経験を必要とする。これらの伝統的な方法は、水源にも存在する他の微生物による干渉などの要因により、P.カプシチによって汚染された灌漑水の検出にはうまく機能しません。ピシウム属細菌や水媒介細菌のような急速に成長している微生物は、P.カプシチを検出不能16、17,17にするプレート上で増殖する可能性があります。
本研究の目的は、灌漑水中のP.カプシチ動物園を検出するために、現場と実験室の両方の設定で使用できる敏感で特異的な分子法を開発することであった。このプロトコルは、P.カプシチの1121基対(bp)フラグメントに基づいて、P.カプシチを特異的に増幅することができる新規ループ媒介等温増幅(LAMP)プライマーセットの開発を含む、 P. capsici19.19Dong et al. (2015) から以前に開発された LAMP プライマーは、この研究のために開発されたアッセイと比較して使用されました20.
LAMPアッセイは、従来のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)21よりも迅速、感受性、および特異的であることが実証された比較的新しい分子検出形態である。一般に、従来のPCRアッセイでは500コピー(1.25 pg/μL)以下では検出できません。対照的に、以前の研究では、LAMPの感度は従来のPCRよりも10〜1,000倍高く、ゲノムDNA22,23,23の1fg/μLでも容易に検出できることが示されている。さらに、アッセイは、増幅のためのポータブル加熱ブロックと正のサンプルの色を変化させる着色色素(電気泳動の必要性を取り除く)を使用して、迅速に(多くの場合、30分)およびオンサイト(フィールド)を行うことができます。本研究では、フィルター抽出法を用いてPCRとLAMPアッセイの感度を比較した。提案された検出方法により、研究者および拡張剤は、異なる水源からのP.カプシシ胞子の存在を2時間以内に容易に検出することができる。このアッセイは、従来のPCRよりも感度が高く、栽培者が使用する灌漑水中の病原体の存在を検出することによってその時点で検証されました。この検出方法により、生産者は灌漑に使用されている様々な水源における病原体の存在と人口密度を推定し、壊滅的な発生や経済的損失を防ぐことができます。

<table><tbody><tr><td>アガロースゲル粉末</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>C997J85</td><td></td></tr><tr><td>ブフナー漏斗</td><td>サザンラボウェア</td><td>JBF003</td><td></td></tr><tr><td>ブレットブレンダー</td><td>ネクストアドバンス</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5430</td><td>エッペンドルフ</td><td>22620509</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>CTAB ソリューション</td><td>バイオサイエンス</td><td>786-565</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>フィルターフラスコ</td><td>ユナイテッド</td><td>FHFL1000</td><td></td></tr><tr><td>フィルターペーパー</td><td>ユナイテッドサイエンティフィックサプライ</td><td>ズFPR009</td><td></td></tr><tr><td>ゲルグリーン10000X</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>B003B68(1 / EA)</td><td></td></tr><tr><td>Genie III</td><td>OptiGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハンドポンプ</td><td>トーマスScientific</td><td>1163B06</td><td></td></tr><tr><td>Iso-amyl Alcohol</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1150-500</td><td></td></tr><tr><td>LAVA LAMP master mix</td><td>Lucigen</td><td>30086-1</td><td></td></tr><tr><td>磁気ビーズDNA抽出</td><td>Genesig</td><td>genesigEASY-EK</td><td></td></tr><tr><td>磁気セパレーター</td><td>Genesig</td><td>genesigEASY-MR</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PVP40-500G</td><td></td></tr><tr><td>プライマー</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism Mini Centrifuge</td><td></td><td>Labnet C1801</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>UV Gel Doc</td><td>Analytik Jena</td><td>849-00502-2</td><td></td></tr><tr><td>Warmstart Colorimetric Dye</td><td>Lucigen</td><td>E1800m</td><td></td></tr><tr><td>Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1704489EDU</td><td></td></tr><tr><td>70% イソプロパノール</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>A451-1</td><td></td></tr></tbody></table>

ループ媒介等熱増幅を用いた灌漑水中フィ トフトーラカプシ の検出

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

フィトフトラカプシーチ は、毎年野菜生産に大きな経済的損失を引き起こす多くの重要なソラ紀とcucurbit作物に影響を与える壊滅的な卵母菌病原体です。 フィトフトラカプチーは 土壌を媒介し、風化や劣化に抵抗する長命の生存構造(オースポアおよびクラミドスポア)による野菜畑の持続的な問題です。分散の主な方法は、表面や水で満たされた土壌の毛穴に存在する水の薄膜を泳ぐことができ、水たまりや池に蓄積することができる単細胞、フラグ付き胞子である動物園の胞子の生産を通じてです。したがって、灌漑池は、病原体の発生源であり、病気の発生の初期点となり得る。灌漑水中の P.カプシチ の検出は、 ピシウム sppなどの環境中に存在する他の微生物が通常P. カプシチ を検出不能にするため、伝統的な培養ベースの方法を使用して困難である。 P.カプシシ 胞子の水源(灌漑水、流出など)の存在を判断するために、病原体の胞子(zoospore)を捕捉し、後に新しいループ媒介等熱増幅(LAMP)を介して特異的な増幅法を通じて病原体のDNAを増幅するハンドポンプベースのろ紙(8-10 μm)法を開発しました 。 この方法は、従来のPCRの40倍の感度を持つ1.2 x 102 の動物園/mLの低濃度からDNAを増幅して検出することができます。密接に関連する種を試験する場合、クロス増幅は得られない。LAMPは、カラーメトリックLAMPマスターミックス染料を用いて行われ、現場での迅速な検出のために肉眼で読み取ることができる結果を表示しました。このプロトコルは、汚染された灌漑システムを介して存在、蓄積、または分散している他の病原体に適応することができる。

LAMP法の最適化 本研究では、ポータブルループ媒介等温増幅(LAMP)アッセイを用いて、灌漑水中の フィトフトーラカプシ の存在を検出した。まず、提案されたLAMPアッセイは、異なるLAMPプライマー濃度[F3、B3(それぞれ0.1〜0.5 μM)をテストすることによって最適化されました。LF、LB(各0.5~1.0 μM)およびFIP、BIP(0.8~2.4 μM)、持続時間(30~70分)、温度(55~70°C)この研究で使用された最終的なLAMPプライマーミックスは、各F3およびB3プライマーの0.2μM、各ループFおよびループBプライマーの0.8μM、各FIPおよびBIPプライマーの1.6μMであった。反応温度の最適化は、追加の陰性増幅なしで最も速い反応を行った温度を決定することによって、携帯用増幅器(例えば、Genie III)で行った。最適温度は64°Cであることが確認された(データは示さなかった)。64°Cでアッセイを実行するための最適な時間は45分で、検出に陽性であった最も低い濃度(1.2 x 102 の胞子/mL)は依然として40分増幅し...

フィルターペーパーDNA抽出法と、現場や研究室で分析できるループ媒介等熱増幅(LAMP)アッセイを用いて、水源中の フィトフトーラ・カプシチ 動物園の胞子を検出する方法を開発しました。

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

植物病原菌の検出は、植物疾患管理の重要なステップです。このプロトコルは、一般的な水媒介性戦闘機の病原体による灌漑水汚染の迅速な検出方法を提供します。この技術を用いて、フィトフトーラ・カプチチのような特定の病原体を、現場に残したまま大量の灌漑水から処理し、迅速に検出することができる。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の修士課程の学生であるオーウェン・ハドソンと、灌漑水中のフィトフトラカプチシ検出のポンプとフィルターを設置するPingxi G博士の研究室の博士研究員であるスミヤ・ワリウラです。ハンドポンプに接続されたチューブにフィルターフラスコを取り付け、フィルターフラスコの口の中のゴム栓にバフナー漏斗を取り付けます。次に、15ミクロンの保持サイズの適切なサイズのフィルターペーパーを漏斗に収めます。水サンプルを得るために、ターゲット源から灌漑水を収集します。水には少量の破片が含まれていることがありますが、重要な堆積物や土壌はありません。ハンドポンプを使用して漏斗を通して水を引き出すために吸引を作成しながら、漏斗内の濾紙の上に試験水の50〜1000ミリリットルの間でゆっくりと注ぎます。すべての水がろ過されたら、漏斗から濾紙を取り除くために鉗子を使用する。そして、小さく紙をカットするために滅菌はさみを使用してください。1.5ミリリットルチューブに8~12枚の紙を1.5ミリリットルチューブに浸し、室温で5分間インキュベーションします。渦またはそれ以外の場合は、毎分1回10秒間紙を攪拌します。インキュベーションの最後に、鉗子を使用して、できるだけ少ないバッファーで紙を取り除きます。そして、次のフィルター用紙の一部でライセンスを繰り返します。フィルターペーパーサンプルからのDNA抽出のために、20マイクロリットルのプロテイナーゼKと1マイクロリットル10ナノグラムの10マイクロリットルをサンプルに加え、3分ごとに渦または揺れで15分間室温で溶液をインキュベートした。インキュベーションの終わりに、結合バッファーに500マイクロリットルの磁気ビーズをサンプルに加え、振ることによってよく混ぜます。室温で5分後、上清を取り外して捨てる前に、チューブと磁気セパレータラックを2分間置きます。磁性分離器からチューブを取り外し、500マイクロリットルの洗浄バッファーにビーズを激しく再懸濁します。30秒後にチューブを磁石に戻し、上清を捨てる前に2分間待ちます。ちょうど実証したように、洗浄バッファーの500マイクロリットルと80%エタノールの500マイクロリットルで洗浄を繰り返します。そして、空気は室温で15分間磁気ビーズペレットを駆動します。インキュベーションの終わりに、上清の収集を可能にするために2分間磁石にチューブを戻す前に、1分間ピペット処理で50マイクロリットルの溶出バッファーでビーズを再中断します。表に示されているようにLAMPプライマーミックスを準備した後、2.5マイクロリットルのプライマーミックスの12.5マイクロリットルの溶岩LAMPマスターミックスで、抽出されたDNAの1マイクロリットルと2マイクロ蒸留水9マイクロリットルをPCRチューブに加え、1つの正と1つの陰性対照を設定します。64°Cの熱ブログですべてのサンプルを45分間、またはインキュベーション終了時に魔神3増幅器にインキュベートし、各増幅サンプルの5マイクロリットルを1%アガロースゲルに負荷し、得られたバンドを紫外線イメージングマシンで画像化します。熱量染料を使用した場合は、色の変化を表示して結果を正または負の値で判断します。ポータブル増幅器を使用した場合は、画面に増幅グラフを表示して結果を確認します。LAMPアッセイを64度で実行する光学時間は45分であり、検出に陽性であった最も低い濃度は40分まで増幅されず、20分でより高い濃度が増幅される。増幅は、核酸染色で標識された1%アガロースゲルで確認することができる。従来のPCRはLAMPに比べて40倍低感度に図示されている。最も低いミリリットル濃度当たり第3の動物園の胞子に4.8回10回検出する。この分析では、ジョージア州ティフト郡の商業野菜生産に使用される7つの池から水サンプルを採取した。そのうちの3つは正のLAMP結果を示した。しかし、サンプルが従来のPCRで試験されたとき、3つの陽性サンプルのうちの1つだけでZoosporeが検出された。この表では、感度、時間、必要な準備、材料、コストなどの変数を用いた検出方法の違いについてまとめたものです。LAMPは、試験された方法の中で最も安価な方法であり、また最速であり、従来のPCR増幅と比較して増幅のために30〜60分しか必要としなくてはないほどです。このプロトコルを使用して、密接に関連するUMI種子病原体から抽出されたDNAは、どのサンプルも検出しなくず、プライマーの特異性を確認する。サンプル水を速く注ぎすぎないようにし、抽出したDNAをLAMPチューブに添加して汚染を制限する際には注意してください。他の水媒介病原体が特定のプライマーセットを開発したら、ろ過およびランプ酸法を他の病原体に適合させることができる。

detection-phytophthora-capsici-irrigation-water-using-loop-mediated

Research

JoVE Journal

Environment

環境

出典: Domesle, K. J. ほか。ループ媒介の等温増幅による動物性食品中の サルモネラ のスクリーニングおよび培養分離による サルモネラ の確認。 J. Vis.

細菌遺伝子検出のためのループ媒介等温増幅

ライブの検出<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt; O157：PMA-qPCRによりH7細胞

大量の農業用水に含まれる食品媒介病原体の統合濃度、濃縮、エンドポイント比色検出を含むプロトコルがここに提示されています。...

比色検出の紙ベース<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;<em&gt;サルモネラ</em&gt;属、および<em&gt;リステリア菌</em&gt;農業大量の水から

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の種特異的検出のためのLAMP法（LAMP）アッセイ<em&gt;アイメリア</em&gt;鶏に感染する

植物病原体敷地内、特に土壌媒介病原菌の迅速かつ正確な検出は、さらに菌の生産やフィールドで植物の病気の拡散を防ぐために重要です。ここ携帯用リアルタイム PCR...

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従来のRT-PCR技術と比較して比較的短時間で簡単な機器を使用したティラピア魚のTiLV検出用RT-LAMPアッセイを発表します。このプロトコルは、特に発展途上国において、TiLVDの流行の広がりを制御するのに役立つ可能性がある。...

チラピア湖ウイルスの特異的かつ迅速な検出のための逆転写ループ媒介等熱増幅(RT-LAMP)アッセイ

ループ媒介等温増幅(LAMP)は、病原体検出分野に広く関心を集めている等温核酸増幅試験(iNAAT)です。ここでは、動物性食品中のサルモネラ菌をスクリーニングし、培養分離から推定サルモネラ菌を確認するための迅速で信頼性の高い、堅牢な方法として、マルチラボ検証されたサルモネラLAMPプロトコルを提示します。...

動物性食品中の サルモネラ菌 をスクリーニングし、培養分離から サルモネラ菌 を確認するためのループ媒介等温増幅

黒胡椒植物の基礎頭をピンチすることは、それを傷つけるための短くて時間を節約する方法です。ここでは、黒胡椒植物に感染するためのビデオで詳細な手順を提供しました。...

黒胡椒植物の フィトフトラ・カプシチ の効果的な接種方法

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連続フローPCRマイクロ流体チップにおける大 腸菌 の増幅とキャピラリー電気泳動システムによる検出

さまざまな細菌性病原体は、正確に検出され、迅速に治療されない場合、気道感染症を引き起こし、深刻な健康問題を引き起こす可能性があります。ループを介した等温増幅...

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

このプロトコルでは、外来植物病原体 Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4の検出のために、組み合わされたリコンビナーゼポリメラーゼ増幅CRISPR/Cas12aアッセイが示されている。...

Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4 検出のための複合リコンビナーゼポリメラーゼ増幅 CRISPR/Cas12a アッセイ

学ぶ LAMP法と濾紙DNA抽出法を用いた灌漑水中のPhytophthora capsici遊走子の迅速検出法。現場での病原体分析が可能となり、植物病害管理の効率向上に貢献する。

ループ媒介等熱増幅を用いた灌漑水中フィトフトーラカプシの検出

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